Модифицированные грамположительные бактерии и их применение

Модифицированные грамположительные бактерии и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится данное изобретение

Настоящее изобретение относится к микроорганизмам, например к грамположительным бактериям, с повышенной стрессоустойчивостью и улучшенными показателями, характеризующими их получение, обработку и хранение. В частности, данное изобретение относится к генетически модифицированным микроорганизмам, накапливающим внутри клетки трегалозу. Данное изобретение относится также к применению этих микроорганизмов в производстве пищевых продуктов и в медицине.

Уровень техники

Группа грамположительных бактерий характеризуется наличием одной плазматической мембраной, представляющей собой липидный бислой. К грамположительным относится множество родов палочковидных и сферических бактерий, в числе которых бифидобактерии и группа родов, вместе называемых молочнокислыми бактериями (LAB). Молочнокислые бактерии включают монофилетическую группу грамположительных, кислотоустойчивых, с низким содержанием GC-nap в ДНК, как правило, не образующих споры, микоаэрофильных палочек или кокков, которые имеют общие метаболические и физиологические особенности. Эти бактерии, обычно присутствующие в разлагающихся растениях и скисающих молочных продуктах, производят молочную кислоту, являющуюся конечным продуктом ферментативного превращения углеводов. Исторически это их свойство связало молочнокислые бактерии с ферментацией пищевых продуктов, поскольку закисление подавляет рост агентов, обусловливающих порчу пищи. Типичные молочнокислые бактерии Lactococcus lactis - это мезофильные, микроаэрофильные ферментирующие молочнокислые бактерии. В Т0 время как эти бактерии широко используются для ферментации пищевых продуктов, особенно при производстве молочной продукции, все больший интерес вызывают возможности их применения в лекарственных средствах и нутрицевтиках, в качестве средств для лечения инфекций в полостях тела, например вагинальных инфекций, или в качестве носителей для доставки биологически активных веществ. Во всех этих случаях требуются высоко жизнеспособные стартовые культуры либо фармацевтические или нутрицевтические композиции с высоким содержанием жизнеспособных бактерий. Однако L.lactis свойственно терять жизнеспособность в процессе хранения или в ходе обработки (например, при производстве сухого порошкового препарата, формовании таблеток и др.). Падение жизнеспособности еще более выражено, когда бактерий после лиофилизации подвергают такому дополнительному стрессу, как высокая кислотность среды или присутствие желчных солей.

Предлагалось несколько способов преодолеть эту проблему. Особенно интересно использование трегалозы. Трегалоза (α-D-глюкопиранозил-1,1-α-D-глюкопиранозид) - это не восстанавливающий дисахарид, который присутствует у множества различных организмов от бактерий до беспозвоночных. Трегалоза, иногда в сочетании с декстраном, часто используется в качестве добавляемого извне криоконсерванта. Экзогенная трегалоза действует как сахаридный матрикс (Conrad et al., 2000), проявляя свой защитный эффект особенно в процессе лиофилизации (замораживания-высушивания), когда она играет роль стеклообразующего агента. Кроме того, известно, что трегалоза - стрессовый метаболит; ее интенсивно изучали у грибов, в частности у Saccharomyces cerevisiae. Действительно, высокие концентрации трегалозы внутри клетки улучшают способность к хранению, в результате повышая жизнеспособность после криоконсервации. Однако важно подчеркнуть, что добавление трегалозы извне редко ведет к накоплению внутри микробных клеток - потому ли, что она не поглощается, или потому, что, попав в клетку, быстро метаболизируется.

Сообщалось (Termont et al., Appl Environ Microbiol 72:7694; 2006), что новосинтезированная трегалоза - при обусловленной плазмидой усиленной экспрессии генов otsA, кодирующего трегалозо-6-фосфат-синтазу, или otsB, кодирующего трегалозо-6 фосфат-фосфатазу, - накапливается внутри клеток L.lactis. Именно внутриклеточное накопление трегалозы, а не добавление ее извне защищает L.lactis от лизиса под действием компонентов желчи и гибели клеток из-за лиофилизации. Поскольку L.lactis необычайно чувствительны, защиту от лизиса желчью можно использовать как функциональный критерий внутриклеточного накопления трегалозы.

В работе Andersson et al. (J Biol Chem 276:42707; 2001) описывается новый путь утилизации трегалозы у L.lactis. Этот метаболический путь включает активность трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (trePP), которая превращает трегалозо-6-фосфат в β-глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат.Описывается также инсерционная инактивация этого фермента у L.lactis, в результате которой утрачивается способность бактериальной культуры к росту на трегалозе.

Для внутриклеточного накопления трегалозы в работе Carvalho et al. (Appl Environ Microbiol 77:4189; 2011) описывается способ, в котором используется плазмида, обеспечивающая усиленную экспрессию трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы и β фосфоглюкомутазы (pgmB) у L.lactis. Как отмечают эти авторы, поскольку у этих бактерий нет трегалозо-6-фосфат-фосфатазы, для обеспечения нужной активности использовали соответствующий ген otsB из пригодного для пищевого применения микроорганизма P. freudenreichii. Полученные в результате клетки проявляли повышенную устойчивость к холодовому шоку, тепловому шоку и кислой среде. Правда, в указанной работе отмечается, что по меньшей мере 67% продуцированной трегалозы обнаруживалось в культуральной среде. Следовательно, продуцированная трегалоза, по-видимому, не удерживается в достаточной степени или не накапливается внутри клетки.

Хотя эти процессы, несомненно, ведут к улучшению способности бактериальных клеток к хранению, остается настоятельная потребность в способах, которые могли бы улучшить способность к хранению у таких грамположительных бактерий, как молочнокислые бактерии и бифидобактерии - не только в тех случаях, когда эти бактерии используются для доставки биологически активных соединений в рамках медицинского применения, но также при их использовании в пищевой промышленности, например при производстве молочных продуктов.

В работе Lowes et al. 2006 (Oral Microbiol Immunol. 21(1): 21-7) описываются некоторые мутанты бактерий Streptococcus mutans, а именно мутанты по компоненту ПС фосфотрансферазной (PTS) системы, обозначенные PtcC. Бактерии S. mutans являются патогенными агентами, вызывающими зубной кариес, и авторы указанной работы изучают вариабельность генома S. mutans с точки зрения их патогенности. Утилизация углеводов β-глюкозидов может играть роль в патогенности и жизнеспособности S. mutans, и с этой точки зрения исследуются мутации PtcC. Авторы указанной работы не высказывали никаких предположений ни о роли PtcC во внутриклеточном накоплении трегалозы, ни о повышении стрессоустойчивости бактерий. Собственно, эти авторы изучают метаболизм β-глюкозидов, тогда как трегалоза является α-глюкозидом; мутанты PtcC непатогенных бактерий или какое бы Т0 ни было их использование ими не рассматриваются.

Раскрытие изобретения

Внутриклеточная трегалоза может защитить такие микроорганизмы, как молочнокислые бактерии, например Lactococcus lactis, от различных вредоносных агентов или неблагоприятных условий. Примерами таких факторов могут служить лизис под действием желчных кислот, который живые молочнокислые бактерии претерпевают в ходе перемещения по кишечнику, или стресс от воздействия отрицательной температуры и/или обезвоживания в ходе замораживания, высушивания, сушки распылением, лиофилизации, применяемых для консервирования молочнокислых бактерий.

Для того чтобы обеспечить накопление трегалозы внутри бактериальных клеток, возможно реализовать лишь немногочисленный ряд подходов. В частности, используются плазмиды для усиленной экспрессии гомологичных или гетерологичных генов. Однако для применения при производстве фармацевтических или пищевых продуктов этот подход нежелателен.

В настоящем документе сообщается о новом подходе, который позволяет добиться внутриклеточного накопления трегалозы; он базируется на отсутствии активности специфичного к целлобиозе компонента ПС фосфотрансферазной системы (PtcC) у грамположительных бактерий, предпочтительно путем частичных или полных делеции, повреждения или инактивации гена, кодирующего эндогенный PtcC, так что утрачивается способность к образованию функционального продукта гена ptcC. Авторы данного изобретения обнаружили, что накопленная трегалоза со временем в некоторой степени покидает клетку через какой-то неизвестный и не идентифицированный механизм экспорта трегалозы и определяется в супернатанте. Обнаружено также, что, как ни странно, инактивация ptcC препятствует выходу трегалозы из клетки. Эти факты тем более неожиданны, что до сих пор не было данных, указывающих на связь PtcC с транспортом трегалозы, и не предполагалось, что он участвует в экспорте трегалозы, тем самым обусловливая ее выход из клетки и высвобождение в окружающую среду. Удивительно также, что известные и охарактеризованные системы транспорта трегалозы, по-видимому, не участвуют в этом высвобождении трегалозы.

В одном из своих аспектов данное изобретение относится к грамположительным бактериям, в частности к непатогенным грамположительным бактериям, предпочтительно - к молочнокислым бактериям или бифидобактериям, лишенным активности специфичного к целлобиозе компонента ПС фосфотрансферазной системы (PtcC).

В другом аспекте данного изобретения предлагаются грамположительные бактерии, в частности непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно -молочнокислые бактерии или бифидобактерии, лишенные активности PtcC, для применения в качестве лекарственного средства. Такие лекарственные средства могут, например, включать фармацевтические композиции, нутрицевтики, лечебные пищевые продукты или функциональные пищевые продукты, или пробиотики.

В другом аспекте данного изобретения предлагаются лекарственное средство, стартовая культура, пробиотическая композиция или пищевая добавка, в частности нелекарственная пробиотическая композиция или пищевая добавка, содержащие грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC. Такая пищевая добавка может быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) стартовой культурой, предпочтительно стартовой культурой для получения пищевого продукта. Соответственно, в близком к этому аспекте данного изобретения предлагается стартовая культура, предпочтительно стартовая культура для получения пищевого продукта, содержащая грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC.

В другом аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в качестве лекарственного средства, стартовой культуры, пробиотика и/или пищевой добавки, в частности в качестве нелекарственной стартовой культуры, пробиотика или пищевой добавки. Такая пищевая добавка может быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) стартовой культурой для получения пищевого продукта. Соответственно, в близком к этому аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно -молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в качестве стартовой культуры для получения пищевого продукта, в частности когда этот пищевой продукт является не лечебным пищевым продуктом.

В одном из аспектов данного изобретения предлагается способ получения пищевого продукта, включающий смешивание грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, или указанной пищевой добавки, или указанной стартовой культуры с субстратом, который может подвергнуться ферментации под действием грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В конкретных воплощениях данного изобретения такой способ может также включать этап ферментации указанного субстрата. Также предлагается пищевой продукт, получаемый любым таким способом. Пищевой продукт может содержать пробиотики (без ограничений).

В другом аспекте данного изобретения предлагается способ получения лекарственного средства, например фармацевтической композиции, нутрицевтика, лечебного пищевого продукта или функционального пищевого продукт, или пробиотика, или получения пробиотической композиции или пищевой добавки, в частности нелекарственной пробиотической композиции или пищевой добавки, или получения стартовой культуры, предпочтительно стартовой культуры для получения пищевого продукта, включающий этапы: i) размножения грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в среде, содержащей субстрат, который может подвергнуться ферментации под действием указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, и ii) включение размноженных таким образом грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно -молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в состав, соответственно, лекарственного средства или пробиотической композиции, или пищевой добавки или стартовой культуры. В объем данного изобретения входит, следовательно, применение грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, для получения лекарственного средства, например фармацевтической композиции или нутрицевтика, лечебного пищевого продукта или функционального пищевого продукта, или пробиотика, или для получения пробиотической композиции или пищевой добавки, в частности нелекарственной пробиотической композиции или пищевой добавки, или для получения стартовой культуры, предпочтительно стартовой культуры для получения пищевого продукта.

Авторы данного изобретения обнаружили, что грамположительные бактерии, в частности непатогенные грамположительные бактерии, например молочнокислые бактерии и бифидобактерий, описанные в настоящем документе, не только способны к внутриклеточному накоплению трегалозы - даже независимо от источника углерода, но также обладают значительно повышенной устойчивостью к различным условиям, связанным с хранением и стрессом. Например, эти грамположительные бактерии более устойчивы к связанным с хранением манипуляциям, например с высушиванием, замораживанием, сушкой распылением или лиофилизацией. Грамположительные бактерии по данному изобретению также гораздо лучше выживают - независимо от состояния питания или голодания - в желудочно-кишечном тракте, проявляя повышенную устойчивость к кислой среде и лизису под действием желчных кислот. Активность и показатели грамположительных бактерий, описанных в настоящем документе, более воспроизводимы - будь Т0 в лекарственном качестве или в пищевой промышленности, чем известно по данным более ранних исследований. Следовательно, грамположительные бактерии, воплощающие принцип данного изобретения, предполагают возможность более жестких условий окружающей среды, а также биологическую устойчивость.

В одном из своих аспектов данное изобретение относится также к способу внутриклеточного накопления трегалозы у грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, включающий размножение грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, предпочтительно путем частичной или полной делеции, разрушения или инактивации гена, кодирующего эндогенный PtcC, так что утрачивается способность к образованию функционального продукта гена ptcC, в среде, содержащей субстрат, который может подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями.

В другом своем аспекте данное изобретение относится к способу повышения стрессоустойчивости или улучшения тех свойств грамположительных бактерий (в частности, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий), которые имеют отношение к производству, обработке и/или хранению, включающий модификацию этих грамположительных бактерий (в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий), например лишение активности PtcC. Предпочтительно, стрессоустойчивость или те свойства, которые имеют отношение к производству, обработке и/или хранению, могут быть одним или более свойств, выбираемых из группы, включающей устойчивость к кислой среде, устойчивость к солям желчных кислот, устойчивость к нагреванию, устойчивость к соли, устойчивость к высушиванию, замораживанию, сушке распылением или лиофилизации, осмотическую устойчивость.

Предпочтительно у упомянутых выше грамположительных бактерий, в частности, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, без активности PtcC, ген, кодирующий эндогенный PtcC, частично или полностью делетирован, разрушен или инактивирован, так что отсутствует способность к образованию функционального продукт гена ptcC. Следует отметить, что такая делеция, повреждение или инактивация могут быть нацелены, например, на кодирующую последовательность гена ptcC и/или на промотор, с которого экспрессируется ptcC.

В предпочтительных воплощениях данного изобретения у описанных в настоящем документе или используемых в изобретении грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, включающий размножение грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, может отсутствовать активность трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (TrePP). Предпочтительно у таких грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, также не имеющих трегалозо-6-фосфат-фосфорилазной активности, ген, кодирующий эндогенную трегалозо-6-фосфат-фосфорилазу, частично или полностью делегирован, разрушен или инактивирован, так что отсутствует способность к образованию функционального продукта гена trePP. Следует отметить, что такая делеция, повреждение или инактивация могут быть нацелены, например, на кодирующую последовательность гена trePP и/или на промотор, с которого экспрессируется ген trePP. Авторы данного изобретения обнаружили, что, как ни удивительно, эти грамположительные бактерии, в частности непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии и бифидобактерий, не имеющие трегалозо-6-фосфат-фосфорилазной активности, накапливают трегалозу внутри клетки. В противоположность описанному в настоящем документе подходу в более ранних работах (WO 2006/018446) для того, предлагается обеспечить экспрессию гетерологичной трегалозо-6-фосфат-фосфатазы, например кодируемой геном otsB. Более того, в упомянутой выше работе Carvalho et al. (2011) утверждается, что для внутриклеточного накопления трегалозы нужна усиленная экспрессия трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы. Хотя такие молочнокислые бактерии, как Lactococcus lactis, могут утилизовать трегалозу, до сих пор не было описано штамма Lactococcus lactis, синтезирующего трегалозу. Не идентифицировано эндогенных генов трегалозо-6-фосафт-синтазы и трегалозо-6-фосфат-фосфаьтазы, которые считались необходимыми для образования трегалозы начиная с глюкозо-6-фосфата, имеющегося L.lactis.

В предпочтительных воплощениях данного изобретения у описанных в настоящем документе или используемых в изобретении грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий без активности PtcC может иметь место сверхэкспрессия одного или более генов, обеспечивающих транспорт трегалозы, предпочтительно эндогенных, например одного или более генов фосфотрансферазной системы, входящих в трегалозный оперон. Авторы данного изобретения обнаружили, что такая сверхэкспрессия - в противоположность естественной экспрессии, индуцированной трегалозой, еще более усиливает способность грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, накапливать и/или удерживать внутри клеток трегалозу.

В предпочтительных воплощениях данного изобретения у используемых в них грамположительных бактерий, в частности у непатогенньгх грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий без активности PtcC может содержаться функциональная гетерологичная трегалозо-6-фосфат-фосфатаза. Как выяснили авторы данного изобретения, экспрессия гетерологичной трегалозо-6-фосфат-фосфатазы усиливает накопление трегалозы. В предпочтительных воплощениях данного изобретения трегалозо-6-фосфат-фосфатаза является продуктом гена otsB, предпочтительно otsB из E.coli.

Итак, в некоторых воплощениях данного изобретения описанные в настоящем документе или используемые в изобретении грамположительные бактерии, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, без активности PtcC, могут дополнительно проявлять какое-либо одно, какие-либо два или три из следующих свойств: а) эти грамположительные бактерии содержат функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-фосфатазу; (и) у этих грамположительных бактерий отсутствует активность TrePP; (с) у этих грамположительных бактерий происходит сверхэкспрессия одного или более генов, обеспечивающих транспорт трегалозы. В предпочтительных воплощениях данного изобретения грамположительные бактерии без активности PtcC могут также проявлять свойство (b) или, более предпочтительно, могут дополнительно обладать свойствами (а) и (b), или еще более предпочтительно, проявлять также свойства (b) и (с), или, особенно предпочтительно, проявлять свойства также (а), (b) и (с).

В предпочтительных воплощениях данного изобретения описанные в настоящем документе или используемые в изобретении грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, могут дополнительно содержать один или более гетерологичных генных продуктов. В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения, особенно в тех, в которых описанные грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, предназначены для медицинского применения, такие генные продукты могут быть профилактическим или терапевтическими генными продуктами или антигенами.

В некоторых воплощениях данного изобретения описанные в настоящем документе или используемые в изобретении грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, или лекарственное средство, или пищевая добавка, или стартовая культура, или пробиотическая композиция могут быть высушенными, высушенными распылением, замороженными или лиофилизованными. Соответственно, в некоторых воплощениях данного изобретения любые из упомянутых выше способов для получения лекарственного средства или пищевой добавки, или стартовой культуры, или пробиотической композиции или для накопления трегалозы в клетках грамположительных бактерий, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий или для повышения стрессоустойчивости или свойств, существенных для производства, обработки и/или хранения грамположительных бактерий, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, могут включать также высушивание, сушку распылением, замораживание или лиофилизацию грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лекарственного средства, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры.

В некоторых воплощениях упомянутого выше способа для получения лекарственного средства или пищевой добавки, или стартовой культуры, или в некоторых воплощениях упомянутого выше способа - для накопления трегалозы в клетках грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, культуральная среда может содержать мальтозу или глюкозу, или комбинацию мальтозы и глюкозы в качестве источника углерода - предпочтительно, в качестве основного или даже единственного источника углерода. В некоторых воплощениях данного способа указанная культуральная среда практически не содержит добавляемой извне (экзогенной) трегалозы. Авторы данного изобретения обнаружили, что описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, приобретают способность утилизовать такие источники углерода, как мальтоза или глюкоза, чтобы накапливать трегалозу внутри клетки. Соответственно, грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, по данному изобретению можно выращивать предпочтительно на, например, мальтозе в качестве единственного источника углерода, которая дешевле трегалозы, но они будут накапливать внутри клетки трегалозу. Тем не менее, следует отметить, что в некоторых воплощениях данного изобретения культуральная среда может содержать добавляемую извне (экзогенную) трегалозу.

В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, могут быть, как подразумевается настоящим описанием, молочнокислыми бактериями, более предпочтительно представителями Lactococcus sp. или Lactobacillus sp.

В некоторых других предпочтительных воплощениях данного изобретения грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, могут быть, как подразумевается настоящим описанием, представителями Bifidobacterium sp.

Упомянутые выше и далее аспекты и предпочтительные воплощения данного изобретения описываются в нижеследующих разделах и в прилагаемой формуле изобретения. Объект данного изобретения согласно прилагаемой формуле изобретения включается таким образом в настоящее описание.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Накопление трегалозы внутри клетки возможно после инактивации trePP, после экспрессии otsB или сочетания того и другого.

Фиг. 2. Накопление экзогенной трегалозы в клетках L.lactis обеспечивает им защиту от лизиса под действием желчи: (А) - выживание; (В) содержание трегалозы.

Фиг. 3. Накопление и стабильность внутриклеточной трегалозы: (А) - выход трегалозы из клеток во времени; (В) - возрастание концентрации трегалозы в культуральном супернатанте.

Фиг. 4. Накопление и высвобождение трегалозы у различных штаммов, представленных в таблице 2. Бактерии находились в присутствии 100 мМ (А) или 500 мМ (В) трегалозы.

Фиг. 5. Инактивация ptcC предотвращает (в солевой среде М9; А) или задерживает (в 0,5%-ной желчи; В) высвобождение внутриклеточной трегалозы.

Фиг. 6. Накопление экзогенной трегалозы в клетках L.lactis обеспечивает им защиту от лизиса под действием желчи. (А) - высвобождение внутриклеточной трегалозы во времени; (В) - выживание в 0,5%-ной желчи во времени.

Фиг. 7. Штаммы без активности трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (trePP КО) - как дикого типа по ptcC, так и ptcC КО - способны превращать глюкозу или мальтозу во внутриклеточную трегалозу.

Фиг. 8 Повышенное выживание бактерий в процессе прохождения кишечника свиньи как натощак (А; животные без пищи в течение 24 часов), так и при потреблении корма без ограничений (В).

Фиг. 9. Накопление трегалозы после образования биомассы.

Фиг. 10. Мальтоза способствует внутриклеточному накоплению трегалозы.

Фиг. 11. Превращение мальтозы во внутриклеточную трегалозу в процессе или после образования биомассы.

Осуществление изобретения

В данном документе слова, употребляемые в единственном числе, также включают и множественное число, если из контекста не следует с очевидностью иное.

Выражения ʺсодержащийʺ, ʺсодержитʺ в настоящем документе употребляются как синонимы выражениям ʺвключающийʺ, ʺвключаетʺ и подразумевают открытое множество, не исключая дополнительных, не упомянутых здесь членов, элементов или этапов способа. Следует учесть, что в настоящем документе выражения ʺсодержащийʺ, ʺсодержитʺ, ʺвключающийʺ, ʺвключаетʺ включают понятие ʺсостоящий изʺ/ʺсостоит изʺ, а также ʺв основном состоит изʺ, ʺсостоящий в основном изʺ.

Когда численные диапазоны обозначаются конечными точками, это означает, что подразумеваются все численные значения и части внутри данного диапазона, равно как и указанные конечные точки.

Выражения ʺоколоʺ и ʺприблизительноʺ в настоящем документе, относящиеся к измеримым величинам (какому-либо показателю, количеству, промежутку времени и проч.) означают, что включаются отклонения +/-20% или менее, предпочтительно +/-10% или менее, более предпочтительно +1-5% или менее, еще более предпочтительно +/-1% или менее от указанного значения, постольку, поскольку такие отклонения допустимы в данном изобретении. Следует учесть, что Т0 значение, при котором стоят слова ʺоколоʺ или ʺприблизительноʺ, является само по себе определенным и предпочтительным в данном описании. Выражения ʺодин или болееʺ или ʺпо меньшей мере одинʺ, например один или более или по меньшей мере один член (члены) какой-либо группы членов, ясны сами по себе в контексте конкретных примеров, однако эти выражения охватывают помимо прочего любой из указанных членов, или любые два или более из указанных членов, например любые ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 или ≥7 и т. д. из указанных членов вплоть до всего числа указанных членов.

Все цитируемые в настоящем описании источники полностью включаются в данный документ путем отсылки.

Все используемые в описании данного изобретения термины, включая технические и научные термины, употребляются в настоящем документе в значениях, известных рядовому специалисту в данной области техники. Далее для лучшего понимания идеи данного изобретения в настоящий документ включены определения терминов.

Ниже различные аспекты данного изобретения описываются более подробно. Каждый из описанных таким образом аспектов можно сочетать с любым другим аспектом или аспектами данного изобретения, если явно не указано противоположного. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или дающий преимущество, можно сочетать с любым другим признаком (признаками), указанными как предпочтительные или дающие преимущество.

В настоящем описании ссылки на ʺодно из воплощений данного изобретенияʺ или на ʺвоплощение данного изобретенияʺ означают, что какой-либо конкретный признак, структура или отличительная особенность, описанные в связи с данным воплощением, включается в по меньшей мере одно воплощение данного изобретения. Таким образом, выражения ʺв одном из воплощений данного изобретенияʺ или ʺв одном воплощении данного изобретенияʺ, в разных местах настоящего описания, могут относиться к одному и тому же воплощению, но не обязательно. Кроме того, конкретные признаки, структуры или отличительные особенности могут сочетаться любым подходящим образом в одном или более воплощений данного изобретения, что для специалиста в данной области техники должно быть ясно из настоящего описания. Также, в Т0 время как некоторые из описанных в настоящем документе воплощений данного изобретения включают одни признаки, содержащиеся в других воплощениях но не включают другие из этих признаков, подразумевается, что сочетания признаков из различных воплощений данного изобретения входят в объем изобретения, составляют различные его воплощения, что должно быть ясно специалисту в данной области техники. Например, любые из заявленных в прилагаемой формуле изобретения воплощений данного изобретения могут использоваться в любом сочетании.

В нижеследующем описании осуществления данного изобретения, имеются ссылки на прилагаемые иллюстрации, образующие часть настоящего документа, в которых только графическим путем представлены конкретные воплощения данного изобретения, в форме которых оно может быть осуществлено на практике. Следует учесть, что можно использовать и другие воплощения данного изобретения и что возможны структурные или логические изменения, не означающие отход от объема данного изобретения. Нижеследующее описание осуществления данного изобретения не следует понимать как ограничивающее его объем, который определяется прилагаемой формулой изобретения.

Стандартные литературные источники, в которых излагаются основные принципы технологии рекомбинантной ДНК, включают следующие работы: Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2 nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (with periodic updates) (ʺAusubel et al. 1992ʺ); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Основные принципы микробиологических подходов излагаются, например, в работе Davis, В. D. et al., Microbiology, 3rd edition, Harper & Row, publishers, Philadelphia, Pa. (1980).

Авторы данного изобретения обнаружили, что трегалоза в некоторой степени выходит из клеток через до сих пор не идентифицированный или не предполагавшийся механизм экспорта трегалозы и может быть выявлена в супернатанте. Авторы данного изобретения обнаружили также, что, как ни странно, при повреждении ptcC высвобождение трегалозы не происходит.

Описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, не имеющие активности специфичного к целлобиозе компонента ПС фосфотрансферазной (PTS) системы (PtcC).

В одном из аспектов настоящего изобретения грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, используются в качестве лекарственного средства, например для применения при лечении. В другом аспекте данного изобретения предлагается лекарственное средство, содержащее грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерий, не имеющие активности PtcC. Также описывается применение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, не имеющих активности PtcC, для производства лекарственного средства. Такое лекарственное средство может быть представлено, например фармацевтической композицией, нутрицевтическим, пробиотическим, лечебным или функциональным пищевым продуктом.

В другом аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, не имеющих активности PtcC, в качестве пробиотической или пищевой добавки, более конкретно - не лечебной пробиотической или пищевой добавки. В близком аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, не имеющих активности PtcC, в качестве стартовой культуры, предпочтительно стартовой культуры для получения пищевого продукта, в частности не лечебного пищевого продукта.

В другом аспекте данного изобретения предлагается пробиотическая или пищевая добавка, в частности не лечебная пробиотическая или пищевая добавка, содержащая грамположительные бактерии, предпоч