Улучшенная сборка биспецифических антител

Улучшенная сборка биспецифических антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительных заявок на патенты США № 61/545863, поданной 11 октября 2011 г., № 61/546503, поданной 12 октября 2011 г., № 61/560704, поданной 16 ноября 2011 г., и № 61/676837, поданной 27 июля 2012 г. Все вышеуказанные предварительные заявки на патенты включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам сборки гетеромультимерных белков, таких как биспецифические антитела, и композициям, используемым при их осуществлении.

Уровень техники

Моноклональные антитела типа IgG содержат два идентичных антигенсвязывающих домена и константный домен (Fc). В природе обычно отсутствуют антитела с разной специфичностью антигенсвязывающих доменов, поэтому такие антитела должны быть созданы химическими методами (например, при помощи перекрестного сшивания химическими методами и т.д.), методами рекомбинантных ДНК и/или методами клеточной гибридизации.

Биспецифические антитела могут одновременно связываться с двумя разными антигенами. Данное свойство позволяет разрабатывать методы лечения, осуществление которых невозможно при использовании обычных моноклональных антител. Большая панель созданных биспецифических антител свидетельствует о большом интересе, проявляемом к указанным молекулам. См. публикации Berg J., Lotscher E., Steimer K.S. et al., “Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88(11): 4723-4727 и Fischer N. and Leger O., “Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies, “Pathobiology (2007) 74: 3-14.

Другим классом мультиспецифических молекул являются рекомбинантные слитые белки. Рекомбинантные слитые белки, состоящие из внеклеточного домена иммунорегуляторных белков и константного (Fc) домена иммуноглобулина (Ig), представляют собой постоянно увеличивающийся класс лекарственных средств, предназначенных для лечения человека. Иммуноадгезины объединяют связывающую область белковой последовательности, обладающую требуемой специфичностью, с эффекторным доменом антитела. Иммуноадгезины обладают двумя важными свойствами, определяющими эффективность терапевтических средств: целенаправленной специфичностью и фармакокинетической устойчивостью (время полужизни in vivo, сравнимое с аналогичным показателем антител). Иммуноадгезины могут быть использованы в качестве антагонистов, ингибирующих или блокирующих вредные взаимодействия, или в качестве агонистов, имитирующих или усиливающих физиологические реакции. См. публикацию Chamow S.M., Zhang D.Z., Tan X.Y., et al., “A humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells,” J. Hematother. 1995; 4(5): 439-446.

В научных публикациях рассмотрены другие мультиспецифические молекулы. Примеры таких публикаций включают, не ограничиваясь ими, публикацию Fisher et al., Pathology (2007) 74: 3-14 (обзор разных биспецифических антител); патент США № 6660843, выданный 9 декабря 2003 г. Feige et al. (пептитела); патент США № 2002-004587, опубликованный 10 января 2002 г. (мультиспецифические антитела); патент США № 7612181, выданный 3 ноября 2009 г. Wu et al. (антитело с двумя вариабельными доменами); патент США № 6534628, Nord K. et al., Prot Eng. (1995) 8: 601-608, Nord K. et al., Nat. Biotech. (1997) 15:772-777 и Gronwall et al., Biotеchnol. Appl. Biochem. (2008) Jun; 50(Pt 2): 97-112 (аффитела); Martens et al., Clin. Cancer Res. (2006), 12: 6144-6152 и Jin et al., Cancer Res. (2008) 68(11): 4360-4368 (антитела с одним плечом); Bostrom et al., Science (2009) 323: 1610-1614 (Fab-фрагмент двойного действия, антитела со смешанной валентностью). Специалистам в данной области должны быть известны другие антитела.

Для создания клинических препаратов требуются новые антитела и, в частности, вышеописанные мультиспецифические молекулы. Как было указано выше, существует много путей создания молекул со смешанными антигенсвязывающими доменами, то есть с антигенсвязывающими доменами, отличными друг от друга. Но каждый из указанных методов характеризуется своими недостатками.

Перекрестное сшивание химическими методами является трудоемким процессом, так как соответствующие части необходимо очистить от гомодимеров и других нежелательных побочных продуктов. Кроме того, стадии химической модификации могут изменить целостность белков, что ухудшает их устойчивость. Таким образом, указанный метод часто оказывается неэффективным и может привести к утрате активности антитела.

Метод клеточной гибридизации (например, получение гибридом) представляет собой произвольную сборку двух тяжелых и двух легких цепей, в результате чего образуется 10 комбинаций антител. Требуемые гетеромультимерные антитела составляют небольшую часть полученных таких образом антител. Выделение требуемых гетеромультимерных белков существенно уменьшает выход продукта и увеличивает производственные затраты.

Методы рекомбинантных ДНК используют для создания разных гетеромультимерных антител, например, одноцепочечных Fv фрагментов, диател и т.д., не содержащих Fc домен. Основным недостатком молекулы антитела такого типа является отсутствие Fc домена и, следовательно, неспособность такого антитела запускать эффекторную функцию (такую как, например, активация комплемента, связывание с Fc-рецептором и т.д.). Таким образом, необходимо биспецифическое антитело, содержащее функциональный Fc домен.

Методы рекомбинантных ДНК также используют для создания биспецифических антител, соединяемых по типу ”выступ в углубление”. См. заявку на патент США № 20030078385 (Arathoon et al. - Genentech). Одним фактором, ограничивающим применение данного метода, является то, что легкие цепи двух исходных антител должны быть идентичными для предотвращения ошибочного спаривания и образования нежелательных и/или неактивных молекул при экспрессии в одной клетке.

Кроме того, одним фактором, ограничивающим применение данного метода, является окислительно-восстановительная эффективность процесса во время гибридизации и очистки. Окисленный гетеродимер обычно составляет только 70-80% белка после выполнения данной стадии (BioAnalyzer и MS-TOF). Остальные 20-30% составляют димерные антитела, у которых отсутствует способность ковалентного связывания (SEC-LLS). Такие антитела могут быть удалены, что значительно снижает общий выход продукта. Таким образом, существует потребность в увеличении общего выхода продукта при получении антител, в частности, гетеродимеров. В настоящем описании изобретения представлены методы, которые позволяют увеличить выход биспецифических антител, гетеродимеров и подобных антител. Вышеуказанные и другие объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания изобретения.

Сущность изобретения

Получение гетеромультимерных белков, собранных из двух или более шарнирсодержащих полипептидов, например, получение мультиспецифических антител из двух или большего числа половинных антител при помощи современных методов, характеризуется рядом недостатков, которые наряду с прочими недостатками включают получение смеси продуктов, низкий выход требуемого продукта и ослабленную/отсутствующую эффекторную функцию. Кроме того, во время получения каждого шарнирсодержащего полипептида, а также сборки или гибридизации гетеромультимеров часто происходит агрегация и осаждение белка. Агрегация и осаждение белка могут значительно уменьшать выход требуемого гетеромультимера. Таким образом, необходим метод, обеспечивающий более эффективное получение гетеромультимерных белков и на более высоких уровнях.

Настоящее изобретение относится к эффективным способам/методам экономичного получения гетеромультимерных белков, например, мультиспецифических антител, на основе использования или изменения одного или нескольких следующих элементов, которые включают, не ограничиваясь ими, стабилизатор, солюбилизатор, восстановительные условия, выбранное значение рН, выбранную температуру и т.д. Способы по настоящему изобретению характеризуются меньшей потерей белка в результате осаждения и/или агрегации и более высоким выходом гетеромультимерного белка, такого как биспецифические антитела.

Одним объектом изобретения является способ образования или получения гетеромультимерного белка, который включает:

а. получение первого шарнирсодержащего полипептида при значении рН 4-9, предпочтительно, 5-9, в присутствии первого солюбилизатора, при этом первый шарнирсодержащий полипептид содержит домен гетеромультимеризации;

b. получение второго шарнирсодержащего полипептида при значении рН 4-9, предпочтительно, 5-9, в присутствии второго солюбилизатора, при этом второй шарнирсодержащий полипептид содержит домен гетеромультимеризации;

с. смешивание первого и второго шарнирсодержащих полипептидов в восстановительных условиях с образованием смеси для сборки белка; и

d. инкубацию смеси для сборки белка с образованием или получением гетеромультимерного белка, содержащего первый и второй шарнирсодержащие полипептиды, в котором первый шарнирсодержащий полипептид взаимодействует со вторым шарнирсодержащим полипептидом в домене гетеромультимеризации.

В определенных вариантах осуществления данного объекта изобретения стадии а и/или стадии b предшествует стадия очистки первого и/или второго шарнирсодержащего полипептида. В определенных вариантах осуществления изобретения первый и/или второй шарнирсодержащий полипептид очищают протеином А.

Другим объектом изобретения является способ образования или получения биспецифического антитела, который включает:

а. получение первого половинного антитела при значении рН 4-9, предпочтительно, 5-9, в присутствии первого солюбилизатора, при этом первое половинное антитело содержит домен гетеромультимеризации;

b. получение второго половинного антитела при значении рН 4-9, предпочтительно, 5-9, в присутствии второго солюбилизатора, при этом второе половинное антитело содержит домен гетеромультимеризации;

с. смешивание первого и второго половинных антител в восстановительных условиях с образованием смеси для сборки белка; и

d. инкубацию смеси для сборки белка с образованием или получением биспецифического антитела, содержащего первое и второе половинные антитела, в котором первое половинное антитело взаимодействует со вторым половинным антителом в домене гетеромультимеризации.

В некоторых вариантах осуществления данного объекта изобретения стадии а и/или стадии b предшествует стадия очистки первого и/или второго половинного антитела. В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения первое и/или второе половинное антитело очищают протеином А.

Другим объектом изобретения является способ получения гетеромультимера, который включает получение аргининсодержащей смеси шарнирсодержащих полипептидов при значении рН 4-9, предпочтительно, 5-9, добавление слабого восстановителя и инкубацию в условиях, обеспечивающих получение гетеромультимера.

Другим объектом изобретения является способ получения гетеромультимерного белка, который включает:

а. получение первого шарнирсодержащего полипептида, очищенного протеином А;

b. получение второго шарнирсодержащего полипептида, очищенного протеином А;

с. доведение значения рН каждого половинного антитела до 4-9;

d. смешивание первого и второго шарнирсодержащих полипептидов с получением смеси для сборки белка;

е. добавление в смесь для сборки белка молярного избытка слабого восстановителя; и

f. инкубацию смеси для сборки белка с образованием гетеромультимерного белка, содержащего первый и второй шарнирсодержащие полипептиды.

Другим объектом изобретения является способ получения гетеромультимерного белка, который включает:

а. получение первого шарнирсодержащего полипептида, очищенного протеином А;

b. получение второго шарнирсодержащего полипептида, очищенного протеином А;

с. доведение значения рН каждого шарнирсодержащего полипептида до 4-9 в присутствии L-аргинина;

d. смешивание первого и второго шарнирсодержащих полипептидов с получением смешанного пула шарнирсодержащих полипептидов; и

е. инкубацию с образованием гетеромультимерного белка, содержащего первый и второй шарнирсодержащие полипептиды.

В некоторых вариантах осуществления данного объекта изобретения смешанный пул шарнирсодержащих полипептидов инкубируют в восстановительных условиях. В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид содержит половинное антитело, иммуноадгезин или их функциональный фрагмент. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин присутствует в концентрации 20 мМ - 1 М, 20 мМ - 200 мМ или 50 мМ - 200 мМ. В других определенных вариантах осуществления изобретения на стадии d или стадии е добавляют PVP. В определенных вариантах осуществления изобретения значение рН регулируют после смешивания.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что фиксация среднего значения рН шарнирсодержащего полипептида, такого как половинное антитело, может стимулировать изменение конформации белка, которое усиливает последующую сборку шарнирсодержащих полипептидов. В определенных вариантах осуществления изобретения среднее значение рН равно рН 4-9, предпочтительно, 5-9, по меньшей мере рН 5, по меньшей мере рН 5,5, по меньшей мере рН 5,7, больше рН 5, больше рН 5,5, больше рН 5,7, 5-9, 5-8, 5,5-8, 5,5-9, 5,7-8, 5,7-9, 6-8, 6-9, 7-8, 7,5-8,5 или 7-8,5. Солюбилизатор может быть добавлен для предотвращения или минимизации осаждения шарнирсодержащего полипептида, вызываемого показателем рН. В некоторых вариантах осуществления изобретения солюбилизатор добавляют до фиксации среднего значения рН. В определенных вариантах осуществления изобретения первый и второй солюбилизаторы выбирают из группы, состоящей из аргинина, гистидина и сахарозы, предпочтительно, из аргинина и/или гистидина. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин является солью аргинина и/или гистидин является солью гистидина. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин является производным аргинина и/или гистидин является производным гистидина. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин или гистидин является L-аргинином или L-гистидином. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин или гистидин является гидрохлоридом аргинина или гидрохлоридом гистидина. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин или гистидин является фосфатом аргинина или фосфатом гистидина. В определенных вариантах осуществления изобретения первый и второй солюбилизаторы являются разными; в то время как в других вариантах осуществления изобретения первый и второй солюбилизаторы являются одинаковыми. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения первый и второй солюбилизаторы содержат аргинин. В других вариантах осуществления изобретения аргинин присутствует в концентрации от 20 мМ до 1 М, от 20 мМ до менее 1 М, от 20 мМ до 100 мМ, от 20 мМ до 200 мМ, от 20 мМ до 300 мМ, от 20 мМ до 400 мМ, от 50 мМ до 100 мМ, от 50 мМ до 150 мМ, от 50 мМ до 200 мМ, от 50 мМ до 250 мМ или от 50 мМ до 300 мМ, предпочтительно, от 20 мМ до 200 мМ. В других вариантах осуществления изобретения солюбилизатор содержит производное аргинина, которым является, не ограничиваясь им, ацетиларгинин. В других вариантах осуществления изобретения первый и второй солюбилизаторы содержат гистидин, присутствующий в концентрации от 20 мМ до 1 М, от 20 мМ до менее 1 М, от 20 мМ до менее 500 мМ, от 20 мМ до 100 мМ, от 20 мМ до 200 мМ, от 20 мМ до 300 мМ, от 20 мМ до 400 мМ, от 50 мМ до 100 мМ, от 50 мМ до 150 мМ, от 50 мМ до 200 мМ, от 50 мМ до 250 мМ, от 50 мМ до 300 мМ, от 50 мМ до 400 мМ, от 50 мМ до 500 мМ или от 50 мМ до 600 мМ. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения солюбилизатор добавляют в концентрации 50 мМ. В других определенных вариантах осуществления изобретения солюбилизатор добавляют в концентрации 200 мМ. В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения аргинин или гистидин добавляют в концентрации 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ или 200 мМ. В других определенных вариантах осуществления изобретения первый и/или второй шарнирсодержащие полипептиды получают в присутствии как аргинина, так и гистидина. В других вариантах осуществления изобретения аргинин и гистидин присутствуют в концентрации от 20 мМ до 1 М, от 20 мМ до менее 1 М, от 20 мМ до 100 мМ, от 20 мМ до 200 мМ, от 20 мМ до 300 мМ, от 20 мМ до 400 мМ, от 50 мМ до 100 мМ, от 50 мМ до 150 мМ, от 50 мМ до 200 мМ, от 50 мМ до 250 мМ или от 50 мМ до 300 мМ, предпочтительно, от 50 мМ до 200 мМ.

В определенных вариантах осуществления изобретения первый и второй шарнирсодержащие полипептиды смешивают до фиксации среднего значении рН (то есть до регулирования значения рН). В других определенных вариантах осуществления изобретения первый и второй шарнирсодержащие полипептиды смешивают после раздельного регулирования значения рН в первом и втором шарнирсодержащих полипептидах. В определенных вариантах осуществления изобретения солюбилизатор добавляют до регулирования значения рН.

В определенных вариантах осуществления изобретения первый и второй шарнирсодержащие полипептиды отдельно очищают до смешивания, в то время как в других вариантах осуществления изобретения первый и второй шарнирсодержащие полипептиды очищают вместе после смешивания. В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид содержит половинное антитело. В определенных вариантах осуществления изобретения собранный гетеромультимерный белок может быть подвергнут дальнейшей очистке.

Белки могут быть очищены любыми приемлемыми методами, которые включают, не ограничиваясь ими, очистку при помощи хроматографии на колонке с протеином А, хроматографии на колонке с протеином G, гидрофобной хроматографии (HIC), фракционирования на иммуноаффинной колонке, осаждения этанолом, хроматографии с обращенной фазой на диоксиде кремния или ионообменной смоле, такой как DEAE, хроматофокусирования, SDS-PAGE, осаждения сульфатом аммония и гель-фильтрации с использованием, например, сефадекса G-75, других подобных методов очистки и их комбинаций.

В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид, такой как половинное антитело, очищают при помощи хроматографии на колонке с протеином А или протеином G. В другом варианте осуществления изобретения первый и второй шарнирсодержащие полипептиды смешивают до очистки протеином А и совместно очищают протеином А. В определенных вариантах осуществления изобретения значение рН регулируют после смешивания полипептидов, очищенных протеином А. В других вариантах осуществления изобретения значение рН регулируют до смешивания полипептидов, очищенных протеином А. В определенных вариантах осуществления изобретения солюбилизатор добавляют до регулирования значения рН.

В других определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид очищают при помощи гидрофобной хроматографии или ионообменной хроматографии. Специалист в данной области может выбрать приемлемые методы очистки. Например, шарнирсодержащий полипептид может быть очищен хроматографией на колонке с протеином А с последующим выполнением ионообменной хроматографии; шарнирсодержащий полипептид может быть также очищен хроматографией на колонке с протеином А с последующим выполнением гель-фильтрации и/или гидрофобной хроматографии. В других примерах шарнирсодержащий полипептид может быть очищен на одной или нескольких ионообменных колонках до очистки на колонке с протеином А. В определенных вариантах осуществления изобретения промывочные и/или элюирующие буферы, используемые на любых стадиях очистки шарнирсодержащих полипептидов, не содержат аргинин и/или гистидин.

В других вариантах осуществления изобретения половинное антитело, элюированное из колонки с протеином А или из другой колонки при кислотном значении рН, доводят до среднего значения рН. Последующее регулирование значения рН (также определяемое как фиксация среднего значения рН) может вызвать осаждение шарнирсодержащего полипептида, такого как половинное антитело, и, таким образом, уменьшить выход собранного гетеромультимерного белка. Поэтому в определенных вариантах осуществления изобретения к половинному антителу, элюированному из колонки с протеином А или протеином G с кислотным значением рН, добавляют солюбилизатор до регулирования значения рН. Если стадия регулирования значения рН является необязательной, в определенных вариантах осуществления изобретения солюбилизатор, предпочтительно, добавляют к очищенному шарнирсодержащему полипептиду для предотвращения или уменьшения осаждения и/или агрегации.

Помимо фиксации среднего значения рН, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что нагревание может усиливать изменение конформации и/или улучшать сборку шарнирсодержащих полипептидов, таких как половинные антитела. Поэтому в определенных вариантах осуществления изобретения одну, несколько или все стадии а-d способов по настоящему изобретению выполняют, нагревая шарнирсодержащие полипептиды при температуре 15°С-39°С, 15°С-42°С, 18°С-37°С, 20°С-42°С, 20°С-25°С, 25°С-42°С, 25°С-35°С, 25°С-39°С, 30°С-35°С, 32°С-35°С или 32°С-37°С, предпочтительно, 35°С-37°С, в течение по меньшей мере 30 минут. В определенных вариантах осуществления изобретения время инкубации составляет до 72 часов при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения время инкубации равно 3 часам при 35°С. В других определенных вариантах осуществления изобретения температура равна примерно 30°С, 35°С или 37°С.

Однако нагревание также может увеличивать агрегацию и/или осаждение. Поэтому в определенных конкретных вариантах осуществления изобретения к половинному антителу, элюированному из колонки с протеином А или протеином G, до нагревания добавляют солюбилизатор.

В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид содержит половинное антитело, иммуноадгезин или их функциональный фрагмент. В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид содержит Fc компонент.

В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения первый и/или второй шарнирсодержащий полипептид содержит половинное антитело. В определенных вариантах осуществления изобретения половинное антитело является половинным антителом IgG. В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения половинное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG4 или IgG2. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения сохраняется сигнальный пептид молекулы иммуноглобулина для облегчения секреции половинного антитела, особенно при продуцировании в клетке млекопитающего. В определенных вариантах осуществления изобретения способ по настоящему изобретению включает получение первого и второго половинного антитела при рН 5-9 в присутствии аргинина в концентрации примерно 50 мМ и альтернативно или дополнительно гистидина в концентрации примерно 200 мМ. В определенных вариантах осуществления изобретения первое и/или второе половинное антитело включает антигенсвязывающий домен, специфичный к другому антигену или другому эпитопу того же антигена, при этом собранное полное антитело является биспецифическим антителом. В других определенных вариантах осуществления изобретения первое и второе половинные антитела относятся к одному изотипу, в то время как в других вариантах осуществления изобретения первое и второе половинные антитела относятся к разным изотипам.

Половинное антитело может включать V_L домен, V_H домен, шарнирную область, СН₂ домен и/или СН₃ домен. Половинное антитело также может быть одноцепочечным полипептидом, дополнительно содержащим связующее звено, где указанный одноцепочечный полипептид содержит домены, расположенные относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: V_L-связующее звено-V_H-шарнирная область-СН₂-СН₃. В других определенных вариантах осуществления изобретения половинное антитело далее содержит С_L домен и СН₁ домен, и в других вариантах осуществления изобретения половинное антитело может быть одноцепочечным полипептидом, содержащим связующее звено, где указанный одноцепочечный полипептид содержит домены, расположенные относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: V_L-C_L-связующее звено-V_H-CH₁-шарнирная область-СН₂-СН₃.

Связующее звено может содержать один или несколько остатков глицина (G) и серина (S). В других вариантах осуществления изобретения связующее звено содержит повторы GGS. Связующее звено, например, состоит из 15-50 аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения связующее звено включает от 20 до 32 аминокислот, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32 аминокислоты. В определенных вариантах осуществления изобретения связующее звено расщепляется. В других вариантах осуществления изобретения связующее звено может отщепляться или не отщепляться от белка. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения связующее звено расщепляется в положении двух сайтов у N- и С-конца одним и тем же ферментом. В одном варианте осуществления изобретения связующее звено содержит сайт расщепления протеазами, такими как фурин. В другом варианте осуществления изобретения связующее звено расщепляется фурином в положении сайта расщепления RXRXRR (SEQ ID NO:1), где Х является любой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый шарнирсодержащий полипептид является половинным антителом и второй шарнирсодержащий полипептид является одноцепочечным половинным антителом.

Другой вариант осуществления изобретения относится к белку, содержащему комплекс из связующего звена и Fc компонента, в котором связующее звено может отщепляться или не отщепляться от белка.

В других вариантах осуществления изобретения первый и второй шарнирсодержащие полипептиды содержат домен гетеромультимеризации. Домен гетеромультимеризации может представлять собой мутацию ”выступ в углубление”, лейциновую застежку-молнию, электростатик и тому подобные. Первый шарнирсодержащий полипептид может иметь выступ и второй шарнирсодержащий полипептид может иметь углубление. В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид является половинным антителом, при этом первое половинное антитело имеет выступ и второе половинное антитело имеет углубление.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы по настоящему изобретению включают добавление аргинина до конечной концентрации от 20 мМ до 1 М до регулирования значения рН. В некоторых вариантах осуществления изобретения аргинин добавляют до конечной концентрации 50 мМ - 600 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения аргинин добавляют до конечной концентрации 50 мМ - 100 мМ.

В определенных вариантах осуществления изобретения способ по настоящему изобретению включает инкубацию каждого пула шарнирсодержащих полипептидов, очищенных протеином А, при рН 5-8 до смешивания первого и второго половинных антител. В других вариантах осуществления изобретения пулы, очищенные протеином А, сначала смешивают и затем регулируют значение рН до 5-8.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы по настоящему изобретению включают инкубацию смешанного пула половинных антител или смешанного пула шарнирсодержащих полипептидов при температуре 15°С-39°С, предпочтительно, 18°С-37°С, более предпочтительно, 20°С-25°С, еще предпочтительнее 32°С-37°С, в течение по меньшей мере 30 минут.

Шарнирсодержащие полипептиды могут быть продуцированы, например, в бактериальной клетке, дрожжевой клетке, бакуловирусе, клетке насекомого или клетке млекопитающего. В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид продуцируют в бактериальной клетке, в частности, E.coli. В других определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид продуцируют в клетке млекопитающего, в частности, в клетке СНО. В конкретных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид содержит половинное антитело.

Шарнирсодержащие полипептиды могут взаимодействовать с образованием димера или мультимера при помощи домена гетеродимеризации. В определенных вариантах осуществления изобретения взаимодействие между первым и вторым шарнирсодержащими полипептидами в области контакта доменов гетеродимеризации является взаимодействием “выпуклость в полость”, гидрофобным взаимодействием и/или электростатическим взаимодействием. В других определенных вариантах осуществления изобретения домен гетеромультимеризации содержит выступ (например, выпуклость), углубление (например, полость), лейциновую застежку-молнию, скрученную спираль или полярный аминокислотный остаток, способный вызывать электростатическое взаимодействие, или их комбинации. В определенных вариантах осуществления изобретения первый шарнирсодержащий полипептид имеет выступ и второй шарнирсодержащий полипептид имеет углубление. В других определенных вариантах осуществления изобретения взаимодействие является гидрофобным взаимодействием и электростатическим взаимодействием. В определенных типичных вариантах осуществления изобретения домен гетеромультимеризации первого и второго шарнирсодержащих полипептидов имеет выступ или углубление и аминокислотный остаток, способный вызывать электростатическое взаимодействие. Специалисту в данной области должно быть понятно, что домен гетеромультимеризации может характеризоваться несколькими взаимодействиями, например, взаимодействием по типу “выступ и углубление” (K&H) и гидрофобным взаимодействием, K&H и лейциновой застежкой-молнией и т.д. В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид дополнительно содержит связующее звено. В конкретных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид содержит половинное антитело.

В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения смесь для сборки белка находится в восстановительных условиях, предпочтительно, в слабых восстановительных условиях, и имеет окислительный потенциал от -50 до -600 мВ, от -100 до -600 мВ, от -200 до -600 мВ, от -100 до -500 мВ, от -150 до -300 мМ, более предпочтительно, от -300 до -500 мВ, наиболее предпочтительно, около -400 мВ, которые стимулируют сборку гетеромультимерных белков при рН 7-9 и температуре от 15°С до 39°С. В определенных вариантах осуществления изобретения восстановитель добавляют на стадии с или стадии d для создания требуемых восстановительных условий в процессе сборки. В других определенных вариантах осуществления изобретения восстановитель выбирают из группы, состоящей из дитиотреита (DTT), трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), тиогликолевой кислоты, аскорбиновой кислоты, тиолуксусной кислоты, глутатиона (GSH), бета-меркаптоэтиламина, цистеина/цистина, глутатиона (GSH), цистеамина/цистамина, глицилцистеина и бета-меркаптоэтанола, предпочтительно, GSH. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения восстановитель, предпочтительно, является слабым восстановителем, выбираемым из группы, состоящей из глутатиона (GSH), бета-меркаптоэтиламина, цистеина/цистина, глутатиона (GSH)/глутатиондисульфида (GSSG), цистеамина/цистамина, глицилцистеина и бета-меркаптоэтанола, предпочтительно, GSH. В определенных вариантах осуществления изобретения восстановитель не является DTT.

В других определенных вариантах осуществления изобретения восстановитель добавляют в смесь для сборки белка в 2-600-кратном, 2-200-кратном, 2-300-кратном, 2-400-кратном, 2-500-кратном, 2-20-кратном, 2-8-кратном, 20-50-кратном, 50-600-кратном, 50-200-кратном или 100-300-кратном молярном избытке, предпочтительно, 5-400-кратном, более предпочтительно, 100-300-кратном и, наиболее предпочтительно, 200-кратном молярном избытке по отношению к общему количеству шарнирсодержащих полипептидов. В определенных вариантах осуществления изобретения смесь для сборки белка имеет значение рН 7-9, предпочтительно, рН 8,5. В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид является половинным антителом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения восстановитель добавляют к первому и второму шарнирсодержащим полипептидам до смешивания. Добавление, предпочтительно, производят менее, чем за 1 час, более предпочтительно, менее, чем за 15 минут, наиболее предпочтительно, менее, чем за 5 минут до смешивания.

В определенных вариантах осуществления изобретения способ по настоящему изобретению далее включает добавление стабилизатора в реакционную смесь на одной или нескольких стадиях, включающих, не ограничиваясь ими, стадию фиксации среднего значения рН и стадию сборки с нагреванием или без нагревания. Например, стабилизатор может быть добавлен к шарнирсодержащему полипептиду для предотвращения или уменьшения агрегации. В других примерах стабилизатор может быть добавлен в смесь для сборки белка для предотвращения или уменьшения агрегации в процессе сборки гетеромультимерного белка. В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид является половинным антителом.

В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения стабилизатор выбирают из группы, состоящей из аргинина, гистидина и поливинилпирролидона (PVP). В определенных вариантах осуществления изобретения аргинин или гистидин является солью аргинина или солью гистидина. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин или гиститид является производным аргинина или производным гистидина. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин или гистидин является гидрохлоридом аргинина или гидрохлоридом гистидина. В определенных вариантах осуществления изобретения аргинин не является фосфатом аргинина.

В других определенных вариантах осуществления изобретения способ по настоящему изобретению далее включает стадию инкубации смеси для сборки белка в присутствии PVР. В родственных вариантах осуществления изобретения PVP добавляют в количестве до 40% (мас./об.). В других определенных вариантах осуществления изобретения PVP присутствует в смеси для сборки белка в концентрации 2%-6% (мас./об.), 10%-20%, 2%-10%, 1%, 1,3%, 1,7%, 2%, 2,3%, 2,7%, 3%, 3,3%, 3,7% или 4%, предпочтительно, 0,1%-10%, более предпочтительно, 2%-6% и, наиболее предпочтительно, 4%. В определенных вариантах осуществления изобретения молекулярная масса PVP составляет не более 100 кДа, не более 30 кДа и, предпочтительно, равна 10 кДа. В других определенных вариантах осуществления изобретения РVP присутствует в количестве менее 10% (мас./об.) или менее 5% (мас./об.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения стабилизатор является аргинином, присутствующим в концентрации от 20 мМ до 1 М, от 20 мМ до менее 1 М, от 20 мМ до 100 мМ, от 20 мМ до 200 мМ, от 20 мМ до 300 мМ, от 20 мМ до 400 мМ, от 20 мМ до 50 мМ, от 50 мМ до 100 мМ, от 50 нМ до 150 мМ, от 50 мМ до 200 мМ, от 50 мМ до 250 мМ или от 50 мМ до 300 мМ. В других вариантах осуществления изобретения стабилизатор является гистидином, присутствующим в концентрации от 20 мМ до 1 М, от 20 мМ до менее 1 М, от 20 мМ до 100 мМ, от 20 мМ до 200 мМ, от 20 мМ до 300 мМ, от 20 мМ до 400 мМ, от 20 мМ до 50 мМ, от 50 мМ до 100 мМ, от 50 нМ до 150 мМ, от 50 мМ до 200 мМ, от 50 мМ до 250 мМ или от 50 мМ до 300 мМ. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения аргинин или гистидин добавляют в концентрации 50 мМ или 200 мМ. В других определенных вариантах осуществления изобретения аргинин и/или гистидин добавляют в концентрации от 20 мМ до 200 мМ, от 20 мМ до 100 мМ, от 50 мМ до 200 мМ или от 50 мМ до 100 мМ. В других определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид содержит половинное антитело.

Другим объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, экспрессирующая шарнирсодержащий полипептид. В определенных вариантах осуществления изобретения шарнирсодержащий полипептид является половинным антителом.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения биспецифического антитела, который включает стадии: (а) культивирование первой клетки-хозяина, созданной для экспрессии первого половинного антитела, специфичног