Способ получения ароматических спиртов

Способ получения ароматических спиртов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Область техники имеет отношение к цитохромам Р450 и их использованию для получения сесквитерпеновых спиртов.

Уровень техники

Терпеновые углеводороды, такие как альфа- и бета-санталены, вырабатываются посредством биохимических процессов, например, путем использования генетически модифицированных клеток. Эти терпены и полученный из них спирт являются основными компонентами масла сандалового дерева, при этом спирты являются важными парфюмерными ингредиентами, которые в промышленном масштабе обычно получают посредством дистилляции сердцевинной древесины видов Santalum (например, сандалового дерева). Примеры таких спиртов включают α-синенсол, β-синенсол, α-санталол, β-санталол, α-транс-бергамотол и эпи-β-санталол. Несмотря на то что для получения терпеновых углеводородов разработаны новые биохимические пути, включая созданные методами генетической инженерии клетки, желательно найти дополнительные биохимические пути производства спиртов, получаемых из санталенов. Кроме того, желательным является использование биохимического пути не только для получения таких спиртов, но также дополнительного селективного производства, посредством биохимического пути, цис-изомеров спиртов, таких как изо-α-синенсол, изо-β-синенсол, (Z)-α-санталол, (Z)-β-санталол, (Z)-α-транс-бергамотол и (Z)-эпи-β-санталол.

Цитохромы Р450 представляют семейство ферментов оксидаз. Цитохромы Р450 обычно катализируют реакцию монооксигеназы. Ферменты цитохромы Р450 подразделяются на семейства и подсемейства, исходя из гомологии аминокислотных последовательностей. Члены одного и того же подсемейства имеют идентичность аминокислотной последовательности свыше 55% и обычно обладают сходной ферментативной активностью (селективностью по субстрату и/или продукту). CYP71AV1 (учетный номер NCBI АВВ82944.1, SEQ ID NO 51 и 52) и CYP71AV8 (учетный номер NCBI ADM86719.1, SEQ ID NO 1 и 2) - два члена подсемейства CYP71AV, имеющие идентичность последовательности 78%. Ранее было показано, что CYP71AV1 окисляет аморфадиен (Teoh et al., FEBS letters 580 (2006) 1411-1416). Также ранее показано, что CYP71AV8 окисляет (+)-валенсен, гермакрен А и аморфадиен (Cankar et al., FEBS Lett. 585(1), 178-182 (2011)).

Сообщалось, что в процессах с применением сконструированных клеток используют терпеновые синтазы для катализирования выработки дитерпена или сесквитерпена. Дитерпены или сесквитерпены подвергались дополнительной обработке с использованием цитохром-Р450 полипептида с целью катализировать гидроксилирование, окисление, деметилирование или метилирование дитерпена или сесквитерпена, продуцированного данной клеткой.

Раскрытие изобретения

В описании предоставляется способ получения сесквитерпенового спирта, включающий:

i) контактирование терпена Формулы I:

с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45% с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79, и SEQ ID NO: 81; и

ii) необязательно выделение спирта, в котором R является насыщенной, мононенасыщенной или полиненасыщенной алифатической группой, состоящей из 9 атомов углерода, и в котором R может представлять собой разветвленную цепь или состоит из одного или более неароматических колец.

Кроме того, в описании предоставляется способ получения сесквитерпена, в том числе α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий:

i) контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена, эпи-β-санталена и/или β-бисаболена с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности не менее или по меньшей мере около 45% с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 81, с целью получения спирта; и

ii) необязательно выделение спирта.

Также предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, обладающим Р450 монооксигеназной активностью, при этом полученный сесквитерпеновый спирт содержит не менее или по меньшей мере около 36% цис-изомера.

Кроме того, в описании предоставляется изолированный, обладающий монооксигеназной активностью полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является идентичной не менее или по меньшей мере примерно на 45%, 50%, 55%, 50%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или более с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 71 и SEQ ID NO 73.

Кроме того, в описании предоставляется изолированный, обладающий монооксигеназной активностью полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является идентичной не менее или по меньшей мере примерно на 45%, 50%, 55%, 50%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или более с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 81.

Также в описании предоставляется изолированный, обладающий монооксигеназной активностью, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 81.

Кроме того, в описании предоставляется способ получения сесквитерпенового спирта, выбранного из группы, состоящей из α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола и ланцелола или их смесей, включающий:

i) культивирование клеток при условиях, подходящих для выработки р450 полипептида, обладающего монооксигеназной активностью, при котором клетка: а) продуцирует пирофосфат, предшественник ациклических терпенов; b) экспрессирует Р450 редуктазу, с) экспрессирует полипептид, который имеет α-фарнезен, β-фарнезен, α-сантален, β-сантален, α-транс-бергамотен и/или эпи-β-сантален синтазную активность и продуцирует α-фарнезен, β-фарнезен, α-сантален, β-сантален, α-транс-бергамотен и/или эпи-β-сантален и d) экспрессирует полипептид с аминокислотной последовательностью, имеющей идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45% с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 81; и

ii) необязательно выделение спирта из клетки.

Подробное описание чертежей

Фигура 1. Выравнивание аминокислотной последовательности N-концевого участка различных вариантов CYP71AV8.

Фигура 2. Выравнивание последовательностей ДНК различных вариантов CYP71AV8. Закодированные аминокислотные последовательности показаны ниже каждой последовательности с помощью однобуквенного кода.

Фигура 3. GCMS-анализ (газовая хроматография и масс-спектроскопия) преобразования сесквитерпенов клетками Е. Coli, экспрессирующими белки CYP71AV8 и CPRm. А, биопреобразование (+)-альфа-санталена. В, биопреобразование смеси (+)-альфа-санталена/(-)-бета-сантален.

Фигура 4. Организация искусственного бицистронного оперона, содержащего кДНК Р450 и CPR.

Фигура 5. Сравнение биопреобразования (+)-α-санталена и смеси α/β-санталена клетками Е. coli, трансформированными различными бицистронными оперонами, состоящими из Р450 и CPR кДНК. 1, CYP71AV8-65188 и aaCPR. 2, CYP71AV8-P2 и aaCPR. 3, CYP71AV8-P2O и aaCPR. 4, CYP71AV8-65188 и CPRm. 5, CYP71AV8-P2 и CPRm. 6, CYP71AV8-P2O и CPRm.

Фигура 6. GCMS-анализ сесквитерпеновых молекул, продуцируемых клетками Е. Coli, экспрессирующими CYP71AV8, CPRm, альфа-сантален синтазу (А) или альфа-сантален/бета-сантален синтазу (В) и ферменты мевалонатного пути. 1, (+)-α-сантален; 2 (-)-α-транс-бергамотен; 3, (+,)-эпи-β-сантален; 4, (-)-β-сантален.

Фигура 7. Окисление (+)-α-санталена CYP71AV8 дикого типа (А) и мутантными L-358 (В). GC-MS профили сесквитерпеновых продуктов, продуцированных клетками Е. Coli KRX, экспрессирующими CPRm, ClASS, ферменты мевалонатного пути и CYP71AV8 (А) или CYP71AV8-L358F (В). Культивирование проводилось в среде ТВ, содержащей 3% глицерина в качестве источника углерода. Различные продукты были идентифицированы как α-сантален (1), (E)-α-санталал (2), (Z)-α-санталол (4) и (E)-α-санталол (3).

Фигура 8. GC-MS-профили сесквитерпеновых продуктов, продуцированных клетками Е. Coli KRX, экспрессирующими CPRm, SaSAS, ферменты мевалонатного пути и CYP71AV8-L358F. Культивирование проводилось в среде ТВ, содержащей 3% глицерина в качестве источника углерода. Различные продукты были идентифицированы с помощью масс-спектрального анализа.

Фигура 9. GCMS-анализ преобразования (+)-α-санталена клетками Е. Coli, экспрессирующими белки CYP71AV1 и CPRm.

Фигура 10. GC-анализ in vivo преобразования (+)-α-санталена в (Z)-α-санталол двойным мутантом Р450-ВМ3 (вариант #17). Экстракты растворителем культур рекомбинантных клеток Е. coli, ко-экспрессирующих Clausena lansium α-сантален синтазу и либо Р450-ВМ3 дикого типа (А) либо Р450-ВМ3 вариант #17 (В), были исследованы, как описано в примере 11. 1, (+)-α-сантален; 2, (-)-α-транс-бергамотен; 3, (Z)-α-санталол; Хроматограммы показаны в режиме селективного детектирования ионов (M/Z 93).

Фигура 11. GC-анализ in vivo преобразования (+)-α-санталена, (-)-β-санталена, (-)-α-транс-бергамотена и (+)-эпи-β-санталена двойным мутантом Р450-ВМ3. Экстракты растворителем культур рекомбинантных клеток Е. coli, ко-экспрессирующих альфа-сантален/бета-сантален синтазу, из Santalum album и либо Р450-ВМ3 дикого типа (А) или Р450-ВМ3 варианта #17 (В) были исследованы, как описано в примере 11. 1, (+)-α-сантален; 2, (-)-α-транс-бергамотен; 3, (+)-эпи-β-сантален; 4, (-)-β-сантален; 5, (Z)-α-санталол; 6, (Z)-α-транс-бергамотол; 7, (Z)-эпи-β-санталол; 8, (Z)-β-санталол. Хроматограммы представлены в режиме селективного детектирования ионов (M/Z 93).

Фигура 12. GCMS-анализ преобразования (+)-α-санталена рекомбинантным ферментом SaCP816. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP816. С. Масло сандалового дерева для сравнения времени удерживания. Все исследования были проведены in vitro, как описано в примере 4. 1, (+)-α-сантален; 5, (Z)-α-санталол; 6, (Z)-α-транс-бергамотол; 7, (Z)-эпи-β-санталол; 8, (Z)-β-санталол. Идентичность сесквитерпеновых молекул была подтверждена совпадением масс-спектров с аутентичными стандартами.

Фигура 13. GCMS-анализ преобразования (+)-α-санталена, (-)-β-санталена, (-)-α-транс-бергамотена и (+)-эпи-β-санталена рекомбинантным ферментом SaCP816. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP816. С. Масло сандалового дерева для сравнения времени удерживания. Все исследования были проведены in vitro, как описано в примере 4. 1, (+)-α-сантален; 2, (-)-α-транс-бергамотен 3, (+)-эпи-β-сантален 4, (-)-β-сантален; 5, (Z)-α-санталол; 6, (Z)-α-транс-бергамотол; 7, (Z)-эпи-β-санталол; 8, (Z)-β-санталол. Идентичность сесквитерпеновых молекул была подтверждена совпадением масс-спектров с аутентичными стандартами.

Фигура 14. GCMS-анализ молекул, продуцированных Е. Coli, созданными для выработки сесквитерпенов и экспрессирующих SaCP816, CPRm, альфа-сантален синтазу (ClASS) (А) или альфа-сантален/бета-сантален синтазу (SaSAS) (В). 1, (+)-α-сантален; 2, (-)-α-транс-бергамотен 3, (+)-эпи-β-сантален; 4, (-)-β-сантален 5, (Z)-α-санталол; 6, (Z)-α-транс-бергамотол; 7, (Z)-эпи-β-санталол; 8, (Z)-β-санталол (элюированный вместе с фарнезолом, получающимся из избыточного пула фарнезилдифосфата). Идентичность сесквитерпеновых молекул была подтверждена совпадением масс-спектров с аутентичными стандартами.

Фигура 15. GCMS-анализ преобразования (+)-α-санталена (21) рекомбинантным Р450 ферментом SaCP10374. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP10374. Числа, указанные на хроматограммах, относятся к структурам, представленным на фигуре 27.

Фигура 16. GCMS-анализ преобразования смеси, состоящей из (+)-α-санталена (21), (-)-α-транс-бергамотена (17); (+)-эпи-β-санталена и (-)-β-санталена (25) (полученной с использованием рекомбинантного белка SaTp8201, пример 4), рекомбинантными SaCP10374 P450s ферментами. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP10374. Числа, указанные на хроматограммах, относятся к структурам, представленным на фигуре 27.

Фигура 17. GCMS-анализ преобразования β-фарнезена (1) рекомбинантными S. album P450s ферментами. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP10374. С. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP816. Числа, указанные на хроматограммах, относятся к структурам, представленным на фигуре 27.

Фигура 18. GCMS-анализ преобразования α-фарнезена (5) рекомбинантными S. album P450s ферментами. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP10374. С. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP816. Числа, указанные на хроматограммах, относятся к структурам, представленным на фигуре 27.

Фигура 19. GCMS-анализ преобразования (-)-сесквисабинена В (9) рекомбинантными S. album P450s ферментами. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP10374. С. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP816. Числа, указанные на хроматограммах, относятся к структурам, представленным на фигуре 27.

Фигура 20. GCMS-анализ преобразования (-)-β-бисаболена (13) рекомбинантными ферментами S. album P450s. А. Контроль без рекомбинантного фермента Р450. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP10374. С. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP816. Числа, указанные на хроматограммах, относятся к структурам, представленным на фигуре 27.

Фигура 21. GCMS-анализ преобразования (-)-α-бергамотена (17) рекомбинантными ферментами S. album P450s. А. Контроль без рекомбинантного Р450 фермента. В. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP10374. С. Анализ экстракта неочищенного белка Е. coli, содержащего рекомбинантный белок SaCP816. Числа, указанные на хроматограммах, относятся к структурам, представленным на фигуре 27.

Фигура 22. GCMS-анализ продуктов, произведенных in vivo, как описано в примере 23, клетками Е. Coli KRX, трансформированными плазмидами pACYC-29258-4506 и плазмидой pD444-SR-AaBFS (A), SaCP10374-CPRm-AaBFS-pCWori (В) или SaCP816-CPRm-AaBFS-pCWori (С). Хроматограммы демонстрируют образование (E)-β-фарнезена (1), а также окисленных производных (2-3) (соответствующие структуры смотри на фигуре 27).

Фигура 23. GCMS-анализ продуктов, произведенных in vivo, как описано в примере 23, клетками Е. Coli KRX, трансформированными плазмидами pACYC-29258-4506 и плазмидой pD444-SR-PaBAFS (A), SaCP10374-CPRm-PaAFS-pCWori (В) или SaCP816-CPRm-PaAFS-pCWori (С). Хроматограммы демонстрируют образование (Е,Е)-α-фарнезена (5), а также окисленных производных (6-8) (соответствующие структуры смотри на фигуре 27). На каждой хроматограмме показан пик фарнезола, возникающего в результате гидролиза избытка FPP.

Фигура 24. GCMS-анализ продуктов, произведенных in vivo, как описано в примере 23, клетками Е. Coli KRX, трансформированными плазмидами pACYC-29258-4506 и плазмидой pETDuet-SaTps647 (A), SaCP10374-CPRm-SaTps647-pCWori (В), или SaCP816-CPRm-SaTPS647-pCWori (C). Хроматограммы демонстрируют образование (-)-сесквисабинена В (9), а также окисленных производных (10-12) (соответствующие структуры смотри на фигуре 27).

Фигура 25. GCMS-анализ продуктов, произведенных in vivo, как описано в примере 23, клетками Е. Coli KRX, трансформированными плазмидами pACYC-29258-4506 и плазмидой pETDuet-ClTps2 (А) или SaCP10374-CPRm-ClTps2-pCWori (В). Хроматограммы демонстрируют образование (+)-α-санталена (21), а также окисленных производных (23-24) (соответствующие структуры смотри на фигуре 27).

Фигура 26. GCMS-анализ продуктов, произведенных in-vivo, как описано в примере 23, клетками Е. Coli KRX, трансформированными плазмидами pACYC-29258-4506 и плазмидой pETDuet-SaTps8201 (А) или SaCP10374-CPRm-SaTps8201-pCWori (В). Хроматограммы демонстрируют образование (+)-α-санталена (21), (-)-β-санталена (25) и (-)-транс-α-бергамотена. (17), а также окисленных производных (19, 20, 23, 24, 27 и 28) (соответствующие структуры смотри на фигуре 27).

Фигура 27. Структура субстратов ферментов и продуктов обсуждается в тексте.

Подробное описание

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения сесквитерпена, в том числе α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола и ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 2. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 4. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 6. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 8. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 28. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 30. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 98% с SEQ ID NO: 32. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 34. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 36. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 38. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 40. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 42. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 44. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 50. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 52. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 54. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 58. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 60. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 62. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 64. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 66. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 68. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 71. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 73. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 79. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ получения α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование α-фарнезена, β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена и/или эпи-β-санталена с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с SEQ ID NO: 81. В отдельном варианте осуществления способ включает клетку, экспрессирующую данный полипептид.

Приведенные в данном документе нуклеотидные последовательности, которые используются для продуцирования полипептида, предназначенного для выработки спирта, имеют нуклеиновокислотную последовательность, идентичную не менее или по меньшей мере примерно на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 80. Нуклеотидные последовательности, приведенные в данном документе, являются гетерологичными в том смысле, что они обычно и при обычных условиях не продуцируются клеткой, в которой они экспрессируются здесь, и в большинстве случаев не являются эндогенными для клетки, в которую они вводятся, - обычно их получают из другой клетки или синтетическим путем.

В другом варианте осуществления предоставляется способ получения сесквитерпенового спирта, в том числе α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование транс-α-фарнезена, транс-β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена, эпи-β-санталена и/или β-бисаболена с полипептидом, обладающим Р450 монооксигеназной активностью, при этом вырабатываемый спирт содержит не менее или по меньшей мере около 36% цис-изомера и при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 73.

В другом варианте осуществления предоставляется способ получения сесквитерпенового спирта, в том числе α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование транс-α-фарнезена, транс-β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена, эпи-β-санталена и/или β-бисаболена с полипептидом, обладающим Р450 монооксигеназной активностью, при этом вырабатываемый спирт содержит не менее или по меньшей мере около 46% цис-изомера и при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 73.

В другом варианте осуществления предоставляется способ получения сесквитерпенового спирта, в том числе α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование транс-α-фарнезена, транс-β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена, эпи-β-санталена и/или β-бисаболена с полипептидом, обладающим Р450 монооксигеназной активностью, при этом вырабатываемый спирт содержит не менее или по меньшей мере около 50% цис-изомера и при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей мере около 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, и SEQ ID NO: 73.

В другом варианте осуществления предоставляется способ получения сесквитерпенового спирта, в том числе α-синенсола, β-синенсола, α-санталола, β-санталола, α-транс-бергамотола, эпи-β-санталола, ланцелола и/или их смесей, включающий контактирование транс-α-фарнезена, транс-β-фарнезена, α-санталена, β-санталена, α-транс-бергамотена, эпи-β-санталена и/или β-бисаболена с полипептидом, обладающим Р450 монооксигеназной активностью, при этом вырабатываемый спирт содержит не менее или по меньшей мере около 72% цис-изомера и при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее или по меньшей