Анти-pd-1-антитела, способ их получения и способ применения

Анти-pd-1-антитела, способ их получения и способ применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенные моноклональные антитела, в частности моноклональные антитела человека, которые специфически связываются с PD-1 с высокой аффинностью. Антитела согласно изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими антителами, или их антигенсвязывающими фрагментами и могут использоваться в качестве лекарственного средства в онкологии и иммуноонкологии, для терапии заболеваний, связанных с различными нарушениями пролиферации и развития клеток. Изобретение также относится к способам получения указанных антител и способу лечения заболеваний человека с помощью данных антител.

Уровень техники

Белок программируемой смерти 1 (PD-1) является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28, которое включает в себя также CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется активированными В-клетками, Т-клетками и миелоидными клетками (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). Первоначальные члены данного семейства, CD28 и ICOS, были обнаружены по функциональным действиям на увеличение пролиферации Т-клеток после добавления моноклональных антител (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10: 247-260). PD-1 был обнаружен скринингом на дифференциальную экспрессию в апоптотических клетках (Ishida et al. (1992) EMBO J 11: 3887-95). Другие члены данного семейства, CTLA-4 и BTLA, были обнаружены скринингом на дифференциальную экспрессию в цитотоксических Т-лимфоцитах и ТН1-клетках, соответственно. CD28, ICOS и CTLA-4, все, имеют неспаренный остаток цистеина, дающий возможность гомодимеризации. В противоположность этому, предполагается, что PD-1 существует в виде мономера, не имея неспаренного остатка цистеина, характерного для других членов семейства CD28.

PD-1 является трансмембранным белком типа I 55 кДа, который является частью суперсемейства генов Ig (Agata et al. (1996) Int Immunol 8: 765-72). PD-1 содержит мембранопроксимальный иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) и мембранодистальный мотив переключения на основе тирозина (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181: 1953-6; Vivier, E и Daeron, M (1997) Immunol Today 18: 286-91). PD-1, хотя и является структурно сходным с CTLA-4, лишен мотива MYPPPY, который является критическим для связывания В7-1 и В7-2. Были идентифицированы два лиганда для PD-1, PD-L1 и PD-L2, которые, как было показано, отрицательно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28.

Один лиганд для PD-1, PD-L1, является изобилующим в различных типах рака человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8: 787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к снижению количества инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, уменьшению опосредованной рецептором Т-клеток пролиферации и ускользанию от иммунологического надзора раковых клеток (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81: 281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 5094-100). Иммуносупрессия может быть обращена ингибированием локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и это действие является аддитивным при блокировании взаимодействия PD-1 с PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170: 1257-66).

PD-1 является ингибирующим членом семейства CD28, экспрессируемым на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). PD-1-недостаточные животные развивают различные аутоиммунные фенотипы, включая аутоиммунную кардиопатию и подобный волчанке синдром с артритом и нефритом (Nishimura et al. (1999) Immunity 11: 141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291: 319-22). Кроме того, было обнаружено, что PD-1 играет роль в аутоиммунном энцефаломиелите, системной красной волчанке, болезни трансплантат против хозяина (GVHD), диабете типа I и ревматоидном артрите (Salama et al. (2003) J Exp Med 198: 71-78; Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 13:510). Было показано, что в линии мышиных опухолевых В-клеток ITSM PD-1 является необходимым для блокирования BCR-опосредованного вхождения Са2+ и фосфорилирования тирозина, находящихся ниже по ходу процесса эффекторных молекул (Okazaki et al. (2001) PNAS 98: 13866-71).

В настоящее время существует ряд антител против PD-1, например, nivolumab (BMS-936558, MDX-1106 или ONO-4538; BMS), pembrolizumab (Merck).

Так в предшествующем уровне техники раскрыты моноклональные антитела против PD-1, состоящие из определенных аминокислотных последовательностей согласно международной заявке WO 2006/121168 (nivolumab, BMS), которые проявляют определенные полезные свойства. Такие свойства включают, например, высокую аффинность связывания с PD-1 человека, но отсутствие существенной перекрестной реактивности с CD28, CTLA-4 или ICOS человека. Кроме того, было показано, что данные антитела модулируют иммунные реакции. Таким образом, в данной заявке также описан способ модуляции иммунных реакций с использованием анти-PD-1-антител. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухолевых клеток in vivo с использованием анти-PD-1-антител.

Также в предшествующем уровне техники раскрыт выделенный PD-1-связывающий белок, описанный в международной заявке WO2009/114335 (pembrolizumab, Мерк), который содержит первую вариабельную область и вторую вариабельную область. Первая вариабельная область является тяжелой цепью с различными CDRs, а вторая представляет собой легкую цепь, также с различными CDRs.

Таким образом, является актуальной разработка антител, которые распознают PD-1, и способы применения таких агентов. Согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые специфически связываются с PD-1 и имеют преимущественные характеристики функциональной активности, аффинности, специфичности и стабильности в исследуемых тестах.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к моноклональным антителам человека, которые специфически связываются с PD-1. Такие антитела могут быть использованы для лечения онкологических и инфекционных заболеваний. По сравнению с существующими в настоящее время способами лечения таких заболеваний, включая лечение антителами, предполагается, что моноклональные антитела по настоящему изобретению могут обеспечить наилучший клинический ответ.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, обладающие способностью связываться с рецептором PD-1 человека, которые содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относиться к антителу или его фрагменту, которые содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относиться к антителу или его фрагменту, которые содержат в себе:

- последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO:7, и

- последовательность вариабельного домена легкой цепи, по меньшей мере на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относиться к антителу или его фрагменту, которые содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий фрагмент конкурирует за связывание или связывается с тем же эпитопом, что связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий фрагмент по меньшей мере на 90% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления настоящее изобретение связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления настоящее изобретение связывающий домен может быть гуманизирован.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуется тем, что оно относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент имеет последовательность тяжелой цепи, гомологичную не менее чем на 90% последовательности SEQ ID NO 9.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент имеет последовательность легкой цепи, гомологичную не менее чем на 90% последовательности SEQ ID NO 10.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc константная часть антитела или его фрагмента содержат любые мутации, понижающие или устраняющие любую из эффекторных функций ADCC, ADCP или CDC в сравнении с природной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc константная часть антитела или его фрагмента содержат мутации, увеличивающие значение фармакинетических параметров в животном или человеке, такие как t1/2β (час) или Cmax (мкг/мл).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют по меньшей мере одно из следующих свойств:

a) агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и хранении при Т=4°C в течение более чем 6 месяцев содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5% от исходного содержания в растворе;

b) агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и при повышении температуры до 37°C в течение более чем 2 недель содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5% от исходного содержания в растворе;

c) агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и повышении температуры до 50°С в течение более чем 6 часов содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5% от исходного содержания в растворе;

d) константу диссоциации при связывании с PD-1 человека KD не более 10^-9 (М);

e) кинетическую константу ассоциации при связывании с PD-1 человека kon(1/Ms) не менее 10⁵(1/Мс);

f) кинетическую константу диссоциации при связывании с PD-1 человека dis(1/s) не более 10^-4 (1/с).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое содержит любой антигенсвязывающий фрагмент антитела описанный ранее.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-14.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который содержит любую из выделенных молекул нуклеиновой кислоты описанную в данном документе.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяина, которая содержит любую нуклеотидную последовательность описанную в данном документе.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина, который включает трансфекцию подходящей исходной клетки экспрессионным вектором.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способ получения любого антитела описанного в данном документе, содержащий получение клетки-хозяина, культивирование клетки-хозяина, в условиях, достаточных для получения указанного антитела или его фрагмента, с последующим выделением и очисткой полученного антитела или его активного фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент антитела, описанные выше, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения онкологических и инфекционных заболеваний.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности PD-1 у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, который включает введение субъекту эффективного количества любого антитела описанного ранее в данном документе.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, который содержит введение пациенту любого антитела или антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции, описанные в данном документе.

Описание чертежей

Фиг. 1 - схема синтеза комбинаторной наивной библиотеки человека.

Фиг. 2 - фагмида для клонирования Fab фаговых дисплейных библиотек (А) и экспрессионная плазмида для наработки Fab (Б).

Фиг. 3 - электрофореграмма BCD-100 в восстанавливающих условиях (3А, 12% SDS-PAGE), в невосстанавливающих условиях (3Б, 8% SDS-PAGE).

Фиг. 4 - иммуноферментный анализ взаимодействия BCD-100 с PD1 и другими антигенами.

Фиг. 5 - реактивация NFAT-сигналинга анти-PD1 антителами в репортерной клеточной линии Jurkat-NFAT-PD1.

Фиг. 6 - стимуляция продукции ИЛ-2 ант-PD1 антителами в цельной крови человека в присутствии стафилококкового энтеротоксина

Фиг. 7 - анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) антитела против PD1 на линии клеток Jurkat-PD1.

Фиг. 8 - анализ взаимодействий кандидатов BCD-100 с FcRn и Fcγ-рецепторами на приборе Octet RED 96.

Фиг. 9 - иммуноферментный анализ взаимодействий BCD-100 с рецепторами PD1 разных организмов.

Фиг. 10 - иммуноферментный анализ взаимодействия BCD-100 с рецепторами из семейства CD28.

Фиг. 11 - анализ взаимодействий кандидатов BCD-100 с рецепторами PD1 человека и обезьяны циномолгуса на приборе Octet RED 96.

Фиг. 12 - результаты термостресса (50°C, 12 ч) молекулы BCD-100.

Подробное описание изобретения

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области. Примерные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут также использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе. Все публикации и другие ссылочные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены во всей их полноте путем отсылки. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет превалировать. Хотя в настоящем документе цитируется ряд документов, такое цитирование не является признанием того, что любой из этих документов образует часть общеизвестных знаний в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

В этом описании и вариантах осуществления изобретения слова «иметь» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Определения, связанные с антителами

Термины «программируемая гибель 1», «программируемая гибель клеток 1», «белок PD-1», «PD-1», «CD279», «PDCD1», «hPD-1» и «hPD-1» используются взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы, видовые гомологи PD-1 человека и аналоги, имеющие, по меньшей мере, один общий эпитоп с PD-1.

Термины «иммунный ответ», «аутоиммунная реакция» и «аутоиммунное воспаление» относятся, например, к действию лимфоцитов, антиген-представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, вырабатываемых указанными клетками или клетками печени (включая антитела, цитокины и комплемент, образующиеся в результате селективного повреждения, разрушения или элиминации из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей).

Термин «связывающая молекула» включает в себя антитела, иммуноглобулины и антигенсвязывающие части антитела. Термин «антитело» (Ab) или «иммуноглобулин» (Ig) при использовании в настоящем документе относится к тетрамеру, содержащему две тяжелые (Н) цепи (около 50-70 кДа) и две легкие (L) цепи (около 25 кДа), связанных друг с другом дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Домены VH и VL могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, именуемые «участками, определяющими комплементарность» (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, именуемые «каркасными областями» (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR-участков (H-CDR в данном документе обозначает CDR из тяжелой цепи и L-CDR в данном документе обозначает CDR из легкой цепи) и четырех каркасных областей FRs, отходящие от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Приписывание аминокислот к каждому региону может осуществляется в соответствии с определениями IMGT® (Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1): 55-77 (2003); или определениями Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); или Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989).

Термин «антитело» и «иммуноглобулин» являются взаимозаменяемыми в контексте данной заявки.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или «часть антитела», «фрагмент») при использовании в настоящем документе относится к одной или более частям или фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, PD1). Было показано, что некоторые фрагменты полноразмерного антитела могут выполнять функцию антигенсвязывающего антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином «антигенсвязывающая часть», включают (i) а Fab-фрагмент: моновалентный фрагмент, состоящий из V_L, V_H, C_L и C_H1 доменов; (ii) F (ab')₂-фрагмент: двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из V_H и C_H1 доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из V_L и V_H доменов одного плеча антитела, (v) фрагмент однодоменного антитела (dAb), который состоит из V_H домена; и (vi) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR), способный специфически связываться с антигеном. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов синтетическим линкером, который позволяет им иметь вид одной цепи белка, в которой V_L и V_H области спариваются, образуя одновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv)). Также в рамках данного изобретения представлены антигенсвязывающие молекулы, содержащие V- и/или V_L. В случае V_H, молекула может также содержать одну или более из СН1, шарнирной, СН2 или СН3 области. Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Также охватываются и другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой двухвалентные, биспецифичные антитела, в которых V_H и V_L домены экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для спаривания двух доменов одной и той же цепи, тем самым заставляя домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих участка. Участки антител, такие как Fab- и F(ab') 2-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе.

Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется из клетки или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности), которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.

Термин «вариантное» антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его «родительского» антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков относительно последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеций и/или замены осуществляются на CDR-участках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела.

Термин «химерное антитело» относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предпочтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных тел у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела.

Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, в частности, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR-участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR-участков. Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела в каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека, на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека.

Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR участков), чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR-участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. N-связанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N-гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как pH и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, в частности, Asn-Gly в последовательности CDR-участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.

В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела; см., например, обзор Almagro & Fransson, Front Biosci. 13: 1619-1633 (2008). Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR-участков, например, когда химерные антитела мышиного происхождения задействуют идентификацию человеческих зародышевых генных эквивалентов к мышиным генам вариабельного участка и трансплантацию последовательностей мышиных CDR-участков в этот каркас.Трансплантация CDR участка может быть основана на определениях CDR-участков по Kabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210 225 (2007)) предполагается, что определение no IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al. Dev. Comp Immunol. 27: 55-77 (2003)). В некоторых случаях, трансплантация CDR-участкка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR-участки. Обратные мутации (иногда именуемые «ремонт каркасного участка»), могут применяться в выбранных положениях CDR трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, для того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки.

В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно как «созревание аффинности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).

Термин «выделенный белок», «выделенный полипептид» или «выделенное антитело» относится к белку, полипептиду или антителу, которые в силу своего происхождения или источника получения, (1) не ассоциированы с ассоциированными в природе компонентами, сопутствующими им в нативном состоянии, (2) свободны от других белков того же вида, (3) экспрессированы клеткой другого вида или (4) не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, который химически синтезирован или синтезирован в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в природных условиях, будет «выделенным» из своих ассоциированных в природе компонентов. Белок может быть также по существу освобожден от ассоциированных в природе компонентов посредством выделения с использованием способов очистки белков, хорошо известных в данной области.

Используемый в данном документе термин «зародышевый» относится к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям генов антител и генных сегментов, как они передаются от родителей к потомству через зародышевые клетки. Последовательности зародышевой линии отличаются от нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела в зрелых В-клетках, которые были изменены в результате событий рекомбинации и сверхмутации во время созревания В-клеток. Антитело, которое «использует» конкретную последовательность зародышевой линии, имеет нуклеотидную и аминокислотную последовательности, которые согласовываются с той нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью зародышевой линии, которой более полно соответствуют, чем с любой другой нуклеотидной или аминокислотной последовательностей зародышевой линии.

Термин «аффинность» относится к измерению притяжения между антигеном и связывающей молекулой, например, антителом. Внутренняя способность к притяжению связывающей молекулы по отношению к антигену, как правило, выражается как константа равновесия аффинности связывания (KD) конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Считается, что связывающая молекула специфически связываться с антигеном, когда KD составляет ≤1 мМ, предпочтительно ≤100 нМ. AKD константа связывания аффинности может быть измерена, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcoreTM) или биослойной интерферометрии, например, с использованием системы ProteOnTM XPR36 SPR от Bio-Rad или системы OctetTM.

Термин «Ka», как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин «Kd» относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин «Kd» в данном описании относится к константе диссоциации, которую получают из отношения Kd к Ка (т.е. Kd/Ka), и ее выражают в виде молярной концентрации (М). Величины Kd для антител могут быть определены с использованием способов, хорошо установленных в данной области.

Предпочтительным способом определения Kd антитела является способ с использованием резонанса поверхностных плазмонов, предпочтительно с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore®.

Как использовано в данном описании, термин «высокая аффинность» в отношении IgG-антитела относится к антителу, имеющему Kd 10^-8М, более предпочтительно 10^-9М или менее и, даже более предпочтительно, 10^-10М или менее в отношении антигена-мишени. Однако «высокая аффинность» связывания может варьироваться для других изотипов антигена. Например, «высокая аффинность» связывания для изотипа IgM относится к антителу, имеющему KD 10^-7М или менее, более предпочтительно 10^-8 Мили менее, даже более предпочтительно 10^-9М или менее.

Термин «K_off» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff + можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.

Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула). Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи Сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным». В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном. Термин «эпитоп», как используется в данной заявке, кроме того, относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши ил