Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул

Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[Уровень техники]

Антитела привлекают внимание в качестве лекарственных средств, так как они обладают высокой стабильностью в плазме и обладают малым количеством побочных эффектов. В настоящее время ряд подобных фармацевтических средств IgG-типа являются коммерчески доступными и на сегодняшний день разрабатываются многие лекарственные средства на основе антител (непатентные документы 1 и 2). Между тем, описаны различные способы, применимые для второго поколения лекарственных средств на основе антител, включающие способы, которые усиливают эффекторную функцию, антигенсвязывающую способность, фармакокинетику и стабильность, и способы, которые снижают риск развития иммуногенности (непатентный документ 3). Как правило, требуемая доза лекарственного средства на основе антитела является очень высокой. Это, в свою очередь, привело к возникновению проблем, таких как высокая стоимость производства, а также к трудностям при получении подкожных составов. В теории, доза фармацевтического средства па основе антитела может быть снижена путем улучшения фармакокинетики антитела или повышения аффинности между антителами и антигенами.

В литературе описаны способы улучшения фармакокинетики антител с использованием искусственных замен аминокислот в константных областях (непатентные документы 4 и 5). Аналогично описано созревание аффинности как способ улучшения антигенсвязывающей способности или активности нейтрализации антигена (непатентный документ 6). Этот способ дает возможность увеличения антигенсвязывающей способности посредством внесения аминокислотной мутации в область CDR вариабельной области или сходные с ней. Повышение антигенсвязывающей способности обеспечивает улучшение биологической активности in vitro или обеспечивает возможность снижения дозы и дополнительно обеспечивает повышенную эффективность in vivo (непатентный документ 1).

Между тем, способность одной молекулы антитела нейтрализовать антиген зависит от ее аффинности. Путем увеличения аффинности антиген можно нейтрализовать меньшим количеством антитела. Для увеличения аффинности антитела можно использовать различные способы (непатентный документ 6). Кроме того, если бы аффинность можно было сделать бесконечной посредством ковалентного связывания антитела с антигеном, одна молекула антитела могла бы нейтрализовать одну молекулу антигена (двухвалентное антитело могло бы нейтрализовать две молекулы антигена). Однако, стехиометрия нейтрализации одного антитела против одного антигена (одного двухвалентного антитела против двух антигенов) является лимитирующим фактором для предшествующих способов, и, таким образом, было невозможно полностью нейтрализовать антиген количеством антитела, меньшим, чем количество антигена. Другими словами, эффект, усиливающий аффинность, имеет лимитирующее значение (непатентный документ 9). Для увеличения периода действия нейтрализующего эффекта нейтрализующего антитела в течение определенного периода антитело должно быть введено в дозе, более высокой, чем количество антигена, продуцируемое в организме в течение такого же периода. Таким образом, в случае просто описанного выше улучшения фармакокинетики антител или технологии созревания аффинности существуют ограничения, когда дело доходит до снижения требуемой дозы антитела. Таким образом, для поддержания эффекта антител в отношении нейтрализации антигена в течение заданного периода времени с помощью антител в количестве, меньшем, чем количество антигена, одно антитело должно нейтрализовать множество антигенов.

Недавно было описано антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом, в качестве нового способа для достижения описанной выше задачи (патентный документ 1). Антитела с рН-зависимым связыванием антигена, которые прочно связываются с антигеном при нейтральных условиях в плазме и диссоциируют от антигена при кислых условиях в эндосоме, могут диссоциировать от антигена в эндосоме. Когда антитело с рН-зависимым связыванием антигена диссоциирует от антигена и рециркулирует в плазму посредством FcRn, оно может повторно связываться с другим антителом. Таким образом, антитело может многократно связываться с несколькими антигенами.

Кроме того, время удержания антигена в плазме является очень коротким по сравнению со временем удержания антител, рециркулирующих в плазму путем связывания с FcRn. Если антитело с продолжительным временем удержания в плазме связывает такой антиген с коротким удержанием в плазме, время удержания в плазме комплекса антиген-антитело увеличивается на тот же период, что и время удержания в плазме антитела. Таким образом, путем связывания с антителом повышается время удержания антигена, и таким образом концентрация антигена в плазме увеличивается. В таких случаях, даже если увеличивается аффинность антигена к антителу, не может быть увеличена элиминация антигена из плазмы. Опубликовано, что описанные выше рН-зависимые антигенсвязывающие антитела более эффективны как способ увеличения элиминации антигена плазмы по сравнению с типичными антителами (патентный документ 1).

Таким образом, одно антитело с рН-зависимым связыванием антигена связывает ряд антигенов и способно, по сравнению с типичными антителами, облегчать элиминацию антигена в плазме. Таким образом, антитела с рН-зависимым связыванием имеют действие, которое нельзя осуществить посредством типичных антител. Однако единственным известным способом достижения эффекта многократного связывания антитела с рН-зависимым связыванием антигена и эффекта ускорения элиминации антигена из плазмы было обеспечение зависимости от реакции антиген-антитело с использованием различий в рН между плазмой и эндосомой. Документы, касающиеся известного уровня техники, относящиеся к настоящему изобретению, представлены ниже:

Документы уровня техники

[Патентные документы]

[Патентный документ 1] WO 2009/125825, ANTIGEN-BINDING MOLECULE CAPABLE OF BINDING TO TWO OR MORE ANTIGEN MOLECULES REPEATEDLY

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura В Faden & Matthew С Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073-1078 (2005)

[Непатентный документ 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr; 59(3): 389-96

[Непатентный документ 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31; 20(1): 17-29. Review

[Непатентный документ 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1; 176 (1): 346-56

[Непатентный документ 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15(7): 637-40

[Непатентный документ 6] Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jun 14; 102(24): 8466-71. Epub 2005 Jun 6. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R

[Непатентный документ 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. (2007) 368: 652-665

[Непатентный документ 8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec; 16(6): 631-6

[Непатентный документ 9] Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9; 334(4): 1004-13.

[Сущность изобретения]

[Проблемы, решаемые изобретением]

Настоящее изобретение было осуществлено ввиду вышеуказанных обстоятельств. Задачей настоящего изобретения является предоставление способов ускорения захвата антигена в клетки с использованием антигенсвязывающих молекул, способов увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой, способов ускорения снижения концентрации антигена в плазме путем введения антигенсвязывающих молекул, способов увеличения удержания в плазме антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающих молекул, которые способствуют захвату антигена в клетки, антигенсвязывающих молекул, которые имеют увеличенное количество раз связывания антигена, антигенсвязывающих молекул, которые способны ускорять снижение концентрации антигена в плазме при введении, антигенсвязывающих молекул с увеличенным временем нахождения в плазме, фармацевтических композиций, содержащих антигенсвязывающие молекулы и способов их получения.

[Средства для решения проблем]

Авторы настоящего изобретения провели исследования, посвященные способам ускорения захвата антигена в клетки с помощью антигенсвязывающих молекул (молекулы, такие как полипептиды, имеющие активность связывания антигена), способам увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой, способам ускорения снижения концентрации антигена в плазме путем введения антигенсвязывающих молекул, и способам увеличения времени удержания в плазме антигенсвязывающей молекулы. В результате авторы настоящего изобретения сфокусировались на различиях в концентрациях кальция между плазмой и ранней эндосомой, а затем открыли, что: захват антигена в клетки с помощью антигенсвязывающих молекул может быть ускорен с использованием антигенсвязывающих молекул, которые обладают зависимой от кальция реактивностью антиген-антитело; количество раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой может быть увеличено путем многократного связывания антигена антигенсвязывающей молекулой; снижение концентрации антигена в плазме может быть ускорено путем введения антигенсвязывающих молекул; и удержание в плазме антигенсвязывающей молекулы может быть увеличено.

В частности, настоящее изобретение относится к способам ускорения захвата антигена в клетки с использованием антигенсвязывающих молекул, которые обладают зависимой от кальция реактивностью антиген-антитело, способам увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой, способам ускорения снижения концентрации антигена в плазме путем введения антигенсвязывающих молекул, и способам повышения удержания в плазме антигенсвязывающих молекул, а также к антигенсвязывающим молекулам, которые обеспечивают усиленный захват антигена в клетки, антигенсвязывающим молекулам с увеличенным количеством раз связывания антигена, к антигенсвязывающим молекулам, которые могут ускорять снижение концентрации антигена в плазме при введении, антигенсвязывающим молекулам с увеличенным удержанием в плазме, фармацевтическим композициям, содержащим описанные выше антигенсвязывающие молекулы, и способам их получения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующему:

[1] антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен и домен, связывающий FcRn человека, активность связывания антигена которой отличается в условиях двух различных концентраций кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция, и которая обладает активностью связывания с FcRn человека в условиях нейтрального значения рН;

[2] антигенсвязывающая молекула согласно [1], где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ;

[3] антигенсвязывающая молекула согласно [1], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ;

[4] антигенсвязывающая молекула согласно [1] или [2], где низкая концентрация кальция представляет собой внутриэндосомальную концентрацию ионизированного кальция;

[5] антигенсвязывающая молекула согласно [1] или [3], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция в плазме;

[6] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [1]-[5], где FcRn-связывающий домен представляет собой Fc-область;

[7] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [1]-[6], где, дополнительно, антигенсвязывающая активность является более низкой в условиях кислого значения рН, чем в условиях нейтрального значения рН;

[8] антигенсвязывающая молекула согласно [7], где по меньшей мере одна аминокислота заменена гистидином или по меньшей мере один гистидин встроен в антигенсвязывающую молекулу;

[9] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [1]-[8], которая связывается с мембранным антигеном или растворимым антигеном;

[10] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [1]-[9], где антиген представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из IL-6R, IL-6, IgA, глипикана 3 человека и IgE;

[11] антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, активность связывания антигена которой отличается в двух различных условиях концентрации кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция, и где легкая цепь или тяжелая цепь антигенсвязывающего домена содержит кальций-связывающий мотив, происходящий из антитела человека;

[12] антигенсвязывающая молекула согласно [11], где кальций-связывающий мотив содержится в CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи антигенсвязывающего домена;

[13] антигенсвязывающая молекула согласно [12], где кальций-связывающий мотив содержится в положениях 30, 31 и/или 32 в соответствии с нумерацией по Kabat в CDR1 легкой цепи;

[14] антигенсвязывающая молекула согласно [12] или [13], где кальций-связывающий мотив содержится в положении 50 в соответствии с нумерацией по Kabat в CDR2 легкой цепи;

[15] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [12]-[14], где кальций-связывающий мотив содержится в положении 92 в соответствии с нумерацией но Kabat в CDR3 легкой цепи;

[16] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [12]-[15], которая представляет собой либо IgA, либо глипикан 3 человека;

[17] антигенсвязывающая молекула согласно [11], где кальций-связывающий мотив содержится в CDR1, CDR2 и/или CDR3 тяжелой цепи антигенсвязывающего домена;

[18] антигенсвязывающая молекула согласно [16], где кальций-связывающий мотив содержится в положениях 95, 96, 100а и/или 101 в соответствии с нумерацией по Kabat в CDR3 тяжелой цепи;

[19] антигенсвязывающая молекула согласно [17] или [18], которая представляет собой либо IL-6R, либо IL-6;

[20] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [11]-[19], которая содержит FcRn-связывающий домен, который обладает активностью связывания FcRn при нейтральном диапазоне значений pH;

[21] антигенсвязывающая молекула согласно [20], где FcRn-связывающий домен представляет собой Fc-область;

[22] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [1]-[10], [20] или [21], где одна или несколько аминокислот в положениях 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 (нумерация EU) в аминокислотной последовательности Fc-области отличаются от аминокислот в природной Fc-области;

[23] антигенсвязывающая молекула согласно [22], которая содержит любую или комбинацию из:

Met в положении аминокислоты 237;

Ile в положении аминокислоты 248;

Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr в положении аминокислоты 250;

Phe, Trp или Tyr в положении аминокислоты 252;

Thr в положении аминокислоты 254;

Glu в положении аминокислоты 255;

Asp, Glu или Gln в положении аминокислоты 256;

Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val в положении аминокислоты 257;

His в положении аминокислоты 258;

Ala в положении аминокислоты 265;

Ala или Glu в положении аминокислоты 286;

His в положении аминокислоты 289;

Ala в положении аминокислоты 297;

Ala в положении аминокислоты 303;

Ala в положении аминокислоты 305;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr в положении аминокислоты 307;

Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr в положении аминокислоты 308;

Ala, Asp, Glu, Pro или Arg в положении аминокислоты 309;

Ala, His или Ile в положении аминокислоты 311;

Ala или His в положении аминокислоты 312;

Lys или Arg в положении аминокислоты 314;

Ala, Asp или His в положении аминокислоты 315;

Ala в положении аминокислоты 317;

Val в положении аминокислоты 332;

Leu в положении аминокислоты 334;

His в положении аминокислоты 360;

Ala в положении аминокислоты 376;

Ala в положении аминокислоты 380;

Ala в положении аминокислоты 382;

Ala в положении аминокислоты 384;

Asp или His в положении аминокислоты 385;

Pro в положении аминокислоты 386;

Glu в положении аминокислоты 387;

Ala или Ser в положении аминокислоты 389;

Ala в положении аминокислоты 424;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в положении аминокислоты 428;

Lys в положении аминокислоты 433;

Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr в положении аминокислоты 434; или

His, Ile, Leu или Val в положении аминокислоты 436;

в соответствии с нумерацией EU в Fc-области;

[24] антигенсвязывающая молекула согласно любому из [1]-[23], где антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело;

[25] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, имеющей по меньшей мере одну функцию, выбранную из следующего:

(i) функция ускорения захвата антигена в клетки,

(ii) функция связывания антигена два или более раз,

(iii) функция ускорения снижения концентрации антигена в плазме, и

(iv) функция улучшения удержания в плазме,

где способ включает стадии (а)-(е), указанные ниже:

(a) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях низкой концентрации кальция;

(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях высокой концентрации кальция;

(c) отбор антигенсвязывающей молекулы, которая имеет более низкую антигенсвязывающую активность в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция;

(d) получение гена, кодирующего антигенсвязывающую молекулу, отобранную на стадии (с); и

(e) продуцирование антигенсвязывающей молекулы с использованием гена, полученного на стадии (d);

[26] способ получения антигенсвязывающей молекулы, имеющей по меньшей мере одну функцию, выбранную из следующего:

(i) функция ускорения захвата антигена в клетки,

(ii) функция связывания антигена два или более раз,

(iii) функция ускорения снижения концентрации антигена в плазме, и

(iv) функция улучшения удержания в плазме,

где способ включает стадии (а)-(е), указанные ниже:

(a) приведение антигена в контакт с антигенсвязывающей молекулой или библиотекой антигенсвязывающих молекул в условиях высокой концентрации кальция;

(b) помещение антигенсвязывающей молекулы, которая связывает антиген на стадии (а), в условия низкой концентрации кальция;

(c) получение антигенсвязывающей молекулы, которая диссоциирует на стадии (b);

(d) получение гена, кодирующего антигенсвязывающую молекулу, полученную на стадии (с); и

(e) получение антигенсвязывающей молекулы с использованием гена, полученного на стадии (d);

[27] способ получения антигенсвязывающей молекулы, имеющей по меньшей мере одну функцию, выбранную из слудующего:

(i) функция ускорения захвата антигена в клетки,

(ii) функция связывания антигена два или более раз,

(iii) функция ускорения снижения концентрации антигена в плазме, и

(iv) функция улучшения удержания в плазме, где способ включает стадии (a)-(f), указанные ниже:

(a) приведение антигена в контакт с антигенсвязывающей молекулой или библиотекой антигенсвязывающих молекул в условиях низкой концентрации кальция;

(b) отбор антигенсвязывающей молекулы, которая не связывается с антигеном на стадии (а);

(c) обеспечение связывания антигенсвязывающей молекулы, отобранной на стадии (b), с антигеном в условиях высокой концентрации кальция;

(d) получение антигенсвязывающей молекулы, которая связалась с антигеном на стадии (с);

(e) получение гена, кодирующего антигенсвязывающую молекулу, полученную на стадии (d); и

(f) продуцирование антигенсвязывающей молекулы с использованием гена, полученного на стадии (е);

[28] способ получения но любому из [25]-[27], который дополнительно включает стадию обеспечения или увеличения активности связывания FcRn человека в условиях нейтрального значения рН путем модификации аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле;

[29] способ получения согласно любому из [25]-[27], который дополнительно включает стадию снижения активности связывания в условиях кислого значения рН, чтобы она была более низкой, чем в условиях нейтрального значения рН, путем модификации аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле;

[30] способ получения согласно любому из [25]-[27], где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ;

[31] способ получения согласно любому из [25]-[27], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ;

[32] способ получения согласно любому из [25]-[27], где низкая концентрация кальция представляет собой внутриэндосомальную концентрацию ионизированного кальция;

[33] способ получения согласно любому из [25]-[27], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция в плазме;

[34] способ получения согласно [29], где модификация аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле представляет собой модификацию путем замены по меньшей мере одной аминокислоты гистидином или встраивания по меньшей мере одного гистидина в антигенсвязывающую молекулу;

[35] способ получения согласно любому из [25]-[34], где антиген, связываемый антигенсвязывающей молекулой, представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из IL-6R, IL-6, IgA, глипикана 3 человека и IgE;

[36] способ получения согласно любому из [25]-[35], где антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело;

[37] фармацевтическая композиция, содержащая:

антигенсвязывающую молекулу согласно любому из [1]-[24] или антигенсвязывающую молекулу, полученную способом получения согласно любому из [25]-[36], и фармацевтически приемлемый носитель;

[38] фармацевтическая композиция согласно [37] для применения для ускорения интернализации антигена в клетки;

[39] фармацевтическая композиция согласно [37] для применения для ускорения снижения концентрации антигена в плазме;

[40] фармацевтическая композиция для применения для ускорения захвата антигена в клетки или снижения концентрации антигена в плазме, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, активность связывания антигена которой отличается при двух различных концентрациях кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция;

[41] фармацевтическая композиция согласно [40], где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ;

[42] фармацевтическая композиция согласно [40], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ;

[43] фармацевтическая композиция согласно [40] или [41], где низкая концентрация кальция представляет собой внутриэндосомальную концентрацию ионизированного кальция;

[44] фармацевтическая композиция согласно [40] или [42], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция в плазме;

[45] фармацевтическая композиция согласно любому из [40]-[44], где FcRn-связывающий домен, содержащийся в антигенсвязывающей молекуле, представляет собой Fc-область;

[46] фармацевтическая композиция согласно любому из [40]-[45], где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более низкой в условиях кислого значения рН, чем в условиях нейтрального значения рН;

[47] фармацевтическая композиция согласно [46], где модификация аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле представляет собой модификацию путем замены по меньшей мере одной аминокислоты гистидином или встраивания по меньшей мере одного гистидина в антигенсвязывающую молекулу;

[48] фармацевтическая композиция согласно любому из [40]-[47], где антиген, с которым связывается антигенсвязывающая молекула, представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из IL-6R, IL-6, IgA, глипикана 3 человека и IgE;

[49] Способ скрининга антигенсвязывающей молекулы, которая имеет по меньшей мере одну функцию, выбранную из следующего:

(i) функция ускорения захвата антигена в клетки,

(ii) функция связывания антигена два или более раз,

(iii) функция ускорения снижения концентрации антигена в плазме, и

(iv) функция улучшения удержания в плазме,

где способ включает стадии (а)-(с), указанные ниже:

(a) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях низкой концентрации кальция;

(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях высокой концентрации кальция; и

(c) отбор антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которой является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция;

[50] способ скрининга антигенсвязывающей молекулы, которая имеет по меньшей мере одну функцию, выбранную из следующего:

(i) функция ускорения захвата антигена в клетки,

(ii) функция связывания антигена два или более раз,

(iii) функция ускорения снижения концентрации антигена в плазме, и

(iv) функция улучшения удержания в плазме,

где способ включает стадии (а)-(с), указанные ниже:

(a) приведение антигена в контакт с антигенсвязывающей молекулой или библиотекой антигенсвязывающих молекул в условиях высокой концентрации кальция;

(b) помещение антигенсвязывающей молекулы, которая связывает антиген на стадии (а) в условия низкой концентрации кальция; и

(c) получение антигенсвязывающей молекулы, которая диссоциирует на стадии (b);

[51] способ скрининга антигенсвязывающей молекулы, которая имеет по меньшей мере одну функцию, выбранную из следующего:

(i) функция ускорения захвата антигена в клетки,

(ii) функция связывания антигена два или более раз,

(iii) функция ускорения снижения концентрации антигена в плазме, и

(iv) функция улучшения удержания в плазме,

где способ включает стадии (а)-(d), указанные ниже:

(а) приведение антигена в контакт с антигенсвязывающей молекулой или библиотекой антигенсвязывающих молекул в условиях низкой концентрации кальция;

(b) отбор антигенсвязывающей молекулы, которая не связывает антиген на стадии (а);

(c) обеспечение связывания антигенсвязывающей молекулы, отобранной на стадии (b), с антигеном в условиях высокой концентрации кальция; и

(d) получение антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с антигеном на стадии (с);

[52] способ скрининга согласно любому из [49]-[51], где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ;

[53] способ скрининга согласно любому из [49]-[51], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ;

[54] способ скрининга согласно любому из [49]-[52], где низкая концентрация кальция представляет собой внутриэндосомальную концентрацию ионизированного кальция;

[55] способ скрининга согласно любому из [49]-[51] или [53], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция в плазме;

[56] способ скрининга согласно любому из [49]-[55], где антиген, с которым связывается антигенсвязывающая молекула, представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из IL-6R, IL-6, IgA, глипикана 3 человека и IgE;

[57] способ скрининга согласно любому из [49]-[56], где антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело;

[58] способ ускорения антигенсвязывающей молекулой захвата антигена в клетку путем введения антигенсвязывающей молекулы согласно любому из [1]-[24] или антигенсвязывающей молекулы, полученной способом получения согласно любому из [25]-[36];

[59] способ ускорения снижения концентрации антигена в плазме путем введения антигенсвязывающей молекулы согласно любому из [1]-[24] или антигенсвязывающей молекулы, полученной способом получения согласно любому из [25]-[36];

[60] способ увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой с использованием антигенсвязывающей молекулы согласно любому из [1]-[24] или антигенсвязывающей молекулы, полученной способом получения согласно любому из [25]-[36];

[61] способ увеличения удержания в плазме антигенсвязывающей молекулы с использованием антигенсвязывающей молекулы согласно любому из [1]-[24] или антигенсвязывающей молекулы, полученной способом получения согласно любому из [25]-[36];

[62] способ ускорения захвата антигена в клетку антигенсвязывающей молекулой путем введения антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, антигенсвязывающая активность которой отличается при двух различных концентрациях кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция;

[63] способ ускорения снижения концентрации антигена в плазме путем введения антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, антигенсвязывающая активность которой отличается при двух различных концентрациях кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция;

[64] способ увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой с использованием антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, антигенсвязывающая активность которой отличается при двух различных концентрациях кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция;

[65] способ увеличения удержания в плазме антигенсвязывающей молекулы с использованием антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, антигенсвязывающая активность которой отличается при двух различных концентрациях кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция;

[66] способ согласно любому из [62]-[65], где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ;

[67] способ согласно любому из [62]-[66], где высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ;

[68] способ согласно любому из [62]-[67], где низкая концентрация кальция представляет собой внутриэндосомальную концентрацию ионизированного кальция;

[69] способ согласно любому из [62]-[68], где высокая концентрация кальция представляет собой плазменную концентрацию ионизированного кальция;

[70] способ согласно любому из [62]-[69], где FcRn-связывающий домен антигенсвязывающей молекулы представляет собой Fc-область;

[71] способ согласно любому из [62]-[70], где, дополнительно, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более низкой в условиях кислого значения рН, чем в условиях нейтрального значения рН;

[72] способ согласно [71], где модификация аминокислот в антигенсвязывающей молекуле представляет собой модификацию путем замены по меньшей мере одной аминокислоты гистидином или встраивания по меньшей мере одного гистидина в антигенсвязывающую молекулу;

[73] способ согласно любому из [62]-[72], где антиген, с которым связывается антигенсвязывающая молекула, представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из IL-6R, IL-6, IgA, глипикана 3 человека и IgE; и

[74] способ согласно любому из [62]-[73], где антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело.

Более того, настоящее изобретение относится к наборам для применения в способах по настоящему изобретению, которые включают антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или антигенсвязывающую молекулу, полученную способами получения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к средствам для ускорения антигенсвязывающей молекулой захвата антигена в клетки, средствам для ускорения снижения концентрации антигена в плазме, средствам для увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой и средствам для повышения удержания антигенсвязывающей молекулы в плазме, все из которых содержат в качестве активного ингредиента антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или антигенсвязывающую молекулу, полученную способом по настоящему изобретению. Более того, настоящее изобретение относится к применению антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению или антигенсвязывающей молекулы, полученной способами получения по настоящему изобретению, для получения средств для ускорения антигенсвязывающей молекулой захвата антигена в клетки, средств для ускорения снижения концентрации антигена в плазме, средств для увеличения количества раз связывания антигена антигенсвязывающей молекулой или средств для увеличения удержания антигенсвязывающей молекулы в плазме. Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающим молекулам но настоящему изобретению или антигенсвязывающим молекулам, полученным способами получения по настоящему изобретению, для применения в способах по настоящему изобретению.

[Эффекты изобретения]

Настоящее изобретение относится к способам ускорения антигенсвязывающими молекулами захвата антигена в клетки, способам увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой, способам ускорения снижения концентрации антигена в плазме путем введения антигенсвязывающих молекул и способам увеличения удержания антигенсвязывающей молекулы в плазме. Ускорение захвата антигена в клетки антигенсвязывающими молекулами обеспечивает ускорение снижения концентрации антигена в плазме при введении антигенсвязывающих молекул, а также увеличение удержания в плазме антигенсвязывающей молекулы. Это может увеличить количество раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой. Таким образом, такие антигенсвязывающие молекулы могут обеспечивать превосходящие эффекты in vivo no сравнению с типичными антигенсвязывающими молекулами.

[Краткое описание чертежей]

На фиг. 1 представлена диаграмма, на которой показано, что антитело с рН-зависимым связыванием многократно связывается с растворимыми антигенами, (i) антитело связывается с растворимыми антигенами; (ii) антитело неспецифически интернализуется в клетку путем пиноцитоза; (iii) антитело связывается с FcRn в эндосомах, а затем растворимые антигены диссоциируют от антитела; (iv) растворимые антигены переносятся в лизосомы и деградируются; (v) после диссоциации от растворимых антигенов антитело рециклирует в плазму через FcRn; (vi) рециклированное антитело может вновь связываться с растворимыми антигенами.

На фиг. 2 представлена диаграмма, на которой показано, что антитело с рН-зависимым связыванием многократно связывается с мембранными антигенами, (i) Антитело связывается с мембранными антигенами; (ii) антитело инторнализуется в клетку в комплексе с мембранными антигенами; (iii) антитело диссоциирует от мембранных антигенов в эндосоме; (iv) мембранные антигены переносятся в лизосому и деградируются; (v) после диссоциации от мембранных антигенов антитело рециклирует в плазму; (vi) рециклированное антитело может вновь связываться с мембранными антигенами.

На фиг. 3 представлена диаграмма, на которой показаны способы взаимодействия в плазме (рН 7,4) и эндосоме (рН 6,0) антигена и антитела с рН-зависимым связыванием.

На фиг. 4 представлена диаграмма, на которой показаны способы взаимодействия в плазме (Са²⁺ 2 мМ) и эндосоме (Са²⁺ 3 мкМ) антигена и антитела с кальций-зависимым связыванием.

На фиг. 5 представлена диаграмма, на которой показаны способы взаимодействия в плазме (рН 7,4, Са²⁺ 2 мМ) и энцосоме (рН 6,0, Са²⁺ 3 мкМ) антигена и антитела с рН и кальций-зависимым связыванием.

На фиг. 6 представлены сенсограммы Biacore, на которых показано взаимодействие антител против рецептора IL-6 человека с растворимым рецептором IL-6 человека в условиях (Са²⁺ 2 мМ) и (Са²⁺ 3 мкМ).

На фиг. 7 представлена сенсограмма Biacore, на которой показано взаимодействие H54/L28-IgG1 с растворимым рецептором IL-6 человека в условиях (Са²⁺ 2 мМ) и (Са²⁺ 3 мкМ).

На фиг. 8 представлена сенсограмма Biacore, на которой показано взаимодействие FH4-IgG1 с растворимым рецептором IL-6 человека в условиях (Ca²⁺ 2 мМ) и (Са²⁺ 3 мкМ).

На фиг. 9 представлена сенсограмма Biacore, на которой показано взаимодействие 6RL#9-IgG1 с растворимым рецептором IL-6 чел