Способ выделения гликозаминогликанов из вторичных коллагенсодержащих отходов

Способ выделения гликозаминогликанов из вторичных коллагенсодержащих отходов

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к технологии выделения биологически активных соединений, и может быть использовано для изготовления лекарственных средств или биологически активных веществ, действие которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани.

Различные биохимические изменения, наблюдаемые в соединительной ткани с возрастом, непосредственно влияют на процесс старения и возникновение при этом определенных патологических процессов.

Заболевания опорно-двигательного аппарата являются существенной причиной преждевременной потери трудоспособности и инвалидности. В связи с наблюдаемым существенным постарением населения вопросы профилактики и лечения данного заболевания приобретают особую актуальность.

Для остановки разрушения хрящевой ткани и восстановления ее структуры с успехом применяются хондропротекторы - препараты, действие которых направлено на питание и образование новых клеток хрящевой ткани, а также на выработку синовиальной жидкости - смазки сустава.

Гликозаминогликаны (ГАГ), выделяемые из различного сырья, применяются в составе препаратов с целью хондропротекторного действия на соединительную ткань. Доказано, что после 20 лет у человека практически в 6 раз уменьшается обмен гликозаминогликанов в сравнении с новорожденными, что соответственно приводит к развитию заболевание опорно-двигательного аппарата.

На сегодняшний день существуют различные способы выделения гликозаминогликанов. Однако известные технологии продолжительны по времени, а сырье, используемое для выделения, является достаточно дорогим.

Так, известен (RU, патент 2089201, опубл. 10.09.1997) способ выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща путем протеолиза измельченного образца папаином, депротеинизации гидролизата трихлоруксусной кислотой и осаждения гликозаминогликанов этанолом.

Недостатками такого способа является невысокий выход гликозаминогликанов. Также метод не позволяет удалить белковые фракции, что значительно уменьшает чистоту конечного продукта.

Известен способ выделения сульфатированных полисахаридов из животных тканей (RU, патент 2056851, опубл. 27.03.1996). Способ заключается в том, что гидролиз роговиц активированным папаином проводят после добавления 2,5%-ного раствора папаина на 1 кг сырого веса ткани, после чего гидролизат кипятят 10-15 мин, добавляют к нему трихлоруксусную кислоту и после отделения осадка диализуют против смеси 1 н хлористого натрия и спирта в соотношении 7:3, насыщенного хлористого натрия и дистиллированной воды.

Недостатки способа: трудоемкость, использование достаточно дорогого сырья, а также не высокий выход целевого продукта.

Также известен способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей (RU, патент 2273486, опубл. 10.04.2006). Способ включает механическую очистку ткани, размельчение, отмывку буферным раствором, обработку ферментным папаином, диализ, осаждение этанола и центрифугирование, высушивают и фасуют.

К недостаткам способа можно отнести то, что для проведения ферментативного гидролиза сырья используется один фермент папин, который не обеспечивает максимального выхода гликозаминогликанов из биологических тканей.

Известен способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани (RU, патент 2325902, опубл. 10.06.2008). Способ включает ферментативный гидролиз ферментом пепсином, депротеинизацию сульфатом аммония, осаждение 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле, переосаждение этанолом и лиофильную сушку.

Недостатком способа является высокая продолжительность ферментативного гидролиза, что значительно увеличивает время проведения исследований.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов (RU, патент 2304441, опубл. 20.08.2007), который заключается в механической очистке биологических тканей, промывкой фосфатным буфером, отмывке, гидролизе отмытой ткани активированным папаином, осаждении этанолом, отделение осадка и высушивание.

Данный способ не обеспечивает максимального выхода гликозаминогликанов из сырья, за счет использования одного фермента при проведении ферментативного гидролиза.

Задачей настоящего изобретения является разработка технологии выделения гликозаминогликанов высокого качества из дешевого вторичного коллагенсодержащего сырья.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного способа, состоит в получении выхода до 98% гликозаминогликанов высокой степени очистки.

Технический результат достигается тем, что были подобраны такие технологические режимы переработки биологической ткани, которые позволяют уменьшить продолжительность процесса выделения ГАГ, увеличить выход ГАГ из сырья с высокой степенью очистки, а также снизить стоимость готового продукта по сравнению с известными аналогами за счет использования более дешевого сырья для выделения ГАГ.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ, согласно которому биологическую ткань, являющуюся отходами животноводства (шкуры, жилки, фасции, хрящи и т.п.), очищают от примесей и измельчают через мясорубку или нарезанием на небольшие кусочки, измельченную ткань промывают фосфатным буфером и подвергают ферментативному гидролизу выбранными ферментами, осаждают ГАГ 96%-ным этиловым спиртом, после чего осадок отделяют центрифугированием и переосаждают этанолом, снова собирают и высушивают на распылительной сушилке Mini Spray Dryer В-290, после чего проводят очистку ГАГ с помощью гель-хроматографии.

Разработанный способ реализуют следующим образом.

Вторичное коллагенсодержащее сырье (шкуры, жилки, фасции, хрящи и т.п.) удаляют от посторонних примесей и измельчают. Затем измельченную ткань промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 при температуре 60-65°С в соотношении 1:2 в течение 20-30 минут. Данная стадия использована для того, чтобы обеспечить больший выход ГАГ из сырья и уменьшить время воздействия ферментов на сырье. Далее проводят ферментативный гидролиз выбранными ферментами (коллагеназа и папаин) в концентрации 200 ед/г в течение 6-10 часов при температуре 40°С и рН 6,5-7,5. При этом ферменты вносятся последовательно, что обеспечивает полное разрушение ткани и высокий выход ГАГ. Далее ГАГ осаждают 96%-ным этиловым спиртом, осадок центрифугируют, переосаждают этанолом, осадок собирают и высушивают на распылительной сушилке. После чего проводят разделение и очистку ГАГ с помощью гель-хроматографии, что позволяет достичь величин степени очистки ГАГ от балластных веществ и белковых фракций до 98%.

Пример выполнения

Вторичное коллагенсодержащее сырье очищают от посторонних примесей и измельчают на мясорубке или нарезанием на мелкие кусочки, размером не более 5×5 мм. Очищенную и измельченную ткань промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 при температуре 60-65°С в соотношении 1:2 в течение 20-30 минут.

Промытую ткань подвергают ферментативному гидролизу ферментами (коллагеназа и папаин). Ферментативный гидролиз проводят при последовательном добавлении ферментов. Сначала гидролиз ведут при внесении фермента коллагеназы в концентрации 200 ед/г при рН 7,5 и температуре 40-50°С в течение 3-5 часов, а затем вносят папаин в концентрации 200 ед/г и проводят гидролиз при рН 6,5 и температуре 40-50°С в течение 3-5 часов. Ферментативный гидролиз ведут при постоянном перемешивании. Далее ГАГ осаждают 96%-ным этиловым спиртом при температуре 20-25°С в течение 1,0-3,0 часов, а осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10-30 минут.

Полученный осадок отбирают и проводят переосаждение этанолом, для чего осадок промывают 96%-ным этилом спиртом 3-6 раз, а затем осадок фильтруют для отделения от спирта и снова центрифугируют в течение 5-10 минут.

Осадок высушивают на распылительной сушилке Mini Spray Dryer В-290 при следующих параметрах: температура входа - 250-300°С, температура выхода - 180-220°С, скорость воздушного потока - 45-55 м³/ч, скорость подачи раствора - 35-40 мл/мин.

Очистку полученных ГАГ осуществляют гель-хроматографией с использованием сефадекса G25. Элюирование проводят дистиллированной водой со скоростью 6 мл/мин. Регистрация гликозаминогликанов осуществляется путем определения оптической плотности элюата спектрофотоместрически на детекторе при длине волны λ=220 нм. Полученные после проведения гель-хроматографии фракции ГАГ высушивают на распылительной сушилке. Степень очистки фракций составляет до 98%, при этом содержание белка либо не определялось, либо не превышает 0,03%, что существенным образом не повлияет на качество конечного продукта.

Сравнение разработанного способа выделения ГАГ из вторичного коллагенсодержащего сырья для обоснования достижения указанного технического результата проведено с ближайшим аналогом.

Таким образом, установлено, что предлагаемый способ выделения ГАГ из биологических тканей позволяет получить высококачественные и высокоочищенные ГАГ для использования в медицине для создания биологически активных веществ или лекарственных препаратов.

Способ выделения гликозаминогликанов из вторичного коллагенсодержащего сырья, включающий промывку и очистку исходного сырья, ферментативный гидролиз, осаждение этанолом, отличающийся тем, что после очистки и измельчения сырье промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 при температуре 60-65°C в соотношении 1:2 объема буфера в течение 20-30 минут, затем проводят ферментативный гидролиз в течение 6-10 часов при 40-50°C и рН 6,5-7,5, используя ферменты коллагеназу и папаин в концентрации 200 ед/г, вносимые последовательно, осаждение гликозаминогликанов проводят 96%-ным этиловым спиртом при температуре 20-25°C в течение 1,0-3,0 часов, переосаждают этанолом, высушивают на распылительной сушилке при температуре входа 250-300°C, температуре выхода 180-220°C, скорость воздушного потока 45-55 м³/ч, скорость подачи раствора 35-40 мл/мин, разделяют и очищают гликозаминогликаны на гель-хроматографии с использованием сефадекса G25 и высушивают на распылительной сушилке.