Антитела к тау и способы применения

Антитела к тау и способы применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам к тау, таким как антитела, которые связываются с фосфорилированным эпитопом на тау-белке с высокой специфичностью и/или высокой аффинностью, и способам их применения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Нейрофибриллярные клубки и нити нейропилей (НК) являются основными нейропатологическими признаками болезни Альцгеймера (БА). НК состоят из тау-белка, ассоциированного с микротрубочками, который подвергся посттрансляционным модификациям, включая фосфорилирование, и развиваются путем агрегации гиперфосфорилированных конфомеров тау. Эта патология является общей для БА и многих нейродегенеративных таупатий, в частности, конкретных типов лобно-височных деменций (ЛВД). Тау-белок, по-видимому, является основным игроком в гибели когнитивных функций при БА и родственных нейродегенеративных таупатиях.

Терапевтические подходы, которые нацелены на тау-белок, являются редкими и включают в себя, в основном, ингибиторы киназ, которые, как считают, повышают фосфорилирование тау до патологических уровней, и соединения, которые блокируют цитоплазматическую агрегацию гиперфосфорилированного тау-белка. Эти подходы страдают различными недостатками, связанными со специфичностью и эффективностью. Ранее были описаны антитела мыши, которые связываются с фосфорилированными патологическими конфомерами тау, например, в WO 2012/045882. Однако все еще существует потребность в дополнительной пассивной и/или активной иммунотерапии, которая работает как противодействие патологическим конфомерам белка, о которых известно или предполагается, что они вызывают нейродегенеративные нарушения, такие как амилоидная патология при БА, вызванная, например, внутринейронными агрегатами гиперфосфорилированного тау-белка, которые являются типичными при БА в виде амилоида.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам к тау, таким как антитела, которые связываются с фосфорилированным эпитопом на тау-белке с высокой специфичностью и/или высокой аффинностью, и способам их применения.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к изолированному антителу, которое связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка, где антитело, содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где: (a) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность X₁SSQX₂LX₃X₄X₅X₆GX₇TYX₈H (SEQ ID NO:89), где X₁=R или T; X₂=S, R или V; X₃=V, I или R; X₄=H или R; X₅=S, R, G или; X₆=H, N, R, K или G; X₇=K или R; и X₈=L или V; (b) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность KVX₉X₁₀RFX₁₁ (SEQ ID NO:90), где X₉=S, K или R; X₁₀=N, K или H; и X₁₁=S, F, G, K, R, Y или L; и (c) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SQTX₁₂X₁₃FPX₁₄T (SEQ ID NO:91), где X₁₂=A или R; X₁₃=H, R, Q или Y; X₁₄=Y или R; и где антитело не содержит HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где аминокислотная последовательность HVR-L1 представляет собой RSSQSLVHSHGTYLH (SEQ ID NO:15) или RSSQRLVHSHGTYLH (SEQ ID NO:92); аминокислотная последовательность HVR-L2 представляет собой VSNRFS (SEQ ID NO:16); и аминокислотная последовательность HVR-L3 представляет собой SQTAHFPYT (SEQ ID NO:30).

В определенных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка, который включает фосфорилированный аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из серина в положении 409 тау человека (SEQ ID NO:59), серина в положении 404 тау человека (SEQ ID NO:59) и серина в положении 404 и 409 тау человека (SEQ ID NO:59).

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:33); HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность DINPNRGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:34); и HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность YYAVGY (SEQ ID NO:35).

В конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где (a) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14; (b) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, и (c) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32.

В конкретных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где (a) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14; (b) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, и (c) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:16; и (c) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:27.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17; и (c) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:27.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:8; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:21; и (c) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:29.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:14; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:25; и (c) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:31.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:9; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17; и (c) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:31.

В конкретных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:54, и SEQ ID NO:55, или VL, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:54 и SEQ ID NO:55.

В определенном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) из SEQ ID NO:58 или последовательность VH, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:58.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. В конкретных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое или гуманизированное антитело.

В конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG1. В других конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG4. В других конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG1 N297G. Еще в других конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, который связывается с фосфорилированным эпитопом на тау-белке человека.

В определенных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с тау-белком, который представляет собой тау-белок человека (например, тау-белок из SEQ ID NO:59).

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка, но не связывается с тем же самым эпитопом тау-белка, который не фосфорилирован. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка, но связывается с тем же самым эпитопом тау-белка, который не фосфорилирован, по существу, со сниженной аффинностью. В конкретных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка, где тау-белок содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:59. В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белком человека, содержащим аминокислотные остатки 404-411 (SEQ ID NO:59).

В конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка с Kd приблизительно от 1 нМ до 45 нМ. В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка с Kd≤1 нМ. В конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка с константой скорости диссоциации ≤5×10^-3 с^-1. В конкретных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению связывается с фосфорилированным эпитопом тау-белка с константой скорости ассоциации ≥3×10⁵ М^-1⋅с^-1 или ≥7×10⁵ М^-1⋅с^-1.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с тау-белком, который представляет собой агрегированный ассоциированный с микротрубочками и/или гиперфосфорилированный тау-белок, такой как тау-белок, который присутствует в парных спиральных филаментах (ПСФ).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте, кодирующей любое из антител, описываемых в настоящем документе.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из антител, описываемых в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения антитела, включающим культивирование такой клетки-хозяина таким образом, что вырабатывается антитело.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему любое из антител, описываемых в настоящем документе, и цитотоксическое средство.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему любое из антител, описываемых в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к антителу, описываемому в настоящем документе (любому из антител, описываемых в настоящем документе), для применения в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с тау-белком, у индивидуума. В конкретных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для лечения таупатии у индивидуума. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения для лечения болезни Альцгеймера (БА) у индивидуума. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения для лечения лобно-височной деменции (ЛВД) у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения для лечения ухудшения или потери когнитивных функций у индивидуума. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения для снижения или модулирования общих уровней тау-белка в головном мозге индивидуума. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения для снижения или модулирования общих уровней фосфорилированного или гиперфосфорилированного тау-белка в головном мозге индивидуума.

В определенных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения у индивидуума, выбранных из заболевания или нарушения, ассоциированного с тау-белком, таупатии, БА, ЛВД и ухудшения или потери когнитивных функций у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения в производстве лекарственного средства для снижения или модулирования общих уровней тау-белка в головном мозге индивидуума. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению предназначено для применения в производстве лекарственного средства для снижения или модулирования общих уровней фосфорилированного или гиперфосфорилированного тау-белка в головном мозге индивидуума.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума с заболеванием или нарушением, выбранным из заболевания или нарушения, ассоциированного с тау-белком, таупатии, БА, ЛВД и ухудшения или потери когнитивных функций, способам, включающим введение индивидууму эффективного количества антитела, описываемого в настоящем документе (любого из антител, описываемых в настоящем документе). В одном из вариантов осуществления заболевание или нарушение, которое лечат в соответствии со способами по изобретению, представляет собой БА.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам снижения уровней общего тау-белка, фосфорилированного тау-белка или гиперфосфорилированного тау-белка в головном мозге индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества антитела, описываемого в настоящем документе (любого из антител, описываемых в настоящем документе) для снижения уровней общего тау-белка, фосфорилированного тау-белка или гиперфосфорилированного тау-белка в головном мозге индивидуума. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам модулирования уровней общего тау-белка, фосфорилированного тау-белка или гиперфосфорилированного тау-белка в головном мозге индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества антитела, описываемого в настоящем документе (любого из антител, описываемых в настоящем документе), для модулирования уровней общего тау-белка, фосфорилированного тау-белка или гиперфосфорилированного тау-белка в головном мозге индивидуума.

В конкретных вариантах осуществления индивидуум, которого лечат в соответствии со способами, описываемыми в настоящем документе, является человеком. В конкретных вариантах осуществления, антитела предназначены для введения человеку. В конкретных вариантах осуществления, применения, описываемые в настоящем документе, предназначены для лечения человека.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителам для применения для детекции нейрофибриллярных клубков, нитей нейропилей и/или дистрофического неврита. В некоторых вариантах осуществления антитело, описываемое в настоящем документе (любое из антител, описываемых в настоящем документе), предназначено для применения для детекции заболевания или нарушения, ассоциированного с тау-белком, таупатии, БА, ЛВД. В конкретном варианте осуществления антитело, описываемое в настоящем документе (любое из антител, описываемых в настоящем документе), предназначено для применения для детекции БА.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 (A-C) показывает выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи, включая CDR, антитела 5202.4 и аффинно зрелых вариантов 5202.4 к pTau, т.е. от TAM1 до TAM23. Антитело 5202.4 имеет такую же вариабельную область тяжелой и легкой цепей, что и антитело hACI-36-2B6-Ab1, описанное в PCT/US 13/32341, поданной 15 марта 2013 года. Нумерация остатков приведена в соответствии с системой Kabat. Аминокислотные последовательности CDR указаны как "Kabat-CDR L1", "Kabat-CDR L2" и "Kabat-CDR L3". Остатки CDR анти-pTau аффинно зрелых вариантов, которые отличаются от последовательности 5202.4, выделены (см. остатки в черных рамках).

Фигура 2 (A-F). Связывание антител IgG с тау, фосфорилированным тау и pS129 альфа-синуклеином при измерении посредством ELISA. На фигуре 2 представлено связывание IgG1 5202.4, TAM1, TAM2, TAM9, TAM19, TAM20 и контроля (антитела 5B6 к gD) с нефосфорилированным полноразмерным тау, PKA-фосфорилированным полноразмерным тау, гиперфосфорилированным полноразмерным тау, монофосфорилированным (pS129) альфа-синуклеином или с непокрытой плашкой/BSA контролем.

Фигура 3. Связывание иммобилизованных антител IgG с биотинилированными пептидами, полученными из тау и содержащими pS404 и/или pS409, при измерении посредством ELISA. На фигуре 3 представлено связывание иммобилизованных антител IgG1 5202.4, TAM1, TAM2, TAM9, TAM19, TAM20 и контроля (5B6 анти-gD и без IgG) с биотинилированными пептидами, полученными из тау, включая пептиды, фосфорилированные как по серину 404, так и по серину 409 (pS404, pS409), пептиды, фосфорилированные по серину 404 (pS404), пептиды, фосфорилированные по серину 409 (pS409), нефосфорилированные пептиды или непептидный контроль. Использовали 10 нМ биотинилированных пептидов, показанных на фигуре 3, и 5 мкг/мл IgG.

Фигура 4 (A-E). Связывание антител IgG с иммобилизованными пептидами, полученными из тау и содержащими pS404 и/или pS409, при измерении посредством ELISA. На фигуре 4 представлено связывание иммобилизованных антител IgG1 5202.4, TAM1, TAM2, TAM9, TAM19, TAM20 и контроля (5B6 анти-gD и без IgG) с биотинилированными пептидами, полученными из тау, включая пептиды, фосфорилированные как по серину 404, так и по серину 409 (pS404, pS409), пептиды, фосфорилированные по серину 404 (pS404), пептиды, фосфорилированные по серину 409 (pS409), нефосфорилированные пептиды, непептидный контроль или фоновый контроль. Для каждого эксперимента связывания использовали 20 нМ биотинилированных пептидов и 5 различных концентраций IgG (т.е. 0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ и 100 нМ IgG).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

"Акцепторный каркас человека" для целей настоящего документа представляет собой каркас, содержащий аминокислотную последовательность из каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученного из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, как определено ниже. Акцепторный каркас человека "полученный из" каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека может содержать такую же аминокислотную последовательность, или может содержать замены в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления число аминокислотных замен составляет 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше, или 2 или меньше. В некоторых вариантах осуществления акцепторный каркас VL человека идентичен по последовательности с каркасом VL иммуноглобулина человека или с последовательностью консенсусного каркаса человека.

"Аффинность" относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между единичным участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иначе, применяемая в настоящем документе, "аффинность связывания", относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитело и антиген). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно представить посредством константы диссоциации (Kd). Аффинность можно измерять путем общепринятых, известных в данной области способов, включая способы, описываемые в настоящем документе. Конкретные примеры и иллюстративные варианты осуществления для измерения аффинности связывания описаны ниже.

"Аффинно зрелое" антитело относится к антителу с одним или более изменениями в одной или более гипервариабельных областях (HVR), в сравнении с родительским антителом, которое не обладает такими изменениями; такие изменения приводят к улучшению аффинности антитела к антигену.

Термины "антитело к тау" и "антитело, которое связывается с тау" относятся к антителу, которое способно к связыванию с тау с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело подходит в качестве диагностического и/или терапевтического средства, нацеленного на тау. В одном из вариантов осуществления степень связывания антитела к тау с неродственным, не-тау-белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с тау при измерении, например, радиоиммунологическим анализом (РИА). В определенных вариантах осуществления антитело, которое связывается с тау, имеет константу диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например 10^-8 M или меньше, например от 10^-8 M до 10^-13 M, например от 10^-9 M до 10^-13 M). В определенных вариантах осуществления антитело к тау связывается с эпитопом тау, который является консервативным среди тау от разных видов. Термин "антитело/антитела к тау" включает антитело/антитела к pTau.

Термины "антитело к pTau" и "антитело, которое связывается с pTau" относятся к антителу, которое способно к связыванию с фосфорилированными эпитопами тау с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело подходит в качестве диагностического и/или терапевтического средства, нацеленного на pTau. В одном из вариантов осуществления степень связывания антитела к pTau с не- pTau-белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с pTau при измерении, например, радиоиммунологическим анализом (РИА). В определенных вариантах осуществления антитело, которое связывается с pTau имеет константу диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например 10^-8 M или меньше, например от 10^-8 M до 10^-13 M, например от 10^-9 M до 10^-13 M). В определенных вариантах осуществления антитело к pTau связывается с фосфорилированным эпитопом тау, который является консервативным среди тау от разных видов. В определенных вариантах осуществления антитело к pTau избирательно связывается с фосфоформой тау или эпитопом тау, который содержит фосфорилированные аминокислотные остатки. В других вариантах осуществления антитело к pTau не связывается, или связывается, по существу, со сниженной аффинностью с нефосфорилированным тау или эпитопом тау, который не фосфорилирован, по сравнению с фосфорилированным тау, фосфоформой тау или эпитопом тау, который содержит фосфорилированные аминокислотные остатки. В некоторых вариантах осуществления фосфорилированный тау или эпитоп тау содержит фосфорилированные серины в аминокислотных положениях 404, 409 или 404 и 409 аминокислотной последовательности тау человека.

Термин "антитело" в настоящем документе применяется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая в качестве неограничивающих примеров моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например биспецифические антитела), и фрагменты антител при условии, что они проявляют желательную антигенсвязывающую активность.

"Фрагмент антитела" относится к молекуле, иной чем интактное антитело, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител в качестве неограничивающих примеров включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например scFv) и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

"Антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом", что и референсное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание референсного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или больше, и наоборот, референсное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или больше. Пример конкурентного анализа приведен в настоящем документе.

Термин "модулирующее антитело" относится к антителу или его функциональному фрагменту, как описано в настоящем документе в различных вариантах осуществления, который может или усиливать (например, активировать или стимулировать), угнетать (например, ингибировать или подавлять) или иным образом менять функциональное свойство, биологическую активность или уровень растворимого и/или нерастворимого тау-белка, в частности, растворимого фосфорилированного тау-белка в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе животного, в частности, млекопитающего или человека с повышенными уровнями растворимого тау-белка и/или растворимого фосфорилированного тау-белка. Модулирующее антитело или его функциональный фрагмент может действовать, модулируя непосредственно или косвенно тау-белок или полипептид, кодирующий указанный тау-белок. В определенных вариантах осуществления модулирующее антитело или его функциональный фрагмент снижает уровни растворимого и нерастворимого тау-белка, в частности, растворимого фосфорилированного тау-белка в головном мозге, в частности, в коре головного мозга и/или гиппокампе животного, в частности, млекопитающего или человека с повышенными уровнями растворимого тау-белка и/или растворимого фосфорилированного тау-белка.

Фразы "по существу снижает" или "по существу различные", как применяют в настоящем документе, означает достаточно высокую степень различия между двумя числовыми значениями (как правило, одно, ассоциированное с молекулой и другое, ассоциированное с референсной молекулой/молекулой сравнения), такую, что специалист в данной области будет рассматривать разницу между двумя значениями как статистически значимую по отношению к биологической характеристике, которая измеряется указанными значениями (например, значения Kd). Различие между двумя указанными значениями, например, составляет больше чем приблизительно 10%, больше чем приблизительно 20%, больше чем приблизительно 30%, больше чем приблизительно 40% и/или больше чем приблизительно 50% в виде функции значения для референсной молекулы/молекулы сравнения.

"Аффинность связывания", как правило, относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между единичным участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иначе, применяемая в настоящем документе, "аффинность связывания", относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитело и антиген). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно представить посредством константы диссоциации (Kd). Аффинность можно измерять путем общепринятых, известных в данной области способов, включая способы, описываемые в настоящем документе. Низкоаффинные антитела, как правило, связываются с антигеном медленно и имеет тенденцию к легкой диссоциации, в то время как высокоаффинные антитела, как правило, связываются с антигеном быстрее и имеют тенденцию оставаться в связанном состоянии дольше. В данной области известен ряд способов для измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать для целей по настоящему изобретению. Конкретные иллюстративные варианты осуществления описаны ниже. В одном из вариантов осуществления "Kd" или "значение Kd" по настоящему изобретению измеряют путем анализа связывания с антигеном с радиоактивной меткой (РИА), который проводят с Fab-версией интересующего антитела и его антигеном, как описано в последующем анализе. Аффинность связывания раствора Fab к антигену можно измерять, в одном примере, путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (¹²⁵I)-меченного антигена в присутствии серии титров немеченого антигена, затем захвата связавшегося антигена на планшет, покрытый антителом против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Для определения условий для анализа, планшеты для микротитрования (Dynex) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл захватывающим антителом к Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбоната натрия (pH 9,6), и затем блокируют 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) смешивают 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I]-антигена с серийными разведениями интересующего Fab (например, в соответствии с оценкой антитела к VEGF, Fab-12, у Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab, представляющий интерес, затем инкубируют в течение ночи, однако, инкубация может продолжаться в течение более длительного периода (например 65 часов), чтобы гарантировать достижение равновесия. После этого смеси переносят на планшет для захвата для инкубации при комнатной температуре (например в течение одного часа). Затем удаляют раствор и промывают планшет 8 раз 0,1% Tween-20 в PBS. После высыхания планшетов добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MicroScint-20; Packard), и считают планшеты на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут.

Концентрации каждого Fab, которые дают 20% от максимального связывания или меньше, выбирают для использования в анализах конкурентного связывания. По другому варианту осуществления значение Kd или Kd можно измерять с использованием анализов поверхностного плазмонного резонанса при помощи BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) по инструкциям производителя или при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). В кратком изложении, карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (CM5, BIAcore Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) по инструкциям поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инжекцией при скорости потока 5 мкл/минуту, для того чтобы достичь приблизительно 10 единиц ответа (RU) спаренного белка. После инжекции антигена инжектируют 1 M этаноламин, для того чтобы заблокировать непрореагировавшие группы. Для измерения кинетики, инжектируют двухкратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) можно рассчитать с использованием простой модели связывания Лэнгмюра «один-к-одному» (BIAcore Evaluation Software version 3.2) путем одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) можно рассчитать как отношение K_off/K_on См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Если скорость прямой реакции превышает 10⁶ M^-1⋅с^-1 по вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса, то скорость прямой реакции можно определять с использованием способа гашения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресценции (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C с 20 нМ антитела к антигену (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена при измерении в спектрофотометре, таком как спектрофотометр с остановкой потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco (ThermoSpectronic) серии 8000 с перемешивающей кюветой.

"Скорость прямой реакции" или "скорость ассоциации" или "k_on" по настоящему изобретению можно также определять путем того же вышеописанного способа поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore(TM)-2000 или BIAcore(TM)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). В кратком изложении, карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (CM5, BIAcore Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) по инструкциям поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инжекцией при скорости потока 5 мкл/минуту, для того чтобы достичь приблизительно 10 единиц ответа (RU) спаренного белка. После инжекции антигена инжектируют 1 M этаноламин, для того чтобы заблокировать непрореагировавшие группы. Для измерения кинетики, инжектируют двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) можно рассчитать с использованием простой модели связывания Лэнгмюра «один-к-одному» (BIAcore Evaluation Software version 3.2) путем одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) можно рассчитать как отношение K_off/K_on См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Однако, если скорость прямой реакции превышает 10⁶M^-1 с^-1 по вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса, то скорость прямой реакции можно определять с использованием способа гашения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресценции (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C с 20 нМ антитела к антигену (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена при измерении в спектрофотометре, таком как спектрофотометр с остановкой потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco (ThermoSpectronic) серии 8000 с перемешивающей кюветой.

Термин "химерное" антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или вида, в то время как остаток тяжелой и/или легкой цепи получен из другого источника или вида.

"Класс" антитела относится к типу константного домена или константной области, принадлежащей тяжелой цепи антитела. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из этих классов можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Применяемый в настоящем документе термин "цитотоксическое средство" относится к веществу, которое ингибирует или блокирует функцию клеток и/или вызывает гибель или разрушение клеток. Цитотоксические средства включают, но не ограничиваются радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркаляторы), ингибирующие рост средства, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики, токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые средства, описанные ниже.

"Эффекторные функции" относятся к видам биологической активности, связанным с Fc-областью антитела, которые меняются с изотипом антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание Clq и обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC), связывание с Fc-рецептором, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, негативную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточный рецептор) и активацию B-клеток.

"Эффективное количество" вещества, например, фармацевтического состава, относится к количеству, которое в необходимых дозах в течение необходимых перио