2662660 - Генетический тест накопления меди в печени у собак

Генетический тест накопления меди в печени у собак

Иллюстрации

Показать все

Изобретения касаются способа тестирования собаки для определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени с использованием установления наличия определенного полиморфизма, применения такого полиморфизма для определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени, способа тестирования собаки и способа отбора. Представленные способы или применения включают (i) генотипирование образца ДНК от собаки по одному или более полиморфизмам, выбранным из Chr22_3167534 (представленного положением 101 в SEQ ID NO: 144), наличие аллеля А указывает на предрасположенность к накоплению меди в печени, Chr22_3135144 (представленного положением 101 в SEQ ID NO: 145), наличие аллеля G указывает на предрасположенность к накоплению меди в печени, и повтора CGCCCC в хромосомном положении 22:3135287, наличие по меньшей мере одного дополнительного повтора указывает на предрасположенность к накоплению меди в печени с использованием специфического связывающего средства, которое выбирают из зонда или комбинации праймеров и которое способно обнаруживать или способствовать обнаружению выбранного полиморфизма, и (ii) определение по результатам стадии генотипирования, является ли собака предрасположенной к накоплению меди в печени. Изобретения обеспечивают возможность идентификации собак с риском развития или не защищенных от таких заболеваний или патологических состояний печени, как хронический гепатит, цирроз печени или печеночная недостаточность. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 10 ил., 21 табл., 6 пр.

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способу определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени и ассоциированному с медью заболеванию печени или вероятности защищенности собаки от них.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Медь представляет собой важный микроэлемент для ряда метаболических процессов в организме и, по существу, является неотъемлемой частью пищевого рациона. После всасывания в кишечнике медь в основном запасается в печени, хотя ее также можно найти в других тканях, таких как костный мозг, мышцы и селезенка. Кроме запасания меди, печень играет центральную роль в координации транспорта и выведении меди посредством церулоплазмина и солей желчных кислот, соответственно. Как правило, дефицит меди является более частой проблемой, чем токсичность. Однако токсичность встречается и может иметь серьезные последствия для пораженного животного.

Хотя заболевания печени у собак являются нечастыми, одной из их наиболее частых форм является хронический гепатит (CH). CH представляет собой гистологический диагноз, характеризуемый присутствием фиброза, воспаления и печеночно-клеточного апоптоза и некроза. В качестве конечной стадии заболевания может образовываться цирроз. Одной из причин CH является накопление меди в печени.

Накопление меди в печени может являться результатом увеличенного захвата меди, первичного метаболического дефекта в метаболизме меди в печени или измененного выведения меди через желчные пути. В последнем случае токсичность меди является вторичным относительно воспаления печени, фиброза печени и холестаза, хотя неясно насколько это может происходить у собаки. При вторичной болезни накопления меди накопление меди в основном ограничено перипортальной паренхимой, и концентрации меди в печени являются более низкими, чем при наследственных болезнях накопления. Хотя природа инициирующего фактора(ов) и сенсибилизирующего антигена неизвестна, одновременно с иммуноопосредованным механизмом образуются иммунологические аномалии и морфологические особенности, наблюдаемые при первичном биллиарном циррозе.

Тонкий кишечник у млекопитающих общепризнан в качестве основного участка всасывания поступающей с пищей меди. Перенос из просвета кишечника в слизистую кишечника представляет собой опосредованный носителем процесс, включающий компонент насыщаемого переноса. После попадания в клетки слизистой приблизительно 80% вновь всасываемой меди находится в цитозоле, в основном связанной с металлотионеинами (MT). Они представляют собой низкомолекулярные индуцибельные белки со множеством функций, включая гомеостаз, накопление, перенос и нейтрализацию металлов. После прохождения через энтероциты медь попадает в кровоток в системе воротной вены, где она связана с пептидами и аминокислотами белков-носителей, и происходит ее перенос в печень с меньшими количествами, попадающими в почки. У большинства млекопитающих медь легко выделяется и основным путем ее выделения является желчь.

Собак с избыточным накоплением меди в печени, как правило, лечат D-пеницилламином, мощным хелатором меди. Однако, в конечном счете, наиболее успешным лечением, доступным для собак с CH, является трансплантация печени.

Генетическая основа накопления меди в печени неизвестна. Ее сложно установить вследствие того факта, что медь вовлечена во множество различных биологических путей, каждый из которых является очень сложным и включает большое количество генов.

В WO 2009/044152 A2 описан способ определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени, включающий детекцию наличия или отсутствия (a) полиморфизма в генах GOLGA5, ATP7a или UBL5 собаки, что является показателем предрасположенности к накоплению меди в печени, и/или (b) полиморфизма в неравновесном сцеплении с указанным полиморфизмом (a), и таким образом определение предрасположенности собаки к накоплению меди в печени.

В WO 2010/038032 A1 и WO 2010/116137 A1 описаны дополнительные полиморфизмы для применения в способе определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени. Также в них описаны полиморфизмы для применения в способе определения вероятности того, что собака защищена от накопления меди в печени.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения выявили в геноме собаки ряд полиморфизмов, которые ассоциированы с предрасположенностью к накоплению меди в печени. Также они выявили в геноме собаки полиморфизмы, которые ассоциированы с защитой от накопления меди в печени. Выявление этих полиморфизмов обеспечивает основу теста для прогноза предрасположенности собаки к накоплению или вероятности защиты собаки от накопления меди в печени посредством скрининга полиморфизмов. Прогностическую силу теста можно увеличить с использованием моделей, которые включают комбинирование результатов детекции одного или более из определенных полиморфизмов. Генетический тест, в котором комбинированы результаты детекции одного или более полиморфизмов, являющихся показателем защиты от накопления меди в печени, с результатами детекции одного или более полиморфизмов, являющихся показателем предрасположенности к накоплению меди в печени у собак, может быть особенно информативным в отношении вероятности того, что у собаки существует риск накопления меди в печени.

Накопление меди в печени собаки может приводить к одному или более заболеваниям или патологическим состояниям печени, которые обусловлены высоким содержанием меди в печени. Например, высокое содержание меди в печени может приводить к хроническому гепатиту, циррозу печени и в конечном итоге к печеночной недостаточности. Таким образом, изобретение обеспечивает идентификацию собак с риском развития или не защищенных от таких заболеваний или патологических состояний печени, которые ассоциированы с высоким содержанием меди. После идентификации предрасположенности собаки к накоплению меди в печени или после идентификации собаки как не несущей одной или более мутаций, являющихся показателем защиты от накопления меди в печени, для этой собаки можно определять подходящие профилактические меры с целью поддержания уровня меди в печени на низком или нормальном уровне, например, посредством кормления кормом с низким содержанием меди (например, корм, описанный в WO 2009/044152 A2). Кроме того, собаки, которых идентифицировали как не несущих мутаций, ассоциированных с предрасположенностью к накоплению меди в печени, или которых идентифицировали как несущих мутации, ассоциированные с защитой от накопления меди в печени, являются идеальными для применения в селекционных программах с целью получения собак, у которых снижена вероятность возникновения заболевания печени или других патологических состояний, ассоциированных с высоким содержанием меди.

Таким образом, изобретение относится к способу тестирования собаки для определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени, включающему детекцию в образце присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из:

(a) Chr22_3167534 (SEQ ID NO: 144), Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145), Chr20_55461150 (SEQ ID NO: 146), ChrX_120879711 (SEQ ID NO: 147), Chr19_6078084 (SEQ ID NO: 148), Chr15_62625262 (SEQ ID NO: 149), Chr14_39437543 (SEQ ID NO: 150), Chr15_62625024 (SEQ ID NO: 151), Chr3_86838677 (SEQ ID NO: 152), Chr24_4011833 (SEQ ID NO: 153), Chr18_60812198 (SEQ ID NO: 154), Chr10_65209946 (SEQ ID NO: 155) и повтора CGCCCC в хромосомном положении 22:3135287;

(b) одного или более полиморфизмов в неравновесном сцеплении с указанным полиморфизмом (a); и/или

Изобретение также относится к

- базе данных, содержащей информацию об одном или более полиморфизмах, как определено в настоящем документе, и их ассоциации с предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени;

- способу определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени, включающему:

(a) введение в компьютерную систему данных о присутствии или отсутствии в геноме собаки одного или более полиморфизмов, как определено в настоящем документе;

(b) сравнение данных с компьютерной базой данных, которая содержит информацию об одном или более полиморфизмах, как определено в настоящем документе, и их ассоциации с предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени; и

- компьютерной программе, содержащей средства программного, которые при исполнении на компьютерной системе дают команду компьютерной системе на исполнение способа по изобретению;

- компьютерному носителю данных, содержащему компьютерную программу по изобретению и базу данных по изобретению;

- компьютерной системе, настроенной на исполнение способа по изобретению, содержащей:

(a) средства для введения данных о присутствии или отсутствии в геноме собаки полиморфизма, как определено в настоящем документе;

(b) базу данных, содержащую информацию об одном или более полиморфизмах, как определено в настоящем документе, и их ассоциации с предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени;

(d) средства для определения на основании указанного сравнения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени;

- способу определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени, включающему детекцию в образце присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из полиморфизмов, как определено в настоящем документе;

- использованию одного или более полиморфизмов, выбранных из полиморфизмов, как определено в настоящем документе, для определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени; и

- способу отбора собаки для получения потомства с высокой вероятностью защиты от накопления меди в печени, включающему:

- определение способом по изобретению содержания в геноме первой собаки-кандидата одного или более полиморфизмов, являющихся показателем предрасположенности к накоплению меди в печени, и таким образом определение того, что первая собака-кандидат является подходящей для получения потомства с высокой вероятностью защиты от накопления меди в печени;

- необязательно, определение способом по изобретению содержания в геноме второй собаки противоположного первой собаке пола одного или более полиморфизмов, являющихся показателем предрасположенности к накоплению меди в печени; и

- необязательно, спаривание первой собаки со второй собакой для получения потомства с высокой вероятностью защиты от накопления меди в печени.

Авторы изобретения выявили полиморфизмы, ассоциированные с защитой собаки от накопления меди в печени. Таким образом, изобретение относится к способу тестирования собаки для определения вероятности того, что собака защищена от накопления меди в печени, включающему детекцию в образце присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из (a) Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145) и (b) одного или более полиморфизмов в неравновесном сцеплении с (a).

Изобретение также относится к

- базе данных, содержащей информацию об одном или более полиморфизмах, как определено в настоящем документе, и их ассоциации с защитой собаки от накопления меди в печени или предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени;

- способу определения вероятности того, что собака защищена от накопления меди в печени, где способ включает:

(b) сравнение данных с компьютерной базой данных, которая содержит информацию об одном или более полиморфизмах, как определено в настоящем документе, и их ассоциации с защитой собаки от накопления меди в печени или предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени; и

- компьютерной системе, настроенной на исполнение способа по изобретению, содержащей:

(a) средства для введения данных о присутствии или отсутствии в геноме собаки одного или более полиморфизмов, как определено в настоящем документе;

(b) базу данных, содержащую информацию об указанных полиморфизмах и их ассоциации с защитой собаки от накопления меди в печени или предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени;

(d) средства для определения на основании указанного сравнения вероятности защиты собаки от накопления меди в печени;

- способу определения вероятности того, что собака защищена от накопления меди в печени, включающему определение присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из (a) Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145) и (b) одного или более полиморфизмов в неравновесном сцеплении с (a);

- использование полиморфизма, как определено в настоящем документе, для определения вероятности защиты собаки от накопления меди в печени; и

- определение способом по изобретению содержания в геноме первой собаки-кандидата одного или более полиморфизмов, являющихся показателем защиты от накопления меди в печени, и таким образом определение того, что первая собака-кандидат является подходящей для получения потомства с высокой вероятностью защиты от накопления меди в печени;

- необязательно, определение способом по изобретению содержания в геноме второй собаки противоположного первой собаке пола одного или более полиморфизмов, являющихся показателем защиты от накопления меди в печени; и

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведены средние уровни содержания меди по полу и генотипу ATP7A у лабрадоров-ретриверов (данные из таблицы 9), Ось y представляет собой содержание меди в массе сухого вещества печени (мг/кг). Ось x представляет собой генотип ATP7A: слева направо, первые три столбца представляют данные для самок собак в исследовании, а последние два столбца представляют данные для самцов собак в исследовании, Величины ошибок представляют собой стандартную ошибку.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму размаха гистологических оценок содержания меди по полу и генотипу ATP7A у лабрадоров-ретриверов (данные из таблицы 9). Ось y представляет собой значения гистологических оценок содержания меди. Ось x представляет собой генотип ATP7A: слева направо, первые три столбца представляют данные для самок собак в исследовании, а последние два столбца представляют данные для самцов собак в исследовании. Значение p по Крускалу-Уоллису составляет 0,000396.

На фиг. 3 представлен кодирующий повтор переменной длины в ATP7B. Верх: Основания и соответствующие им аминокислоты (AA). Хромосомное положение заключенного в рамку C представляет собой 3135287, Низ: в Ensembl, NCBI и при секвенировании бигля и группы лабрадоров выявлено различное количество повторов CGCCCC. Как следствие, заключенные в рамку аминокислоты аланин (A) и пролин (P) представлены в большем или меньшем количестве. SEQ ID NO: 236, 237 и 238 представляют собой полинуклеотидные последовательности, содержащие два, три и четыре повтора соответственно.

На фиг. 4 представлено положение повтора CGCCCC в ATP7B между ассоциированными с тяжелыми металлами доменами 3 и 4.

На фиг. 5 представлен SNP ATP7B 4145G>A (Chr22_3167534). Вертикальная черта с правого края указывает примерное положение мутации. Замена G>A приводит к замене на аминокислоту глутамин (AA).

На фиг. 6 представлена структура LD первых 15 м.п.н. хромосомы 22. Стрелки наверху треугольника указывают положение кодирующих мутаций. Линия, указанная стрелками, представляет высокое LD кодирующих мутаций с несколькими SNP в области.

На фиг. 7 представлено действие количества аллелей риска на количественный уровень меди в печени. Ось x представляет собой количество аллелей риска, а ось y представляет собой количество меди в печени в мг/кг, Горизонтальная линия указывает нормальный уровень меди в печени 400 мг/кг.

На фиг. 8 представлено пошаговое моделирование гистологической оценки меди, X1-X17 представляют собой факторы из таблицы 21.

На фиг. 9 представлен пошаговое моделирование логарифмического количественного оценки меди, X1-X17 представляют собой факторы из таблицы 21.

На фиг. 10 схематически представлены варианты осуществления функциональных компонентов, настроенных на осуществление настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1-5 представляют полинуклеотидные последовательности, содержащие SNP, используемые в трехобластной модели в примере 2, а также находящиеся в таблице 4.

SEQ ID NO: 6-141 представляют полинуклеотидные последовательности, содержащие дополнительные SNP, которые можно использовать для определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени. Эти последовательности также представлены в таблицах 5 и 6.

SEQ ID NO: 142 представляет собой полинуклеотидную последовательность SNP кодирующей области ATP7A, который ассоциирован с защитой собаки от накопления меди в печени (ChrX_63338063). Эта последовательность также представлена в таблице 8.

SEQ ID NO: 143 представляет собой полинуклеотидную последовательность SNP (ChrX_63397393 ATP7a_Reg16_F_42), находящегося в неравновесном сцеплении с SNP ChrX_63338063. Эта последовательность также представлена в таблице 8.

SEQ ID NO: 144-158 представляют полинуклеотидные последовательности, содержащие SNP по изобретению. Эти последовательности также представлены в таблице 18.

SEQ ID NO: 159-226 представляют полинуклеотидные последовательности, содержащие SNP, находящиеся в неравновесном сцеплении с SNP в таблице 18. Эти последовательности также представлены в таблице 20.

SEQ ID NO: 227-235 представляют собой последовательности праймеров.

SEQ ID NO: 236, 237 и 238 представляют собой полинуклеотиды, содержащие два, три или четыре повтора CGCCCC соответственно для последовательности повторов в положении 22:3135287 в геноме. Эти последовательности также представлены в таблице 12.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Идентификация предрасположенности к накоплению или защиты от накопления меди в печени

Накопление меди в печени приводит к заболеванию печени у ряда пород собак, включая лабрадоров-ретриверов, доберманов-пинчеров, немецких овчарок, кейсхондов, коккер-спаниелей, белых высокогорных терьеров, бедлингтон-терьеров и скайтерьеров. Средняя концентрация меди в печени нормальных собак любой породы составляет от 200 до 400 мг/кг массы сухого вещества, хотя у новорожденных, как правило, содержатся более высокие концентрации меди в печени. Количество меди в печени собаки можно измерять посредством биопсии.

У собаки, предрасположенной к накоплению меди в печени, существует тенденция к накоплению меди так, что концентрация меди в ее печени достигает уровня выше 400 мг/кг массы сухого вещества. Определение предрасположенности собаки к накоплению меди в печени по изобретению включает определение риска или вероятности того, что медь в печени собаки будет накапливаться до уровня выше 400 мг/кг, например выше 600 мг/кг, выше 800 мг/кг, выше 1000 мг/кг, выше 1500 мг/кг, выше 2000 мг/кг, выше 5000 мг/кг или выше 10000 мг/кг.

У собаки, защищенной от накопления меди в печени, существует низкие риск или вероятность накопления меди в печени так, что концентрация меди в ее печени с меньшей вероятностью достигает уровня выше 400 мг/кг массы сухого вещества. Концентрация меди в печени собаки, защищенной от накопления меди в печени, составляет ниже 600 мг/кг, например ниже 500 мг/кг, ниже 400 мг/кг или ниже 300 мг/кг. Определение вероятности защиты собаки от накопления меди в печени по изобретению включает определение вероятности того, что медь в печени собаки будет накапливаться до уровня ниже 600 мг/кг, например ниже 500 мг/кг, ниже 400 мг/кг или ниже 300 мг/кг.

Накопление меди в печени можно оценивать гистохимически. Например, концентрацию меди в печени можно полуколичественно гистохимически оценивать с использованием способа окрашивания рубеановым водородом для оценки распределения меди, как описано ранее (Van den Ingh et al., (1988) Vet Q 10: 84-89). Концентрацию можно ранжировать по шкале от 0 до 5 следующим образом: 0 = медь отсутствует; 1 = единичные клетки печени и/или ретикулогистиоцитарные (RHS) клетки, содержащие незначительное количество содержащих медь гранул; 2 = небольшие группы клеток печени и/или RHS клеток, содержащих от небольших до умеренных количеств содержащих медь гранул; 3 = более крупные группы или области клеток печени и/или RHS клеток, содержащих умеренные количества содержащих медь гранул; 4 = большие области клеток печени и/или RHS клеток с множеством содержащих медь гранул и 5 = наличие диффузных клеток печени и/или RHS клеток со множеством содержащих медь гранул. По этой системе градации оценки содержания меди выше 2 являются аномальными.

Таким образом, определение вероятности защиты собаки от накопления меди в печени по изобретению может включать определение вероятности того, что у собаки с использованием системы градации, описанной в Van den Ingh et al., можно получить оценку менее или равную 3, например менее чем или равную 2,5, 2, 1,5, или менее или равную 1. Определение предрасположенности собаки к накоплению меди в печени по изобретению может включать определение риска или вероятности того, что у собаки с использованием системы градации, описанной в Van den Ingh et al. можно получить оценку большую или равную 2, например большую или равную 2,5, 3, 3,5, или большую или равную 4.

Вероятность защиты или предрасположенности можно выражать, например, в виде фактора риска, процентного содержания или вероятности. Можно определять происходит или нет у собаки накопление меди до описанных выше уровней. Например, способ определения предрасположенности собаки к накоплению или вероятности защиты собаки от накопления меди в печени может включать определение накопления или отсутствия накопления у собаки меди до уровня выше 400 мг/кг.

Накопление меди в печени до уровня выше 400 мг/кг ассоциировано с заболеванием печени и в конечном итоге может приводить к печеночной недостаточности. Таким образом, определение наличия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, являющихся показателем защиты от накопления меди в печени, означает, что у собаки с меньшей вероятностью разовьется заболевание или патологическое состояние, обусловленное накоплением меди в печени, такое как хронический гепатит, цирроз и печеночная недостаточность. И наоборот, определение содержания в геноме собаки одного или более полиморфизмов, являющихся показателем предрасположенности к накоплению меди в печени, означает предрасположенность собаки к такому заболеванию или патологическому состоянию. Таким образом, изобретение относится к способу тестирования предрасположенности собаки к заболеванию, ассоциированному с накоплением меди в печени, такому как хронический гепатит, цирроз и печеночная недостаточность, или вероятности защиты собаки от него.

Полиморфизмы и показатель предрасположенности к накоплению или защиты от накопления меди

Авторы изобретения выявили в геноме собаки ряд полиморфизмов, ассоциированных с предрасположенностью к накоплению меди в печени. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени с использованием одного или более полиморфных маркеров в этих положениях в геноме.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу тестирования собаки для определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени, включающему детекцию в образце присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из:

(b) одного или более полиморфизмов в неравновесном сцеплении с указанным полиморфизмом (a); и/или

Также авторы изобретения выявили в геноме собаки полиморфизмы, которые ассоциированы с защитой от накопления меди в печени. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу определения вероятности того, что собака защищена от накопления меди в печени с использованием одного или более полиморфных маркеров в этих положениях в геноме.

Таким образом, изобретение также относится к способу тестирования собаки для определения вероятности того, что собака защищена от накопления меди в печени, включающему детекцию в образце присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из (a) Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145) и (b) одного или более полиморфизмов в неравновесном сцеплении с (a).

Как правило, фраза "детекция присутствия или отсутствия полиморфизма" означает определение присутствия полиморфизма в геноме собаки. Полиморфизмы включают однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), микросателлиты или полиморфизмы повторов, инсерционные полиморфизмы и делеционные полиморфизмы.

Предпочтительно полиморфизм представляет собой SNP. Детекция присутствия или отсутствия SNP означает генотипирование SNP или типирование нуклеотида(ов), присутствующих в геноме собаки, на SNP. Как правило, необходимо определять нуклеотид, находящийся в одном и том же положении на обеих гомологичных хромосомах. Другими словами, генотипируют один или оба аллеля и на основе генотипирования определяют состав одного или обоих аллелей. Собаку можно определять как гомозиготную по первому аллелю, гетерозиготную или гомозиготную по второму аллелю SNP. Когда полиморфизм представляет собой микросателлит или последовательность повторов, как правило, способ включает определение количества повторов.

Определение фенотипа индивидуума, такого как предрасположенность индивидуума к заболеванию или патологическому состоянию или защита индивидуума от заболевания или патологического состояния, не ограничено детекцией полиморфизма, являющегося причиной заболевания или патологического состояния. В исследованиях генетического картирования в выборке индивидуумов на ассоциацию с данным фенотипом тестируют генетическую изменчивость в наборе маркерных локусов. Если такую ассоциацию между конкретным маркерным локусом и фенотипом находят, это позволяют предположить, что или изменчивость в данном маркерном локусе воздействует на представляющий интерес фенотип, или что изменчивость в данном маркерном локусе находится в неравновесном сцеплении с реально связанным с фенотипом локусом, который не был генотипирован. В случае группы полиморфизмов, которые находятся в неравновесном сцеплении друг с другом, знание о наличии всех таких полиморфизмов у конкретного индивидуума, как правило, обеспечивает избыточную информацию. Таким образом, при определении содержания в геноме собаки одного или более полиморфизмов, являющихся показателем предрасположенности к накоплению меди, или к ассоциированному с медью заболеванию печени, или защиты от накопления меди в печени, или ассоциированного с медью заболевания печени, из такой группы полиморфизмов необходимо детектировать только один полиморфизм.

В результате неравновесного сцепления полиморфизм, который не является функциональным/протективным полиморфизмом предрасположенности, но находится в неравновесном сцеплении с функциональным полиморфизмом, может действовать в качестве маркера, являющегося показателем присутствия функционального полиморфизма. Полиморфизм, который находится в неравновесном сцеплении с полиморфизмом по изобретению, является показателем предрасположенности к накоплению или защиты от накопления меди в печени.

Таким образом, любое из полиморфных положений, как определено в настоящем документе, можно типировать непосредственно, другими словами, определяя нуклеотид, находящийся в этом положении, или опосредованно, например, определяя нуклеотид, находящийся в другом полиморфном положении, которое находится в неравновесном сцеплении с указанным полиморфным положением.

Неравновесное сцепление представляет собой неслучайную гаметическую ассоциацию аллелей в различных локусах в популяции. В неравновесном сцеплении находятся полиморфизмы с тенденцией к совместному наследованию вместо независимого наследования посредством случайного распределения. Случайное распределение или независимое наследование полиморфизмов друг от друга происходят, если частота совместного присутствия двух полиморфизмов является произведением частот присутствия двух полиморфизмов по-отдельности. Например, если два полиморфизма в различных полиморфных участках присутствуют в 50% хромосом в популяции, тогда можно сказать, что они подвержены случайному распределению, если два аллеля совместно присутствуют на 25% хромосом в популяции. Более высокое процентное содержание может означать, что два аллели являются сцепленными. Отсюда следует, что первый полиморфизм находится в неравновесном сцеплении со вторым полиморфизмом, если частота совместного присутствия двух полиморфизмов является большей, чем произведение частот присутствия двух полиморфизмов в популяции по отдельности. Предпочтительно, первый полиморфизм находится в неравновесном сцеплении со вторым полиморфизмом, если частота совместного присутствия двух полиморфизмов более чем на 10% больше, например более чем на 30%, более чем на 50%, или более чем на 70% больше, чем произведение частот присутствия полиморфизмов по отдельности.

Исследования показали, что неравновесное сцепление у собак широко распространено (Extensive and breed-specific linkage disequilibrium in Canis familiaris, Sutter et al., Genome Research 14: 2388-2396). Полиморфизмы, находящиеся в неравновесном сцеплении, часто находятся в непосредственной физической близости, что является причиной их совместного наследования. Полиморфизмы, находящиеся в неравновесном сцеплении с полиморфизмами, указанными в настоящем документе, расположены на той же хромосоме. Полиморфизмы, находящиеся в неравновесном сцеплении у собак, как правило, расположены в пределах 5 м.п.н., предпочтительно в пределах 2 м.п.н., в пределах 1 м.п.н., в пределах 700 т.п.н., в пределах 600 т.п.н., в пределах 500 т.п.н., в пределах 400 т.п.н., в пределах 200 т.п.н., в пределах 100 т.п.н., в пределах 50 т.п.н., в пределах 10 т.п.н., в пределах 5 т.п.н., в пределах 1 т.п.н., в пределах 500 п. н., в пределах 100 п. н., в пределах 50 п. н. или в пределах 10 п. н. от указанного полиморфизма.

Специалист стандартными способами может идентифицировать полиморфизмы, которые находятся в неравновесном сцеплении с любым из полиморфных положений, как определено в настоящем документе. После выбора потенциального полиморфизма специалист легко может определить значимость корреляции этого полиморфизма, и какой версии или аллеля полиморфизма с любым из полиморфизмов, определенных в настоящем документе.

Более подробно, для определения нахождения полиморфизма в неравновесном сцеплении с любым из полиморфизмов, определенным в настоящем документе, специалист должен генотипировать полиморфизм-кандидат и один или более полиморфизмов, определенных в настоящем документе в выборке собак. Размер выборки должен быть достаточным для достижения статистически значимого результата. Как правило, следует генотипировать образцы, полученные по меньшей мере у 100, предпочтительно по меньшей мере у 150 или по меньшей мере у 200 различных собак. Собаки в выборке могут быть любой порода, но, как правило, имеют одинаковую или сходную генетическую основу породы. После генотипирования полиморфизмов в выборке собак неравновесное сцепление в одной или более парах полиморфизмов можно измерять с использованием любого из ряда легкодоступных пакетов программ обработки статистических данных. Примером пакета свободного программного обеспечения является Haploview (Haploview: analysis and visualisation of LD and haplotype maps, Barrett et al. 2005, Bioinformatics, 21(2): 263-265), доступный для загрузки на http://www.broadinstitute.org/haploview/haploview. Другим примером программного обеспечения, которое можно использовать, является PLINK (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/).

Мерой неравновесного сцепления является D’. Показателем того, что пара полиморфизмов находится в неравновесном сцеплении, является диапазон D’ от 0,5 до 1, где 1 указывает на наиболее значительное неравновесное сцепление. Таким образом, если для полиморфизма-кандидата и конкретного полиморфизма, определенного в настоящем документе, выявлено, что D’ составляет от 0,5 до 1, предпочтительно от 0,6 до 1, от 0,7 до 1, от 0,8 до 1, от 0,85 до 1, от 0,9 до 1, от 0,95 до 1 или наиболее предпочтительно 1, можно сказать, что полиморфизм-кандидат является прогностическим для полиморфизма, определенного в настоящем документе, и таким образом является показателем предрасположенности к накоплению или защиты от накопления меди в печени. В предпочтительном способе по изобретению, полиморфизм, который находится в неравновесном сцеплении с полиморфизмом, определенным в настоящем документе, расположен в пределах 680 т.п.н. от полиморфизма, определенного в настоящем документе, и на той же хромосоме, и рассчитанная мера неравновесного сцепления пары полиморфизмов, D’, является большей или равной 0,9.

Другой мерой неравновесного сцепления является R-квадрат, где R представляет собой коэффициент корреляции, R-квадрат, который также известен как "коэффициент детерминации", представляет собой долю дисперсии генотипов первого полиморфизма, вычисляемую в генотипах второго полиморфизма. Таким образом, R-квадрат в размере 0,5 для полиморфизма-кандидат и конкретного полиморфизма, определенного в настоящем документе, может означать, что полиморфизм-кандидат обуславливает 50% дисперсии конкретного полиморфизма. R-квадрат можно получать с использованием стандартных пакетов программ обработки статистических данных, таких как Haploview. Как правило, сильной корреляцией считают R-квадрат в размере 0,25 или более (R>0,5 или <-0,5). Таким образом, если выявлено, что R-квадрат для полиморфизма-кандидата и конкретного полиморфизма, определенного в настоящем документе, составляет 0,5 или более, предпочтительно 0,75 или более, 0,8 или более, 0,85 или более, 0,9 или более, или 0,95 или более, можно сказать, что полиморфизм-кандидат является прогностическим для полиморфизма, определенного в настоящем документе, и таким образом является показателем предрасположенности к накоплению или защиты от накопления меди в печени. В предпочтительном способе по изобретению, полиморфизм, который находится в неравновесном сцеплении с полиморфизмом, определенным в настоящем документе, расположен в пределах 680 т.п.н. от полиморфизма, определенного в настоящем документе, и на той же хромосоме, и рассчитанная мера неравновесного сцепления пары полиморфизмов, R-квадрат, является большей или равной 0,5.

Также с использованием полиморфизмов по изобретению можно строить гаплотип из полиморфизмов в LD. Даже если один или более полиморфизмов индивидуально находятся только в слабом LD с полиморфизмами по изобретению, они могут находиться в сильном LD, если их используют в комбинации. Например, у любого полиморфизма значение R-квадрат может составлять ниже 0,25. Однако у двух или более мутаций, у которых значение R-квадрат индивидуально составляет ниже 0,25, в комбинации значение R-квадрат может составлять более 0,5. Таким образом, эти полиморфизмы можно использовать в комбинации для определения предрасположенности собаки к накоплению или вероятности защиты собаки от накопления меди в печени.

Таким образом, способ по изобретению может включать детекцию присутствия или отсутствия двух или более полиморфизмов в неравновесном сцеплении с полиморфизмом, определенным в настоящем документе, где R-квадрат для каждого из указанных двух или более полиморфизмов индивидуально может составлять меньше или равно 0,25,

Генетический тест накопления меди в печени у собак

Патент 2662660