Везикулы наружной мембраны

Везикулы наружной мембраны

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки US 61/702296, поданной 18 сентября 2012 года, и предварительной заявки US 61/799311, поданной 15 марта 2013 года, содержание которых в полном объеме включено в данный документ в качестве ссылки для любых целей.

Область техники

Настоящее изобретение относится к везикулам грамотрицательных бактерий. В просвете везикул содержатся гетерологичные белки. Везикулы, в частности, можно использовать для получения иммуногенных композиций, таких как вакцины.

Уровень техники

Грамотрицательные бактерии во время роста могут спонтанно высвобождать везикулы наружной мембраны (OMV), образующиеся вследствие тургорного давления на клеточную оболочку. Образованию таких OMV может способствовать разрушение некоторых бактериальных компонентов, см., например, ссылки 1 и 2, например, нарушение системы Tol-Pal E. coli, приводящее к появлению штаммов, которые высвобождают везикулы в культуральную среду в процессе роста. OMV также могут образовываться в результате разрушения целых бактерий. Известные способы получения OMV включают в себя способы, в которых используется детергент (например, дезоксихолат) (3, 4), способы, в которых не используется детергент (5), обработку ультразвуком (6) и т. д.

OMV содержат иммуногенные, связанные с клеточной поверхностью периплазматические и секретируемые антигены, и используются в качестве вакцин, например, против Neisseria meningitidis серогруппы в (7). Везикулы особенно подходят для такого применения, поскольку они содержат соединения, которые действуют в качестве адъювантов, индуцирующих сильные иммунные ответы против антигенов. Таким образом, для иммунной системы везикулы больше напоминают нативную бактерию, чем очищенные антигенные белки или другие бактериальные компоненты. Следовательно, OMV являются привлекательной мишенью для вакцин и других иммуногенных композиций. Было высказано предположение, что иммуногенные свойства некоторых белковых антигенов можно усилить путем получения рекомбинантных OMV, содержащих несколько антигенов на поверхности, с использованием ClyA в качестве партнера по гибридизации (8).

Было сделано несколько попыток направить гетерологичные белки, в частности гетерологичные антигены, в OMV. Однако на сегодняшний день антигены, чужеродные по отношению к исходным бактериям, в значительной степени отсутствуют в OMV, в основном из-за проблем, связанных с транспортировкой гетерологичных белков в везикулы (11). Большинство попыток направить гетерологичные белки в OMV было основано на образовании ковалентной связи гетерологичных белков с интегральными мембранными белками. Примеры таких ковалентно-связанных гетерологичных белков включают в себя гибриды эпитопа FLAG с полноразмерной последовательностью OmpA (белок наружной мембраны A), гибриды эпитопа FLAG с полноразмерной последовательностью PagP (PhoPQ-активированный ген P) (9), а также гибриды GFP с ClyA (цитолизин) (10). Посредством ковалентных связей с мембранными белками полученные гибридные белки присоединены к внешней мембране и, таким образом, включены в состав OMV. Указанные методы имеют недостатки, в частности, обусловленные тем, что трудно осуществлять повышенную экспрессию большого количества интегрального мембранного белка без вредных последствий, свойственных трансформированной бактерии.

Направление периплазматических белков в OMV также оказалось сложной задачей. Гибридизация GFP с сигнальной последовательностью Tat (транспортер с двойным аргинином) приводит к повышенной экспрессии GFP, направляемого в периплазму, однако флуоресценция GFP в OMV лишь немного превышает фоновый уровень (11), позволяя предположить, что GFP либо не внедряются в OMV, либо не функционируют в OMV из-за неправильной укладки.

Остается потребность в разработке способа, подходящего для экспрессии гетерологичных белков, заключенных в OMV, и, в частности, способа экспрессии антигенных белков, заключенных в OMV. Также остается потребность в альтернативных или усовершенствованных OMV, в частности, для применения в составе вакцин.

Описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что направленность гетерологичных белков в просвет OMV позволяет преодолеть многие проблемы, связанные с направленностью гетерологичных белков на мембрану OMV. Неожиданно авторы настоящего изобретения также обнаружили, что OMV, содержащие гетерологичные белки в просвете, при введении млекопитающему способны вызывать иммунные ответы на такие белки.

Таким образом, настоящее изобретение относится к везикулам наружной мембраны (OMV) грамотрицательной бактерии, где OMV содержат, по меньшей мере, один гетерологичный белок, который в свободной форме присутствует в просвете везикулы, причем OMV при введении млекопитающему могут вызывать иммунный ответ на указанный гетерологичный белок.

Изобретение также предлагает способ получения OMV настоящего изобретения, который включает в себя стадию экспрессии гетерологичного белка в периплазме грамотрицательной бактерии. Кроме того, изобретение предлагает OMV, полученные или которые можно получить с помощью данного способа.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей: (a) OMV настоящего изобретения и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

Изобретение также предлагает способ получения иммунного ответа у млекопитающего, включающий в себя введение эффективного количества OMV грамотрицательных бактерий млекопитающим, где OMV содержат в своем просвете, по меньшей мере, один гетерологичный белок, и где иммунный ответ развивается на гетерологичный белок, содержащийся в OMV. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта изобретения белок находится в свободной форме в просвете OMV. Изобретение также относится к способу получения иммунного ответа у млекопитающего, включающему в себя введение фармацевтической композиции настоящего изобретения млекопитающему, где иммунный ответ развивается на гетерологичный белок, содержащийся в OMV.

OMV

Настоящее изобретение предлагает везикулу наружной мембраны (OMV) грамотрицательной бактерии, где OMV содержит в своем просвете, по меньшей мере, один гетерологичный белок, который находится в свободной форме, и где OMV способен индуцировать иммунный ответ на гетерологичный белок при введении млекопитающему.

OMV, хорошо известные в данной области, спонтанно выделяются бактериями в культуральную среду. "Нативные OMV" ("NOMV" (12)), микровезикулы (MV (13)), OMV, экстрагированные с помощью детергента (DOMV), OMV, полученные из мутантов (m-OMV), и пузырьки, которые представляет собой выступы наружной мембраны, остающиеся присоединенными к бактериям до высвобождения в виде MV, ((14); (15)), являются частью настоящего изобретения и в данном описании совместно обозначаются OMV.

OMV настоящего изобретения можно получить из любой подходящей грамотрицательной бактерии. В качестве грамотрицательной бактерии обычно используют E. coli. Однако вместо E. coli можно использовать и другие грамотрицательные бактерии. Предпочтительно в настоящем изобретении используют грамотрицательные бактерии, которые не являются патогенными для человека. Например, бактерии могут быть комменсальными по отношению к организму человека. Однако в некоторых вариантах осуществления используют бактерии, которые обычно отсутствуют в организме человека. Примеры видов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают в себя виды, относящиеся к родам Escherichia, Shigella, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia Haemophilus, Legionella, Pseudomonas, Yersinia, Helicobacter, Salmonella, Vibrio и др. В частности, бактерия может относиться к видам Shigella (таким как S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii или S. sonnei). Альтернативно она может относиться к видам Neisseria, в особенности, к непатогенным видам, таким как N. bacilliformis, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. lactamica, N. macacae, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca или N. subflava, предпочтительно к виду N. lactamica. В качестве альтернативы можно использовать патогенные виды Neisseria, например, N. gonorrhoeae или N. meningitidis. В других примерах бактерия может относиться к видам Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae (в том числе нетипируемые штаммы), Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori, Salmonella enterica (в том числе серовары typhi и typhimurium, а также серовары paratyphi и enteritidis), Vibrio cholerae, Proteus, Citrobacter, Serratia, Erwinia, Pasteurella и т. д. Также можно использовать фотосинтезирующие грамотрицательные бактерии. Как правило, бактерия относится к компетентному штамму. Это облегчает генетическую модификацию бактерии.

В конкретном варианте осуществления грамотрицательная бактерия относится к штамму, характеризующемуся "повышенным образованием везикул". Грамотрицательные бактерии с повышенным образованием везикул, которые легче и с более высоким выходом образуют везикулы, более однородные по своей природе, описаны в WO 02/062378. Например, везикулы можно получить из бактерий, выбранных из группы, включающей в себя Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa и Moraxella catarrhalis.

В конкретном варианте осуществления бактерия представляет собой мутант E. coli ompA и/или мутант E. coli tolR. В некоторых вариантах осуществления в качестве бактерии используют E. coli BL21(DE3)ΔompA, E. coli BL21(DE3)ΔompAΔtolR, E. coli BL21(DE3)ΔtolR, E. coli ΔnlpI или E. coli ΔdegP. Символ Δ используется здесь для обозначения бактериального штамма, из которого удалена кодирующая последовательность гена, указанного после символа Δ. Так, бактериальный штамм, обозначаемый "ΔompA", не содержит кодирующую последовательность гена OmpA. Подобным образом бактериальный штамм, обозначаемый "ΔtolR", не содержит кодирующую последовательность гена tolR. Кодирующая последовательность может быть удалена полностью. Альтернативно кодирующая последовательность может быть удалена частично. Например, можно удалить N-концевую половину или С-концевую половину последовательности. Альтернативно гены ompA и/или tolR можно подвергнуть мутациям путем введения одной или нескольких замен и/или вставок.

Мутантные штаммы E. coli ΔtolR и E. coli ΔompA продуцируют OMV на более высоком уровне, чем E. coli дикого типа. Таким образом, мутация гена ompA и/или одного или нескольких компонентов комплекса Tol-Pal приводит к получению мутантной бактерии, продуцирующей повышенное число OMV по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа, который несет ген ompA и/или комплекс Tol-Pal дикого типа. OmpA представляет собой интегральный мембранный белок и является наиболее распространенным из белков наружной мембраны E. coli. Поэтому тот факт, что E. coli, утратившие белок ompA, остаются жизнеспособными, является неожиданным. Действительно, согласно Murakami et al. (16), одиночный мутант E. coli ompA не способен поддерживать высвобождение везикул.

Гетерологичный белок

Гетерологичный белок настоящего изобретения направляется в периплазму и экспрессируется в периплазме грамотрицательных бактерий, в результате чего гетерологичный белок может присутствовать в просвете OMV. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный белок присутствует в просвете OMV в свободной форме.

Белок может представлять собой полимер из аминокислот любой длины. Полимер из аминокислот может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и его аминокислотная последовательность может прерываться отличными от аминокислот элементами. Данный термин также включает в себя аминокислотный полимер, модифицированный естественным путем или в результате вмешательства; например, путем образования дисульфидных связей, дополнительного гликозилирования, частичного или полного дегликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгация с меченным компонентом. Данное определение также охватывает, например, белки, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включающие в себя, например, неприродные аминокислоты и т. д.), а также другие модификации, известные в данной области. Белки могут встречаться в виде отдельных цепей или ассоциированных цепей. Белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть гликозилированными, причем характер гликозилирования может быть естественным или неестественным (т. е. характер гликозилирования полипептида может отличаться от характера гликозилирования соответствующего природного полипептида).

В данном описании термин "гетерологичный" означает, что белок получен из вида, отличного от вида бактерии, из которой получают OMV (гетерологичный организм). Как правило, белок представляет собой антиген, полученный из патогенного рода, отличного от рода бактерии, из которой получают OMV.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гетерологичный белок представляет собой иммуногенный белок, который может вызывать иммунный ответ у реципиента. В конкретном варианте осуществления иммуногенный белок и, следовательно, гетерологичный белок содержит антиген или состоит из антигена. Антиген может вызывать иммунный ответ против протиста, бактерии, вируса, грибка или любого другого патогена, в том числе многоклеточного патогенна, или паразита (или, в некоторых вариантах осуществления, против аллергена и в других вариантах осуществления против опухолевого антигена). Иммунный ответ может включать в себя гуморальный ответ (как правило, с участием IgG) и/или клеточный ответ. Полипептидный антиген, как правило, вызывает иммунный ответ, который распознает соответствующий бактериальный, вирусный, грибковый или паразитарный (или аллергенный или опухолевый) полипептид, а в некоторых вариантах осуществления полипептид может действовать как мимеотоп, вызывая иммунный ответ, который распознает бактериальный, вирусный, грибковый или паразитарный сахарид. Антиген, как правило, представляет собой поверхностный полипептид, такой как адгезин, гемагглютинин, оболочечный гликопротеин, гликопротеин шиповидных отростков и т. д.

В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает иммунный ответ против одной из следующих бактерий:

Neisseria meningitidis: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, мембранные белки, такие как адгезины, аутотранспортеры, токсины, белки, связывающие железо, фактор H-связывающие белки (fHbp или 741), гепаринсвязывающий антиген Neisseria (NHBA или 287), NadA (или 961), 953/936 и bp серогруппы в Neisseria meningitides (fHbp). Сочетание трех подходящих полипептидов описано в публикации 17.

Streptococcus pneumoniae: Подходящие полипептидные антигены раскрыты в публикации 18. Они включают в себя, без ограничения, субъединицу RrgB пилуса, предшественник бета-N-ацетилгексозаминидазы (spr0057), spr0096, белок общего стресса GSP-781 GSP-781 (spr2021, SP2216), серин/треонин-киназу StkP (SP1732) и пневмококковый поверхностный адгезин PsaA.

Streptococcus pyogenes: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, полипептиды, описанные в публикациях 19 и 20, например, GAS25-574, такие как GAS25 (SEQ ID: 41, SEQ ID: 42), GAS40 (SEQ ID: 43, SEQ ID: 44, SEQ ID: 45, SEQ ID: 46, SEQ ID: 47, SEQ ID: 48, SEQ ID: 49, SEQ ID: 50, SEQ ID: 51, SEQ ID: 52, SEQ ID: 53, SEQ ID: 54, SEQ ID: 55, SEQ ID: 56, SEQ ID: 57, SEQ ID: 58, SEQ ID: 59, SEQ ID: 60, SEQ ID: 61, SEQ ID: 62, SEQ ID: 63, SEQ ID: 64, SEQ ID: 65, SEQ ID: 66, SEQ ID: 67, SEQ ID: 68, SEQ ID: 69, SEQ ID: 70), GAS57 (SEQ ID: 39, SEQ ID: 40, SEQ ID: 71, SEQ ID: 72, SEQ ID: 73, SEQ ID: 74; SEQ ID: 75), 88, 23, 99, 97, 24, 5, 208, 193, 67, 64, 101, 205, 268, 68, 189, 165 или 201.

Moraxella catarrhalis

Bordetella pertussis: Подходящие антигены коклюша включают в себя, без ограничения, бесклеточные или цельноклеточные коклюшные антигены, коклюшный голотоксин или анатоксин (PT), нитевидный гемагглютинин (FHA), пертактин и агглютиногены 2 и 3.

Staphylococcus aureus: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, полипептиды, описанные в публикации 21, такие как гемолизин, esxA, esxB, esxAB, феррихромсвязывающий белок (sta006) и/или липопротеин sta011.

Clostridium tetani: Типичным антигеном является столбнячный анатоксин.

Cornynebacterium diphtheria: Типичным антигеном является дифтерийный анатоксин.

Haemophilus influenzae: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, полипептиды, описанные в публикациях 22 и 23.

Pseudomonas aeruginosa

Streptococcus agalactiae: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, полипептиды, описанные в публикации 19, такие как 67, 80, 1523, 3, 328 или 211.

Chlamydia trachomatis: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-подобный, L7/L12, OmcA, Atos, CT547, Eno, HtrA и MurG (например, описанные в публикации 24). LcrE (25) и HtrA (26) представляют собой два предпочтительных антигена.

Chlamydia pneumoniae: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, полипептиды, описанные в публикации 27.

Helicobacter pylori: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, CagA, VacA, NAP и/или уреазу (28).

Escherichia coli: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из энтеротоксигенной E. coli (ETEC), энтероагрегативной E. coli (EAggEC), диффузно-адгерентной E. coli (ОБЭП), энтеропатогенной E. coli (ЕРЕС), внекишечной патогенной E. coli (ExPEC) и/или энтерогеморрагической E. coli (EHEC). Штаммы ExPEC включают в себя уропатогенную E. coli (UPEC) и менингит/сепсисассоциированную E. coli (MNEC). Подходящие полипептидные антигены UPEC описаны в публикациях 29 и 30. Подходящие антигены MNEC раскрыты в публикации 31. Подходящим антигеном для нескольких типов E. coli является AcfD (32).

Bacillus anthracis

Yersinia pestis: Подходящие антигены включают в себя, без ограничения, антигены, описанные в публикациях 33 и 34.

Staphylococcus epidermidis, например, капсульный полисахарид типа I, II и/или III, который можно получить из штаммов ATCC-31432, SE-360 и SE-10.

Clostridium perfringens или Clostridium botulinums

Legionella pneumophila

Coxiella burnetii

Brucella, такие как B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae.

Francisella, такие как F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.

Neisseria gonorrhoeae

Treponema pallidum

Haemophilus ducreyi

Enterococcus faecalis или Enterococcus faecium

Staphylococcus saprophyticus

Yersinia enterocolitica

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium leprae

Rickettsia

Listeria monocytogenes

Vibrio cholerae

Salmonella typhi

Borrelia burgdorferi

Porphyromonas gingivalis

Klebsiella

Rickettsia prowazekii.

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген Chlamydia, Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Salmonella, Neisseria или Helicobacter.

В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает иммунный ответ против одного из нижеследующих вирусов:

Orthomyxovirus: Подходящие антигены могут представлять собой антигены вируса гриппа А, В или С, такие как гемагглютинин, нейраминидаза или матриксные белки М2. Если антиген представляет собой гемагглютинин вируса гриппа А, он может относиться к любому подтипу, такому как H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16.

Вирусы Paramyxoviridae: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены пневмовирусов (таких как респираторно-синцитиальный вирус, RSV), Rubulaviruses (таких как вирус эпидемического паротита), парамиксовирусов (таких как вирус парагриппа), метапневмовирусов и морбилливирусов (таких как вирус кори).

Poxviridae: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из ортопоксвируса, такого как Variola vera, включающего в себя, без ограничения, Variola major и Variola minor.

Picornavirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из пикорнавирусов, таких как энтеровирусы, риновирусы, гепарновирусы, кардиовирусы и афтовирусы. В одном варианте осуществления энтеровирус представляет собой полиовирус, например, полиовирус типа 1, типа 2 и/или типа 3. В другом варианте осуществления энтеровирус представляет собой энтеровирус EV71. В следующем варианте осуществления энтеровирус представляет собой вирус коксаки А или В.

Bunyavirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из ортобуньявирусов, таких как вирус калифорнийского энцефалита, флебовирусов, таких как вирус лихорадки долины Рифт, или найровирусов, таких как вирус конго-крымской геморрагической лихорадки.

Heparnavirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из гепарнавирусов, таких как вирус гепатита А (HAV), например, инактивированный вирус, вирус гепатита В, например поверхностные и/или внутренние антигены, или вирус гепатита С.

Filovirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из филовирусов, таких как вирус Эбола (в том числе эболавирус Заир, Берег Слоновой Кости, Рестон или Судан) или вирус, вызывающий марбургскую болезнь.

Togavirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из тогавирусов, таких как рубивирусы, альфавирусы или артеривирусы. К данному семейству относится вирус краснухи.

Flavivirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из флавивирусов, таких как вирус клещевого энцефалита (TBE), вирус денге (типа 1, 2, 3 или 4), вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус болезни куасанурского леса, вирус энцефалита Западного Нила, вирус энцефалита Сент-Луис, вирус русского весенне-летнего энцефалита, вирус энцефалита Повассан.

Pestivirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из пестивирусов, таких как вирусы вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), классической чумы свиней (CSFV) или пограничной болезни овец (BDV).

Hepadnavirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из гепаднавирусов, таких как вирус гепатита B. Композиция может содержать поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg).

Другие вирусы гепатита: Композиция может содержать антиген вируса гепатита С, вируса гепатита дельта, вируса гепатита Е или вируса гепатита G.

Rhabdovirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из рабдовирусов, таких как лиссавирус (например, вирус бешенства) и везикуловирус (VSV). Примером антигена вируса бешенства является лиофилизированный инактивированный вирус.

Caliciviridae: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из калицивирусов, таких как вирус Норуолк (норовирус) и Норуолкподобные вирусы, например, гавайский вирус и вирус снежных гор.

Coronavirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из коронавируса SARS, вируса инфекционного бронхита птиц (IBV), вируса гепатита мышей (MHV) и вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (TGEV). Антиген коронавируса может представлять собой полипептид шиповидного отростка.

Retrovirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из онковируса, лентивируса (например, такого как ВИЧ-1 или ВИЧ-2) или спумавируса, такого как gp120, gp140 или gp160.

Reovirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из ортореовируса, ротавируса, орбивируса или колтивируса.

Parvovirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из парвовируса В19.

Herpesvirus: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из человеческих герпесвирусов, таких как, например, вирусы простого герпеса (HSV) (например, HSV типов 1 и 2), вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловирус (ЦМВ), человеческий герпесвирус 6 (HHV6), человеческий герпесвирус 7 (HHV7) и человеческий герпесвирус 8 (HHV8).

Papovaviruses: Вирусные антигены включают в себя, без ограничения, антигены, полученные из папилломавирусов и полиомавирусов. (Человеческий) папилломавирус может включать в себя серотипы 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 или 65, и антигены могут быть получены, например, из одного или нескольких серотипов 6, 11, 16 и/или 18.

Adenovirus: Вирусные антигены включают в себя антигены, полученные из аденовируса серотипа 36 (Ad-36).

В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает иммунный ответ против вируса, который инфицирует рыбу, такого как: вирус инфекционной анемии лосося (ISAV), вирус, вызывающий заболевание поджелудочной железы лосося (SPDV), вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV), вирус, вызывающий болезнь американского проточного сома (CCV), вирус лимфоцистозной болезни рыб (FLDV), вирус инфекционного гемопоэтического некроза (IHNV), вирус герпеса кои, пикорна-подобный вирус лосося, вирус (также известный как пикорнаподобный вирус атлантического лосося), вирус озерного лосося (LSV), ротавирус атлантического лосося (ASR), вирус клубничной болезни форели (TSD), вирус опухоли кижуча (CSTV) или вирус вирусной геморрагической септицемии (VHSV).

Грибковые антигены могут быть получены из Dermatophytres, включающих в себя: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, и/или Trichophyton faviforme; или из Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis и Enterocytozoon bieneusi; реже встречаются common are Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp., Mortierella spp., Cunninghamella spp., Saksenaea spp., Alternaria spp., Curvularia spp., Helminthosporium spp., Fusarium spp, Aspergillus spp., Penicillium spp., Monolinia spp., Rhizoctonia spp., Paecilomyces spp., Pithomyces spp. и Cladosporium spp.

В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает иммунный ответ против паразита из рода Plasmodium, такого как P. falciparum, P. vivax, P. malariae или P. ovale. Таким образом, изобретение можно использовать для иммунизации против малярии. В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает иммунный ответ против паразитов семейства Caligidae, в частности, родов Lepeophtheirus и Caligus, например, морских вшей, таких как Lepeophtheirus salmonis или Caligus rogercresseyi.

В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает иммунный ответ против пыльцевых аллергенов (аллергенов пыльцы деревьев, трав, сорняков и злаков); аллергенов насекомых или паукообразных (легочные аллергены, аллергены слюны и яда, например, клещевые аллергены, аллергены тараканов и мошек, аллергены яда насекомых семейства гименоптера); аллергены шерсти и перхоти животных (таких как собаки, кошки, лошади, крысы, мыши и т. д.) и пищевых аллергенов (например, глиадин). Важные пыльцевые аллергены деревьев, злаков и трав, например, относящихся к таксономическим отрядам букоцветных, маслиновых, сосновых и платановых, которые включают в себя, без ограничения, березу (Betula), ольху (Alnus), орех (Corylus), граб (Carpinus) и оливковое дерево (Olea), кедр (криптомерия и можжевельник), платан (Platanus), к отряду злакоцветных, включающему в себя травы родов плевел, тимофеевка, мятлик, бермудская трава, ежа, бухарник, канареечник, рожь и сорго, к отрядам астроцветных и крапивоцветных, включающим в себя лекарственные растения родов амброзия, полынь и постенница. Другие важные легочные аллергены включают в себя аллергены клещей домашней пыли родов Dermatophagoides и Euroglyphus, амбарных клещей, например, Lepidoglyphys, Glycyphagus и Tyrophagus, аллергены тараканов, мошек и блох, таких как Blatella, Periplaneta, Chironomus и Ctenocepphalides, и аллергены млекопитающих, таких как кошки, собаки и лошади, аллергены ядов, высвобождающихся при укусах насекомых, таких как насекомые таксономического отряда гименоптера, включающего в себя пчел (Apidae), ос (Vespidea) и муравьев (Formicoidae).

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой опухолевый антиген, выбранный из группы, включающей в себя: (а) антигены рака яичка, такие как NY-ESO-1, SSX2, SCP1, а также полипептиды семейств RAGE, BAGE, GAGE и MAGE, такие как GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 и MAGE- 12 (которые можно использовать, например, для лечения меланомы, опухолей легкого, головы и шеи, NSCLC, молочной железы, желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря; (b) мутантные антигены, например, р53 (ассоциированный с разными солидными опухолями, такими как рак толстой кишки, легких, головы и шеи), P21/РАН (ассоциированный, например, с меланомой, раком поджелудочной железы и толстой кишки), CDK4 (ассоциированный, например, с меланомой), MUM1 (ассоциированный, например, с меланомой), каспаза-8 (ассоциированная, например, с раком головы и шеи), CIA 0205 (ассоциированный, например, с раком мочевого пузыря), HLA-A2-R1701, бета-катенин (ассоциированный, например, с меланомой), TCR (ассоциированный, например, с Т-клеточной неходжкинской лимфомой), BCR-abl (ассоциированный, например, с хроническим миелолейкозом), триозофосфатизомераза, KIA 0205, CDC-27 и LDLR-FUT; (c) антигены, экспрессирующиеся на повышенном уровне, такие как галектин 4 (ассоциированный, например, с колоректальным раком), галектин 9 (ассоциированный, например, с болезнью Ходжкина), протеиназа 3 (ассоциированная, например, с хроническим миелолейкозом), WT1 (ассоциированный, например, с разными лейкозами), карбоангидраза (ассоциированная, например, с раком почки), альдолаза A (ассоциированная, например, с раком легких), PRAME (ассоциированный, например, с меланомой), HER-2/neu (ассоциированный, например, с раком молочной железы, толстой кишки, легких и яичников), маммаглобин, альфа-фетопротеин (ассоциированные, например, с гепатомой), KSA (ассоциированный, например, с колоректальным раком), гастрин (ассоциированный, например, с раком поджелудочной железы и желудка), каталитический белок теломераза, MUC-1 (ассоциированный, например, с раком молочной железы и яичников), G-250 (ассоциированный, например, с почечноклеточной карциномой), P53 (ассоциированный, например, с раком молочной железы, толстой кишки), а также карциноэмбриональный антиген (ассоциированный, например, с раком молочной железы, раком легких, раком желудочно-кишечного тракта, таким как колоректальный рак); (d) общие антигены, например, антигены меланомы-дифференциации меланоцитов, такие как MART-1/Melan A, gp100, MC1R, рецептор гормона, стимулирующего меланоциты, тирозиназа, родственный тирозиназе белок 1/TRP1 и родственный тирозиназе белок 2/TRP2 (ассоциированный, например, с меланомой); (e) антигены простаты, такие как PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, ассоциированные, например, с раком простаты; (f) идиотипы иммуноглобулинов (ассоциированные, например, с миеломой и В-клеточными лимфомами). В некоторых вариантах осуществления опухолевые антигены включают в себя, без ограничения, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, антигены вируса Эпштейна-Барра, EBNA, антигены человеческого папилломавируса (HPV), в том числе E6 и E7, антигены вирусов гепатита В и С, антигены лимфотропного Т-клеточного вируса человека, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, бета-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2-связывающий белок/циклофилин С-ассоциированный белок), TAAL6, TAG72, TLP, TPS и т. п.

В следующем конкретном примере гетерологичный белок представляет собой β-лактамазу (TEM1), fHbp Neisseria meningitides, двойной мутант внеклеточного холестеринзависимого стрептолизина О (Slo-dm) Streptococcus pyogenes, серин-протеазу клеточной оболочки SpyCep Streptococcus pyogenes или предполагаемый поверхностный эксклюзионный белок Spy0269 Streptococcus pyogenes.

Гетерологичный белок может представлять собой растворимый белок, периферийный мембранный белок или интегральный мембранный белок, экспрессируемый в организме, гетерологичном по отношению к организму, из которого его получают, т. е. в котором он присутствует в природе. Например, если гетерологичный белок представляет собой белок грамотрицательной бактерии, он может включать в себя цитоплазматический, периплазматический или мембранно-связанный белок нативной грамотрицательной бактерии. Однако, если гетерологичный белок присутствует в OMV, он может находиться в просвете OMV, и предпочтительно он находится в просвете OMV в свободной форме. Таким образом, гетерологичный белок может быть модифицирован по сравнению с белком дикого типа, например, путем удаления какого-либо мембранного якоря (якорей).

Термин "в просвете" OMV охватывает как белки, связанные с мембраной, но не экспонированные на поверхности, так и белки, которые находятся в просвете OMV в свободной форме. В соответствии с настоящим изобретением гетерологичный белок, как правило, находится в просвете OMV в свободной форме. Термин "находится в просвете в свободной форме" означает, что гетерологичный белок не является интегральным белком мембраны OMV. Интегральная ассоциация с мембраной описывает такую связь белков с мембраной, которая требует применения детергента или другого неполярного растворителя для отделения белка от мембраны. Обзор по мембранным якорям, обеспечивающим интегральную ассоциацию с мембраной, можно найти в публикации 35. Белок, который находится в просвете OMV в свободной форме, может быть связан с мембраной или интегральным мембранным белком путем нековалентных взаимодействий или он может быть совсем не связан с мембраной OMV. Например, белок может быть слабо или временно связан с мембраной путем гидрофобных, электростатических, ионных и/или других нековалентных взаимодействий с липидным бислоем и/или интегральным белком.

Одно из преимуществ того, что гетерологичный белок находится в просвете OMV, а не является связанным с мембраной и экспонированным, заключается в том, что он может быть защищен от деградации под действием протеаз in vivo. Данная защита, в свою очередь, может привести к более эффективной активации В-клеток.

В конкретном варианте осуществления гетерологичный белок представляет собой растворимый белок. Термин "растворимый белок" означает, что белок не связан с липидной мембраной. Растворимый белок не содержит мембранный якорь, такой как пептидный трансмембранный домен, другой пептидный домен, способный связываться с мембраной, или непептидный мембранный якорь, такой как липид.

OMV способны вызывать иммунный ответ на гетерологичный белок при введении млекопитающему. Иммунный ответ может представлять собой клеточный или гуморальный иммунный ответ. Как правило, иммунный ответ является гуморальным.

В одном варианте осуществления OMV настоящего изобретения способны вызывать иммунный ответ против патогена, из которого получен гетерологичный белок. Например, гетерологичный белок предпочтительно вызывает Т-клеточный иммунный ответ, который может нейтрализовать инфекцию и/или вирулентность патогена, из которого получен гетерологичный белок. Таким образом, гетерологичные белки, предпочтительные для применения в настоящем изобретении, представляют собой белки, которые распознаются клеточной иммунной системой при инфицировании представляющим интерес патогеном. Более предпочтительными являются гетерологичные белки, которые вызывают защитный Т-клеточный иммунный ответ против представляющего интерес патогена.

В одном варианте осуществления OMV настоящего изобретения способны индуцировать образование антител, распознающих патоген, из которого получен гетерологичный белок. Например, гетерологичный белок предпочтительно индуцирует образование антител, которые могут связываться с патогеном и предпочтительно нейтрализуют инфекцию и/или вирулентность патогена, из которого получен гетерологичный белок. Таким образом, гетерологичные белки, предпочтительные для применения в настоящем изобретении, представляют собой белки, которые распознаются антисывороткой после инфицирования представляющим интерес патогеном. Более предпочтительными являются гетерологичные белки, которые вызывают защитный иммунный ответ против представляющего интерес патогена.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный белок является иммуногенным, если он присутствует в OMV, но не является иммуногенным, если его вводят в очищенном виде.

В одном варианте осуществления гетерологичные белки настоящего изобретения являются функционально активными в просвете OMV и/или после высвобождения из просвета OMV (например, в результате опосредованного детергентом разрушения OMV). Функциональная активность является показателем того, что гетерологичный белок имеет правильную укладку и такую же или по существу такую же третичную и четвертичную структуру, как и тот же белок в нативном состоянии. Термин "функционально активный" означает, что гетерологичный белок сохраняет, по меньшей мере, 50% или более, по меньшей мере, одной биологической активности того же белка при экспрессии в нативном окружении (например, в организме, из которого его получают). Например, гетерологичный белок может считаться функционально активным, если он сохраняет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более, по меньшей мере, одной биологической активности того же белка при экспрессии в нативном окружении.

В вариантах осуществления, в которых гетерологичный белок с