Индуцирующий цитотоксичность терапевтический агент

Индуцирующий цитотоксичность терапевтический агент

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептидным комплексам, которые позволяют осуществлять лечение рака благодаря их способности приближать Т-клетки к раковым клеткам-мишеням и использованию цитотоксической активности Т-клеток в отношении раковых клеток-мишеней, к способам получения полипептидных комплексов и к терапевтическим агентам, которые содержат указанный полипептидный комплекс в качестве действующего вещества для индукции клеточной цитотоксичности. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, предназначенным для лечения или предупреждения различных видов рака, которые содержат в качестве действующего вещества указанный выше терапевтический агент для индукции клеточной цитотоксичности, и к терапевтическим способам, заключающимся в применении указанных фармацевтических композиций.

Предпосылки создания изобретения

К настоящему времени в качестве фармацевтических средств для лечения рака разработано множество терапевтических антител, обладающих очень высокой противоопухолевой активностью (непатентный документ 1). Известно, что эти терапевтические антитела проявляют свое противоопухолевое действие на раковые клетки посредством ингибирования сигналов, имеющих решающее значение для роста раковых клеток, индукции сигналов клеточной гибели, антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) (непатентный документ 2). ADCC представляет собой цитотоксичность, вызываемую эффекторными клетками, такими как NK-клетки и макрофаги, в отношении связанных с антителом раковых клеток-мишеней, когда Fc-область антитела связывается с Fc-рецептором на эффекторных клетках. При этом комплекс комплемента связывается с комплементсвязывающим сайтом в структуре антитела. CDC представляет собой цитотоксичность, которая имеет место в том случае, когда компонент системы комплемента в комплексе формирует пору в клеточной мембране связанной с антителом клетки, усиливающую приток воды или ионов в клетку. Хотя общепринятые терапевтические антитела обладают очень высокой активностью, до настоящего времени введение указанных антител приводило лишь к неудовлетворительным исходам терапевтического лечения. Таким образом, существует потребность в создании терапевтических антител с более высокой способностью к уничтожению раковых клеток.

Помимо указанных выше антител, которые приобретают ADCC в качестве их противоопухолевого механизма посредством рекрутмента NK-клеток или макрофагов в качестве эффекторных клеток, вызывающие рекрутмент Т-клеток антитела (TR-антитела), которые приобретают цитотоксичность в качестве их противоопухолевого механизма путем рекрутмента Т-клеток в качестве эффекторных клеток, известны с 1980-х годов (непатентный документы 3-5). TR-антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое содержит антитело к любой из субъединиц, образующих комплекс Т-клеточного рецептора (TCR) на Т-клетках, в частности, антитело, которое связывается с эпсилон-цепью CD3, и антитело, которое связывается с антигеном на раковых клетках-мишенях. Т-клетка приближается к раковой клетке, когда TR-антитело одновременно связывается как с эпсилон-цепью CD3, так и с раковым антигеном, и это приводит к противоопухолевому действию в отношении раковой клетки благодаря цитотоксической активности Т-клетки.

В качестве TR-антитела известно также антитело, обозначенное как «трехфункциональное антитело» (непатентные документы 6 и 7). Трехфункциональное антитело представляет собой полное биспецифическое антитело IgG-типа, в котором одно плечо содержит Fab, связывающийся с раковым антигеном, а другое плечо содержит Fab, связывающийся с эпсилон-цепью CD3. Терапевтические действие в отношении злокачественных асцитов продемонстрировано при введении катумаксомаба, представляющего собой трехфункциональное антитело к ЕрСАМ, в перитонеальные полости пациентов со злокачественными асцитами, которые имеют позитивные по экспрессии ЕрСАМ раковые клетки. Применение катумаксомаба разрешено в странах Евросоюза для вышеуказанного лечения.

Кроме того, в настоящее время установлено, что TR-антитело, обозначенное как «биспецифическое, привлекающее Т-клетки антитело (BiTE)» обладает сильным противоопухолевым действием (не представляющие собой патент документы 8 и 9). BiTE представляет собой TR-антитело с молекулярной формой, в которой scFv антитела к раковому антигену сцеплен с scFv антитела к эпсилон-цепи CD3 через короткий полипептидный линкер. Известно, что BiTE обладают противоопухолевой активностью, превышающей активность различных известных TR-антител (непатентные документы 9 и 10). В частности, по сравнению с другими TR-антителами BiTE обладают противоопухолевой активностью даже при применении в существенно более низкой концентрации и при более низком соотношении эффекторных клеток/раковых клеток (ЕТ-соотношение). Продемонстрировано также, что их действие может с успехом проявляться без необходимости в предварительной активации эффекторных клеток с помощью IL-2, агонистического антитела к CD28 или др. Блинатумомаб (МТ103), который представляет собой BiTE к CD19, обладает более сильной цитотоксической активностью в отношении раковых клеток in vitro, чем ритуксан, который, как известно, обладает очень хорошим клиническим действием. Кроме того, чрезвычайно высокая активность блинатумомаба выявлена на фазе I и II проводимых в настоящее время клинических испытаний (непатентный документ 11).

На основе того факта, что катумаксомаб разрешен в качестве терапевтического агента, для которого в клинических условиях продемонстрировано лечебное действие, и что множество BiTE, включая блинатумомаб, обладают сильным противоопухолевым действием, высказано предположение о том, что TR-антитела, которые обеспечивают рекрутмент Т-клеток в качестве эффекторных клеток, могут обладать существенно более высоким потенциалом в качестве противоопухолевого агента по сравнению с общепринятыми антителами, механизм действия которых связан с ADCC.

Однако известно, что трехфункциональное антитело одновременно связывается как с Т-клеткой, так с такой клеткой как NK-клетка или макрофаг, независимым от ракового антигена образом, и в результате рецепторы, которые экспрессируются на клетках, являются перекрестносшитыми, и экспрессия различных цитокинов индуцируется независимым от ракового антигена образом. Предполагается, что системное введение трехфункционального антитела вызывает побочные действия типа «цитокинового шторма» в результате указанной индукции экспрессии цитокинов. Фактически, на фазе I клинического испытания было установлено, что максимальной переносимой дозой при системном введении катумаксомаба пациентам с немелкоклеточным раком легкого является очень низкая доза, составляющая 5 мкг/организм, и что введение более высокой дозы вызывает серьезные побочные действия (непатентный документ 12). При введении катумаксомаба в указанной низкой дозе его уровень в крови никогда не может достигать эффективного значения. Это означает, что ожидаемое противоопухолевое действие не может быть достигнуто при введении катумаксомаба в указанной низкой дозе.

При этом, в отличие от катумаксомаба, BiTE не содержит сайт связывания Fcγ-рецептора и поэтому у такого антитела отсутствует перекрестное сшивание с рецепторами, которые экспрессируются на Т-клетках и таких клетках, как NK-клетки и макрофаги, зависимым от ракового антигена образом. Так, было продемонстрировано, что BiTE не вызывает независимую от ракового антигена индукцию цитокинов, которая обнаружена при введении катумаксомаба. Однако, поскольку BiTE представляет собой модифицированную низкомолекулярную молекулу антитела без Fc-области, проблема заключается в том, что время его полужизни в крови после введения пациенту, существенно короче, чем в случае антител IgG-типа, которые обычно применяют в качестве терапевтических антител. Фактически, согласно опубликованным данным время полужизни в крови BiTE при его применении in vivo составляет примерно несколько часов (непатентные документы 13 и 14). При проведении клинических испытаний блинатумомаба его вводили путем непрерывной внутривенной инфузии с помощью мининасоса. Такой метод введения не только чрезвычайно неудобен для пациентов, но также имеет потенциальный риск медицинских осложнений, связанных с неисправностью устройства или т.п. Таким образом, нельзя считать, что указанный метод введения является желательным.

Документы, характеризующие известный уровень техники

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1]: Clin Cancer Res. 16 (1), 2010, cc.11-20.

[Непатентный документ 2]: Drug Des Devel Ther 3, 2009, cc.7-16.

[Непатентный документ 3]: Nature 314 (6012), 1985, cc.628-631.

[Непатентный документ 4]: Int J Cancer 41 (4), 1988, cc.609-615.

[Непатентный документ 5]: Proc Natl Acad Sci USA 83 (5), 1986, cc.1453-1457.

[Непатентный документ 6]: Cancer Treat Rev. 36 (6), 2010, cc.458-467.

[Непатентный документ 7]: Expert Opin Biol Ther 10 (8), 2010, cc.1259-1269.

[Непатентный документ 8]: Proc Natl Acad Sci USA. 92 (15), 1995, cc.7021-7025.

[Непатентный документ 9]: Drug Discov Today, 10 (18), 2005, cc.1237-1244.

[Непатентный документ 10]: Trends Biotechnol 22 (5), 2004, cc.238-244.

[Непатентный документ 11]: Science 321 (5891), 2008, cc.974-977.

[Непатентный документ 12]: Cancer Immunol Immunother 56 (10), 2007, cc.1637-1644.

[Непатентный документ 13]: Cancer Immunol Immunother. 55 (5), 2006, cc.503-514.

[Непатентный документ 14]: Cancer Immunol Immunother. 58 (1), 2009, cc.95-109.

Краткое изложение сущности изобретения

Задачи, положенные в основу настоящего изобретения

Настоящее изобретение было создано с учетом вышеуказанных обстоятельств. В основу настоящего изобретения была положена задача создать пригодные для лечения рака полипептидные комплексы, которые обладают способностью приближать Т-клетки к раковой клетки-мишени и позволяют использовать цитотоксическую активность Т-клеток в отношении раковых клеток-мишеней, способы получения полипептидных комплексов и терапевтических агентов, которые содержат указанный полипептидный комплекс в качестве действующего вещества для индукции клеточной цитотоксичности. Другой задачей настоящего изобретения является разработка фармацевтических композиций, предназначенных для лечения или предупреждения различных видов рака, которые содержат в качестве действующего вещества указанный выше терапевтический агент для индукции цитотоксичности, и терапевтических способов, заключающихся в применении указанных фармацевтических композиций.

Средства решения указанных задач

При создании изобретения были открыты новые полипептидные комплексы, которые сохраняют сильную противоопухолевую активность, присущую BiTE, и обладают длительным временем полужизни в крови, а также очень высокой безопасностью, что приводит к отсутствию индукции независимого от ракового антигена «цитокинового шторма» или т.п. При создании настоящего изобретения установлено также, что при замене антигенсвязывающих доменов полипептидных комплексов полипептидные комплексы могут повреждать различные клетки-мишени. Основываясь на указанных выше данных, при создании настоящего изобретения продемонстрировано, что полипептидные комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, повреждают раковые клетки. При создании настоящего изобретения установлено также, что путем регуляции ассоциации на поверхности раздела CH1/CL и интродукции модификаций типа «выступы-во-впадины» («выступ-впадина») (Knobs-into-Holes (KiH)) в полипептидные комплексы достигается более эффективная клеточная цитотоксичность. Кроме того, при создании настоящего изобретения продемонстрировано, что с использованием терапевтических агентов для индукции клеточной цитотоксичности, которые содержат в качестве действующего вещества полипептидный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, можно лечить или предупреждать различные виды рака.

Более конкретно, в настоящем изобретении предложены:

[1] полипептидный комплекс, который содержит:

(1) антигенсвязывающий домен;

(2) домен, содержащий Fc-область, которая обладает пониженной активностью связывания с Fcγ-рецептором; и

(3) домен, связывающий комплекс Т-клеточного рецептора;

[2] полипептидный комплекс по п.[1], в котором домен, связывающий комплекс Т-клеточного рецептора, представляет собой домен, связывающий Т-клеточный рецептор;

[3] полипептидный комплекс по п.[1], в котором домен, связывающий комплекс Т-клеточного рецептора, представляет собой CD3-связывающий домен;

[4] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[3], в котором антигенсвязывающий домен представляет собой двухвалентный антигенсвязывающий домен;

[5] полипептидный комплекс по п.[4], в котором двухвалентный антигенсвязывающий домен представляет собой домен, имеющий структуру F(ab')2;

[6] полипептидный комплекс по п.[5], в котором два полипептида, образующие константную область тяжелой цепи домена, который имеет структуру F(ab')2, индивидуально сцеплены с любым из двух полипептидов, образующих Fc-домен;

[7] полипептидный комплекс по п.[6], в котором CD3-связывающий домен сцеплен с любым из двух или с обоими СН3, образующими Fc-домен;

[8] полипептидный комплекс по п.[7], в котором Fv-фрагмент тяжелой цепи, образующий CD3-связывающий домен, сцеплен с одним из СН3, образующих Fc-домен, и Fv-фрагмент легкой цепи, образующий CD3-связывающий домен, сцеплен с другим СН3, образующим Fc-домен;

[9] полипептидный комплекс по п.[8], в котором СН1-домен антитела сцеплен с Fv-фрагментом тяжелой цепи, образующим CD3-связывающий домен, и CL-домен антитела сцеплен с Fv-фрагментом легкой цепи;

[10] полипептидный комплекс по п.[6], в котором CD3-связывающий домен сцеплен с любым из двух или с обоими CL, образующими F(ab')2;

[11] полипептидный комплекс по п.[6], в котором CD3-связывающий домен сцеплен с любой из двух или с обеими VH, образующими F(ab')2;

[12] полипептидный комплекс по п.[6], в котором CD3-связывающий домен сцеплен с любой из двух или с обоими VL, образующими F(ab')2;

[13] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[12], в котором CD3-связывающий домен представляет собой Fv;

[14] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[7] и [10]-[12], в котором CD3-связывающий домен представляет собой Fab;

[15] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[7] и [10]-[12], в котором CD3-связывающий домен представляет собой scFv;

[16] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[15], в котором CD3-связывающий домен является одновалентным;

[17] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[3], в котором антигенсвязывающий домен представляет собой одновалентный scFv и одновалентный Fab;

[18] полипептидный комплекс по п.[17], в котором одновалентный scFv сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через scFv, который образует CD3-связывающий домен; Fv-фрагмент тяжелой цепи одновалентного Fab сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через СН1-домен; и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с CL-доменом;

[19] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[3], в котором антигенсвязывающий домен представляет собой двухвалентный scFv;

[20] полипептидный комплекс по п.[19], в котором один одновалентный scFv сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через Fv-фрагмент тяжелой цепи, образующий CD3-связывающий домен, и другой одновалентный scFv сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен, через Fv-фрагмент легкой цепи, образующий CD3-связывающий домен;

[21] полипептидный комплекс по п.[19], в котором один одновалентный scFv сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через scFv, образующий CD3-связывающий домен, и другой одновалентный scFv сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен;

[22] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[3], в котором антигенсвязывающий домен и домен, связывающий комплекс Т-клеточного рецептора, каждый представляет собой одновалентный Fab;

[23] полипептидный комплекс по п.[22], в котором Fv-фрагмент тяжелой цепи одновалентного Fab, образующего антигенсвязывающий домен, сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через СН1-домен и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с CL-доменом; и Fv-фрагмент тяжелой цепи Fab, образующего домен, связывающий Т-клеточный рецептор, сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен, через СН1-домен и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с CL-доменом;

[24] полипептидный комплекс по п.[22], в котором Fv-фрагмент одновалентного Fab, образующего антигенсвязывающий домен, сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через СН1-домен и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с CL-доменом; и Fv-фрагмент легкой цепи Fab, образующего домен, связывающий Т-клеточный рецептор, сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен, через СН1-домен и Fv-фрагмент тяжелой цепи Fab сцеплен с CL-доменом;

[25] полипептидный комплекс по п.[22], в котором Fv-фрагмент тяжелой цепи одновалентного Fab, образующего антигенсвязывающий домен, сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через СН1-домен и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с CL-доменом; и Fv-фрагмент тяжелой цепи Fab, образующего домен, связывающий Т-клеточный рецептор, сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен, через CL-домен и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с СН1-доменом;

[26] полипептидный комплекс по п.[22], в котором Fv-фрагмент тяжелой цепи одновалентного Fab, образующего домен, связывающий Т-клеточный рецептор, сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через СН1-домен и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с CL-доменом; и Fv-фрагмент легкой цепи Fab, образующего антигенсвязывающий домен, сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен, через СН1-домен и Fv-фрагмент тяжелой цепи Fab сцеплен с CL-доменом;

[27] полипептидный комплекс по п.[22], в котором Fv-фрагмент тяжелой цепи одновалентного Fab, образующего домен, связывающий Т-клеточный рецептор, сцеплен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, через СН1-домен; и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с CL-доменом; и Fv-фрагмент тяжелой цепи Fab, образующего антигенсвязывающий домен, сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен, через CL-домен, и Fv-фрагмент легкой цепи Fab сцеплен с СН1-доменом;

[28] полипептидный комплекс по п.[22] который содержит:

(1) антигенсвязывающий домен, в котором Fv-фрагмент тяжелой цепи одновалентной структуры Fab, который связывается с антигеном, сцеплен через СН1-домен с одним из полипептидов, образующих Fc-домен, и Fv-фрагмент легкой цепи структуры Fab сцеплен с CL-доменом; и

(2) домен, связывающий комплекс Т-клеточного рецептора, в котором Fv-фрагмент тяжелой цепи одновалентной структуры Fab, который связывается с комплексом Т-клеточного рецептора, сцеплен через СН1 с другим полипептидом, образующим Fc-домен, и Fv-фрагмент легкой цепи структуры Fab сцеплен с CL-доменом;

при этом электрические заряды СН1- и CL-доменов контролируют таким образом, чтобы Fv-фрагмент тяжелой цепи антигенсвязывающего домена соединялся с Fv-фрагментом легкой цепи антигенсвязывающего домена или Fv-фрагмент тяжелой цепи домена, связывающего Т-клеточный рецептор, соединялся с Fv-фрагментом легкой цепи домена, связывающего Т-клеточный рецептор;

[29] полипептидный комплекс по п.[28], в котором аминокислотный остаток в СН1-домене, сцепленный с Fv-фрагментом тяжелой цепи домена, связывающего комплекс Т-клеточного рецептора, имеет такой же тип электрического заряда, что аминокислотный остаток в CL-домене, сцепленный с Fv-фрагментом антигенсвязывающего домена;

[30] полипептидный комплекс по п.[28], в котором аминокислотный остаток в СН1-домене, сцепленный с Fv-фрагментом тяжелой цепи антигенсвязывающего домена, имеет такой же тип электрического заряда, что аминокислотный остаток в CL-домене, сцепленный с Fv-фрагментом легкой цепи домена, связывающего комплекс Т-клеточного рецептора;

[31] полипептидный комплекс по [28], в котором аминокислотный остаток в СН1-домене, сцепленный с Fv-фрагментом тяжелой цепи домена, связывающего комплекс Т-клеточного рецептора, имеет такой же тип электрического заряда, что аминокислота в CL-домене, сцепленная с Fv-фрагментом легкой цепи антигенсвязывающего домена, и аминокислотный остаток в СН1-домене, сцепленный с Fv-фрагментом тяжелой цепи антигенсвязывающего домена, имеет такой же тип электрического заряда, что аминокислота в CL-домене, сцепленная с Fv-фрагментом легкой цепи домена, связывающего комплекс Т-клеточного рецептора;

[32] полипептидный комплекс по п.[29] или [31], в котором аминокислотный остаток в СН1-домене, сцепленный с Fv-фрагментом тяжелой цепи домена, связывающего комплекс Т-клеточного рецептора, имеет электрический заряд, противоположный заряду аминокислотного остатка в CL-домене, сцепленного с Fv-фрагментом легкой цепи связывающего Т-клеточный рецептор домена;

[33] полипептидный комплекс по п.[30] или [31], в котором аминокислотный остаток в СН1-домене, сцепленный с Fv-фрагментом тяжелой цепи антигенсвязывающего домена, имеет электрический заряд, противоположный заряду аминокислотного остатка в CL-домене, сцепленного с Fv-фрагментом легкой цепи антигенсвязывающего домена;

[34] полипептидный комплекс по одному из пп.[22]-[33], в котором домен, связывающий комплекс Т-клеточного рецептора, представляет собой домен, связывающий Т-клеточный рецептор;

[35] полипептидный комплекс по п.[34], в котором домен, связывающий Т-клеточный рецептор, представляет собой CD3-связывающий домен;

[36] полипептидный комплекс по п.[32] или [33], в котором аминокислотные остатки в СН1- и CL-доменах представляют собой одну, две или большее количество комбинаций аминокислотных остатков, выбранных из группы, включающей комбинации:

(а) аминокислотного остатка в положении 147 (EU-нумерация) в СН1-домене и аминокислотного остатка в положении 180 (EU-нумерация) в CL-домене;

(б) аминокислотного остатка в положении 147 (EU-нумерация) в СН1-домене и аминокислотного остатка в положении 131 (EU-нумерация) в CL-домене;

(в) аминокислотного остатка в положении 147 (EU-нумерация) в СН1-домене и аминокислотного остатка в положении 164 (EU-нумерация) в CL-домене;

(г) аминокислотного остатка в положении 147 (EU-нумерация) в СН1-домене и аминокислотного остатка в положении 138 (EU-нумерация) в CL-домене;

(д) аминокислотного остатка в положении 147 (EU-нумерация) в СН1-домене и аминокислотного остатка в положении 123 (EU-нумерация) в CL-домене; и

(е) аминокислотного остатка в положении 175 (EU-нумерация) в СН1-домене и аминокислотного остатка в положении 160 (EU-нумерация) в CL-домене;

и в котором аминокислотный остаток в СН1-домене имеет электрический заряд, противоположный заряду аминокислотного остатка в CL-домене;

[37] полипептидный комплекс по п.[36], в котором аминокислотные остатки выбраны из группы, дополнительно включающей комбинацию аминокислотных остатков:

(ж) аминокислотного остатка в положении 213 (EU-нумерация) в СН1-домене и аминокислотного остатка в положении 123 (EU-нумерация) в CL-домене;

[38] полипептидный комплекс по п.[36] или [37], в котором аминокислотный остаток, имеющий противоположный электрический заряд, выбран из аминокислотного остатка, входящего в любую из групп:

(X) глутаминовая кислота (Е) и аспарагиновая кислота (D); или

(Y) лизин (K), аргинин (R) и гистидин (Н);

[39] полипептидный комплекс по одному из пп.[36]-[38], в котором аминокислотные остатки, имеющие противоположный электрический заряд, представляют собой:

Lys в положении 175 (EU-нумерация) в СН1-домене и Glu в положениях 131, 160 и 180 (EU-нумерация) в CL-домене;

[40] полипептидный комплекс по одному из пп.[36]-[38], в котором аминокислотные остатки, имеющие противоположный электрический заряд, представляют собой:

Glu в положениях 147 и 175 (EU-нумерация) в СН1-домене и Lys в положениях 131, 160 и 180 (EU-нумерация) в CL-домене;

[41] полипептидный комплекс по п.[40], в котором аминокислотный остаток в положении 213 (EU-нумерация) в СН1-домене представляет собой Glu и аминокислотный остаток в положении 123 (EU-нумерация) в CL-домене представляет собой Lys;

[42] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[41], в котором Fc-домен характеризуется пониженной активностью связывания с Fcγ-рецептором в отношении FcγI, FcγIIA, FcγIIB, FcγIIIA и/или FcγIIIB;

[43] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[42], в котором Fc-домен представляет собой любой из Fc-доменов, имеющих SEQ ID NO:23, 24, 25 и 26, в котором аминокислота(ы), образующая(ие) Fc-домен, изменена(ы) в результате мутации;

[44] полипептидный комплекс по п.[43], в котором Fc-домен содержит любую из указанных ниже аминокислот:

аминокислотную последовательность, простирающуюся от положения 118 до положения 260 (EU-нумерация), которая представляет собой последовательность SEQ ID NO:24; или

аминокислотную последовательность, простирающуюся от положения 261 до положения 447 (EU-нумерация), которая представляет собой последовательность SEQ ID NO:26;

[45] полипептидный комплекс по п.[43], в котором аминокислоты, образующие Fc-домен, содержат мутацию в любом из следующих положений: 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331 и 332 (EU-нумерация);

[46] полипептидный комплекс по п.[45], в котором Fc-домен содержит мутацию в аминокислотах SEQ ID NO:23, образующих Fc-домен;

[47] полипептидный комплекс по п.[46], в котором Fc-домен представляет собой Fc-домен, содержащий аминокислотную замену в положении 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330 или 331 (EU-нумерация) на аминокислоту, присутствующую в соответствующем положении (EU-нумерация) в соответствующем IgG2 или IgG4;

[48] полипептидный комплекс по п.[46], в котором Fc-домен содержит аминокислотную мутацию в положении 234, 235 или 297 (EU-нумерация);

[49] полипептидный комплекс по п.[48], в котором аминокислота(ы) в положении 234, 235 и/или 297 заменена(ы) на аланин;

[50] полипептидный комплекс по одному из пп.[43]-[49], в котором последовательности двух полипептидов, образующих Fc-домен, отличаются друг от друга;

[51] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[50], в котором аминокислота в положении 349 заменена на цистеин и аминокислота в положении 366 (EU-нумерация) заменена на триптофан в последовательности аминокислотных остатков одного из двух полипептидов, образующих Fc-домен; и в котором аминокислота в положении 356 заменена на цистеин, аминокислота в положении 366 заменена на серин, аминокислота в положении 368 заменена на аланин и аминокислота в положении 407 (EU-нумерация) заменена на валин в последовательности аминокислотных остатков другого полипептида;

[52] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[50], в котором аминокислота в положении 356 (EU-нумерация) заменена на лизин в последовательности аминокислотных остатков одного из двух полипептидов, образующих Fc-домен; аминокислота в положении 439 (EU-нумерация) заменена на глутаминовую кислоту в другом полипептиде; и аминокислота в положении 435 (EU-нумерация) заменена на аргинин в последовательности аминокислотных остатков любого из двух полипептидов;

[53] полипептидный комплекс по п.[51] или [52], в котором последовательность GK удалена в результате делеции из карбоксильных концов двух полипептидов, образующих Fc-домен;

[54] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[53], в котором антигенсвязывающие домены связываются с одним и тем же эпитопом;

[55] полипептидный комплекс по [54], где указанный эпитоп присутствует в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;

[56] полипептидный комплекс по [54], где указанный эпитоп присутствует в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;

[57] полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[53], в котором каждый из антигенсвязывающих доменов связывается с различным (другим) эпитопом;

[58] полипептидный комплекс по п.[57], где указанный другой эпитоп присутствует в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;

[59] полипептидный комплекс по п.[57], где другой эпитоп присутствует в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;

[60] полинуклеотид, кодирующий полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[59];

[61] вектор, содержащий полинуклеотид по п.[60];

[62] клетка, содержащая вектор по п.[61];

[63] способ получения полипептидного комплекса, заключающийся в том, что культивируют клетку по п.[62] и выделяют полипептидный комплекс из супернатанта культуры;

[64] терапевтический агент для индукции клеточной цитотоксичности, который содержит в качестве действующего вещества полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[59];

[65] терапевтический агент по п.[64], где терапевтический агент для индукции клеточной цитотоксичности представляет собой терапевтический агент, применяемый при раке;

[66] терапевтический агент по п.[65], где рак представляет собой рак печени или рак легкого;

[67] способ лечения или предупреждения рака, заключающийся в том, что полипептидный комплекс по одному из пп.[1]-[59] вводят пациенту, который нуждается в этом; и

[68] терапевтический или профилактический способ по п.[67], в котором рак представляет собой рак печени или рак легкого.

Настоящее изобретение относится также у наборам, предназначенным для применения в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, которые содержат полипептидный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, или полипептидный комплекс, полученный с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Настоящее изобретение относится также к применению полипептидного комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, или полипептидного комплекса, полученного с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, для приготовления терапевтического агента для индукции клеточной цитотоксичности. Настоящее изобретение относится также к полипептидным комплексам, предлагаемым в настоящем изобретении, или полипептидным комплексам, полученным с помощью способов, предлагаемых в изобретении, для применения в способе, предлагаемом в настоящем изобретении.

Результаты изобретения

В настоящем изобретении предложены новые полипептидные комплексы, которые сохраняют сильную противоопухолевую активность BiTE и обладают длительным временем полужизни в крови, а также очень высокой безопасностью, что приводит к отсутствию индукции независимого от ракового антигена «цитокинового шторма» или т.п. Когда изменяют антигенсвязывающий домен полипептидного комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, то терапевтические агенты, которые содержат полипептидный комплекс в качестве действующего вещества для индукции клеточной цитотоксичности, могут направленно воздействовать и повреждать различные клетки, включая раковые клетки. Таким образом, можно лечить или предупреждать различные виды рака. Это обеспечивает требуемое лечения, которое является высоко безопасным и удобным и снижает физическую нагрузку на пациентов.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - график, на котором представлено сравнение цитотоксической активности следующих антител к GPC3 (антиген, принадлежащий к семейству GPI-заякоренных рецепторов): GPC3 ERY1 (GPC3 BiTE), GPC3 ERY2 и антитела к GPC3 IgG-типа. Закрашенным квадратом (■), закрашенным треугольником (▲) и незакрашенным квадратом (□) обозначена цитотоксическая активность GPC3 ERY1 (GPC3 BiTE), GPC3 ERY2 и антитела к GPC3 IgG-типа соответственно;

на фиг.2 - график, на котором представлено сравнение цитотоксической активности GPC3 BiTE и GPC3 ERY5. Закрашенным квадратом (■) и незакрашенным кружком (○) обозначена цитотоксическая активность GPC3 BiTE и GPC3 ERY5 соответственно;

на фиг.3 - график, на котором представлено сравнение цитотоксической активности GPC3 BiTE и GPC3 ERY6. Закрашенным квадратом (■) и закрашенным треугольником (▲) обозначена цитотоксическая активность GPC3 BiTE и GPC3 ERY6 соответственно;

на фиг.4 - график, на котором представлено сравнение цитотоксической активности GPC3 BiTE и GPC3 ERY7. Закрашенным квадратом (■) и закрашенным ромбом (♦) обозначена цитотоксическая активность GPC3 BiTE и GPC3 ERY7 соответственно;

на фиг.5 - график, на котором представлено сравнение цитотоксической активности GPC3 BiTE, GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1 и GPC3 ERY10-1. Закрашенным квадратом (■), закрашенным треугольником (▲), незакрашенной окружностью (○) и незакрашенным квадратом (□) обозначена цитотоксическая активность GPC3 BiTE, GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1 и GPC3 ERY10-1 соответственно;

на фиг.6 - график, демонстрирующий противоопухолевое действие in vivo GPC3 ERY8-2 на предварительно смешанной (pre-mix) модели PC-10. Незакрашенным квадратом (□) и закрашенным ромбом (♦) обозначены изменения объема опухолей в группе, для обработки которой применяли GPC3 ERY7, и контрольной (обработка ЗФР) группе соответственно;

на фиг.7 - график, демонстрирующий противоопухолевое действие in vivo GPC3 ERY10-1 на предварительно смешанной (pre-mix) модели PC-10. Незакрашенным квадратом (□) и закрашенным ромбом (♦) обозначены изменения объема опухолей в группе, для обработки которой применяли GPC3 ERY10-1, и контрольной (обработка ЗФР) группе соответственно;

на фиг.8 - график, демонстрирующий противоопухолевое действие in vivo GPC3 ERY10-1 при моделировании на PC-10 Т-клеточного переноса. Незакрашенным квадратом (□) и закрашенным ромбом (♦) обозначены изменения объема опухолей в группе, для обработки которой применяли GPC3 ERY10-1, и контрольной (обработка ЗФР) группе соответственно;

на фиг.9 - график, на котором представлена зависимость от времени концентраций в плазме GPC3 ERY9-1 и GPC3 ERY10-1, определенных с использованием экспрессирующих GPC3 клеток Ba/F3. Закрашенным ромбом (♦) и незакрашенным квадратом (□) обозначена зависимость от времени концентрации в плазме GPC3 ERY9-1 и GPC3 ERY10-1 соответственно;

на фиг.10 - график, на котором представлена зависимость от времени концентраций в плазме GPC3 ERY9-1 и GPC3 ERY10-1, определенных с использованием экспрессирующих CD3 клеток Ba/F3. Закрашенным ромбом (♦) и незакрашенным квадратом (□) обозначена зависимость от времени концентрации в плазме GPC3 ERY9-1 и GPC3 ERY10-1 соответственно;

на фиг.11 - график, демонстрирующий способность GPC3 BiTE, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1, GPC3 ERY15-1 и катумаксомаба индуцировать цитокины независимым от ракового антигена образом;

на фиг.12 - график, демонстрирующий цитотоксичность in vitro GPC3 ERY18 LI, GPC3 ERY18L2, GPC3 ERY18L3, GPC3 ERY18L4 и GPC3 ERY18S1. Закрашенным треугольником (▲), закрашенным кружком (•), закрашенным квадратом (■), незакрашенным квадратом (□) и незакрашенным ромбом (◊) обозначена цитотоксическая активность GPC3 ERY18 L1, GPC3 ERY18 L2, GPC3 ERY18 L3, GPC3 ERY18 L4 и GPC3 ERY18 S1 соответственно;

на фиг.13 - график, на котором представлено сравнение цитотоксической активности in vitro GPC3 ERY18 L3 и GPC3 ERY10-1. Закрашенным квадратом (■) и незакрашенным квадратом (□) обозначена цитотоксическая активность GPC3 ERY18 L3 и GPC3 ERY10-1 соответственно;

на фиг.14 - график, на котором представлено сравнение цитотоксической активности in vitro GPC3 ERY19-3 и GPC3 BiTE. Незакрашенным квадратом (□) и закрашенным квадратом (■) обозначена цитотоксическая активность GPC3 ERY19-3 и GPC3 BiTE соответственно;

на фиг.15А - хроматограмма, демонстрирующая результаты анализа с использованием гель-фильтрации СМ, в которых происходит экспрессия NTA1L/NTA1R/GC33-k0. На фиг.15Б - хроматограмма, демонстрирующая результаты анализа с использованием гель-фильтрации СМ, в которых происходит экспрессия NTA2L/NTA2R/GC33-k0;

на фиг.16 - диаграммы, на которых показаны домены, образующие следующие полипептидные комплексы, описанные в примерах, которые представлены в настоящем описании: GPC3 BiTE, GPC3 ERY2, GPC3 ERY5, GPC3 ERY6, GPC3 ERY7, GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY 10-1, GPC3 ERY15, GPC3 ERY18 и GPC3 ERY19-3. Домен, заштрихованный перекрестными линиями, обозначает вариабельную область Н-цепи антитела к раковому антигену (GPC3, ЕрСАМ, EGFR); домен с диагональными линиями обозначает вариабельную область L-цепи антитела к раковому антигену (GPC3, ЕрСАМ, EGFR); домен с пунктирными линиями обозначает вариабельную область Н-цепи антитела к CD3; закрашенный домен обозначает вариабельную область L-цепи антитела к CD3; незакрашенный домен обозначает константную область антитела; крестик обозначает молчащую мутацию в Fc и звездочка обозначает мутацию, усиливающую гетеромерную ассоциацию Fc;

на фиг.17 - диаграммы GPC3 BiTE (A); GPC3 ERY 10 (Б); GPC3 ERY2 (В); GPC3 ERY5 (Г); GPC3 ERY6 (Д); GPC3 ERY7 (Е); GPC3 ERY8-2 (Ж); GPC3 ERY9-1 (3); GPC3 ERY10-1 (И); GPC3 ERY15 (К); GPC3 ERY18 (Л) и GPC3 ERY19-3 (М);

на фиг.18 - аминокислотные остатки, образующие Fc-домены IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и их EU-нумерация по Кэботу (в контексте настоящего описания обозначен также как «EU-индекс»);

на фиг.19 - диаграммы, на которых показаны домены, образующие полипептидные комплексы, описанные в примерах, которые представлены в настоящем описании: GPC3 ERY17-2, GPC3 ERY17-3, ЕрСАМ ERY17-2 и ЕрСАМ ERY17-3. Домен, заштрихованный перекрестными линиями, обозначает вариабельную область Н-цепи антитела к раковому антигену (GPC3, ЕрСАМ, EGFR); домен с диагональными линиями обозначает вариабельную область L-цепи антитела к раковому антигену (GPC3, ЕрСАМ, EGFR); домен с пунктирными линиями обозначает вариабельную область Н-цепи антитела к CD3; закрашенный домен обозначает вариабел