Добавление железа для улучшения культивирования клеток

Добавление железа для улучшения культивирования клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США №61/550,058, поданной 21 октября 2011 г., полное содержание которой включено в данное описание путем ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Распространенной проблемой при культивировании клеток является гибель клеток в конце культивирования, которые могут быть вызваны разными факторами, такими, как потеря питательных веществ, накопление ингибитора, и/или окислительный стресс и другие. Большой интерес в целом и, в частности, для тех, кто использует системы культивирования клеток млекопитающих, вызывает экспрессия фармацевтически релевантных белковых продуктов, поддержание жизнеспособности клеток и/или задержка гибели клеток в процессе культивирования клеток. Применяются разные способы с целью повышения жизнеспособности культур клеток, такие, как применение добавок к питательной среде и сверхэкспрессия антиапоптозных генов. См., например, публикации Arden, et al. “Chemical caspase inhibitors enhance cell culture viabilities and protein titer” Biotechnol Prog. 2007 Mar-Apr; 23 (2): 506-511; Mastrangelo, et al. “Antiapoptosis chemicals prolong productive lifetimes of mammalian cells upon Sindbis virus vector infection” Biotechnol Bioeng. 1999 Nov 5; 65 (3): 298-305; Balcarcel, et al. “Rapamycin Reduces Hybridoma Cell Death and Enhances Monoclonal Antibody Production” Biotechnology and Bioengineering, 2001 Vol. 76, 1-10; Zanghi et al. “The growth factor inhibitor suramin reduces apoptosis and cell aggregation in protein-free CHO cell batch cultures. “Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325; Simpson, et al. “Prevention of hybridoma cell death by bcl-2 during suboptimal culture conditions” Biotechnol Bioeng 1997, 54: 1-16; Singh, ef al. “Enhancement of survivability of mammalian cells by overexpression of the apoptosis suppressor gene bcl-2.” Biotechnol Bioeng. 1996, 52: 166-175; Mastrangelo, et al. “Overexpression of bcl-2 family members enhances survival of mammalian cells in response to various culture insults.” Biotechnology and Bioengineering, 2000, Vol 67, 555-564; Arden, et al. "Inhibiting the apoptosis pathway using MDM2 in mammalian cell cultures.” Biotechnology and Bioengineering, 2007; Vol. 97, 601-614). Однако в некоторых случаях применение добавок к питательной среде может задерживать прогрессирование клеточного цикла, в результате чего снижается плотность клеток, а значит, и производительность. Некоторые добавки к питательной среде могут защищать клетки от апоптоза во время фазы роста, однако они неэффективны во время фазы гибели. Кроме того, большинство добавок к питательной среде дороги, из-за чего крупномасштабное фармацевтическое производство может быть невыполнимым. Для сверхэкспрессии антиапоптозных генов трансфекция генов затруднена, и эффект может зависеть от конкретного случая.

Таким образом, существует необходимость в улучшении культивирования клеток для повышения жизнеспособности, плотности и/или титра клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает неожиданное обнаружение того факта, что добавление железа, в частности, высокой концентрации железа, к среде для культивирования клеток, помимо обеспечения других преимуществ, может значительно улучшить плотность, жизнеспособность и/или титр клеток в культуре. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает эффективное, но недорогое и простое решение, касающееся улучшения культивирования клеток. Настоящее изобретение, в частности, может применяться для улучшения жизнеспособности в конце продленного культивирования клеток.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток в культуре клеток, включая этапы обеспечения клеток в среде для культивирования клеток для начала процесса культивирования клеток (например, процесса культивирования продуцирующих клеток) и добавление композиции, включающей железо, к вышеупомянутой среде для культивирования клеток в процессе культивирования клеток, таким образом, чтобы концентрация железа в среде для культивирования клеток повышалась в течение процесса культивирования клеток.

Согласно настоящему изобретению, композиция, включающая железо, может быть выбрана из различных железосодержащих соединений. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую железо, выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления способы в соответствии с настоящим изобретением включают добавление композиции, включающей железо, в ряд моментов на протяжении процесса культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют после 0-го дня. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в 1-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 3-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 6-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 9-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в разные моменты времени в процессе культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток (например, после одного или нескольких добавлений композиции, включающей железо) составляет от 100 мкМ до 5 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток составляет от 300 мкМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток составляет 1 мМ.

В соответствии с настоящим изобретением могут применяться различные типы клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления, клетки являются клетками млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих выбирают из линии миеломы мыши BALB/c, ретинобластов человека (PER.C6), клеток почек обезьян, клеток мезонефроса человека (293), клеток почек новорожденного хомяка (ВНК), клетки яичника китайского хомячка (СНО), клеток Сертоли мыши, клеток почек африканской зеленой мартышки (VERO-76), клеток карциномы шейки матки человека (HeLa), клеток почек собаки, клеток печени серой крысы, клеток легких человека, клеток печени человека, клеток опухоли молочной железы мышей, клеток TRI, клеток MRC 5, клеток FS4 или линии гепатомы человека (Hep G2). В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих являются клетками СНО.

В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс культивирования с подпиткой. В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс культивирования с повторной подпиткой. В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс перфузионного культивирования. В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс крупномасштабного культивирования. В некоторых вариантах осуществления объем среды для культивирования клеток составляет как минимум приблизительно 500 л. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток осуществляют во встряхиваемых колбах.

В некоторых вариантах осуществления добавляют дополнительные белки для улучшения плотности, жизнеспособности и/или титра культуры клеток. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток не содержит гидролизатов. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток содержит гидролизаты.

В некоторых вариантах осуществления клетки включают ген, кодирующий а рекомбинантный белок. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок представляет собой антитело или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело против IL-22. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело против GDF8. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело Муо29. В некоторых вариантах осуществления антитело является однодоменным антителом. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело является нанотелом против TNF. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок представляет собой гликопротеин. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок является терапевтическим белком. В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок представляет собой антитело, фактор роста, коагулирующий фактор, цитокин, слитый белок, лекарственное вещество, вакцину, фермент или Small Modular ImmunoPharmaceutical™ (иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера - SMIP). В некоторых вариантах осуществления описываемые авторами способы согласно изобретению также включают этап очистки рекомбинантного белка.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный белок, вырабатываемый клетками, культивируемыми в соответствии с описываемыми авторами способами согласно изобретению.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы предотвращения или задержки гибели клеток в культуре клеток путем добавления композиции, включающей железо, в один или несколько моментов времени после начала процесса культивирования клеток.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы ингибирования апоптоза в культуре клеток путем добавления композиции, включающей железо, в один или несколько моментов времени после начала процесса культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют после 0-го дня. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 3-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 6-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 9-й день или после него.

В некоторых вариантах осуществления железо добавляют в таком количестве, чтобы концентрация в среде для культивирования клеток составляла от 100 мкМ до 5 мМ. В некоторых вариантах осуществления железо добавляют в таком количестве, чтобы концентрация в среде для культивирования клеток составляла от 300 мкМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления железо в таком количестве, чтобы концентрация в среде для культивирования клеток составляла 1 мМ.

В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой культивирование с подпиткой. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой культивирование с повторной подпиткой. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой перфузионное культивирование. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой процесс крупномасштабного культивирования. В некоторых вариантах осуществления объем культуры клеток составляет как минимум приблизительно 500 л. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток осуществляют во встряхиваемых колбах.

В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает, помимо прочего, комплекты для приготовления среды для культивирования клеток, которая включает один или несколько реагентов для приготовления первичной среды для культивирования клеток, и отдельную композицию, включающую железо. В некоторых вариантах осуществления комплект включает инструкцию по добавлению отдельной композиции, включающей железо, к первичной среде для культивирования клеток в один или несколько моментов времени в течение процесса культивирования клеток, например, для повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток.

В некоторых вариантах осуществления отдельная композиция, включающая железо, предусмотрена в таком количестве, чтобы концентрация составляла от 100 мкМ до 5 мМ в первичной среде для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления отдельная композиция предусмотрена в таком количестве, чтобы концентрация составляла от 100 мкМ до 5 мМ в культуре клеток как минимум 500 л.

В некоторых вариантах осуществления отдельную композицию выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления комплект также включает дополнительные компоненты для культивирования с подпиткой. В некоторых вариантах осуществления комплект также включает дополнительные компоненты для культивирования с повторной подпиткой. В некоторых вариантах осуществления комплект также включает дополнительные компоненты для перфузионного культивирования. В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты выбирают из группы, к которой относятся гормоны и/или другие факторы роста, неорганические ионы, буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы, аминокислоты, липиды, глюкоза или другие источники энергии, и их комбинации.

В этой заявке применение союза “или” означает “и/или”, если не указано иного. Применяемый в этой заявке термин “включать” и варианты этого термина, такие, как “включая” и “включает”, не предполагают исключения других добавок, компонентов, целых чисел или этапов. В контексте данного описания термины “приблизительно” и “примерно” употребляются как равноценные. Любые числительные, применяемые в этой заявке, с уточнением “приблизительно/примерно” или без него, охватывают любые нормальные отклонения, которые известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления термин “приблизительно” или “примерно” относится к диапазону значений в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любом направлении (более или менее) от указанного контрольного значения, если не указано иного, или если иного не вытекает из контекста (за исключением случаев, когда такое число превышает 100% положительного значения).

Другие особенности, цели и преимущества настоящего изобретения станут очевидными по ознакомлении с представленными далее подробным описанием, фигурами и формулой изобретения. Однако следует понимать, что подробное описание, фигуры и формула изобретения, представляя варианты осуществления настоящего изобретения, не ограничивают его объема, а только его поясняют. Различные изменения и модификации в пределах объема изобретения станут очевидными для специалистов в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигуры предназначены лишь для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

Фигура 1. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на рост клеток СНО во встряхиваемых колбах. Рост клеток измеряют как плотность жизнеспособных клеток (VCD) (общее количество жизнеспособных клеток ×10⁶ клеток/мл) в данный момент времени.

Фигура 2. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на жизнеспособность клеток СНО во встряхиваемых колбах. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени.

Фигура 3. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на жизнеспособность клеток СНО на 16 день во встряхиваемых колбах. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени.

Фигура 4. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на титр антитела клеток СНО на 16 день во встряхиваемых колбах. Титр антитела измеряют в граммах антитела/литр культуральной среды. Изменение титра антитела измеряют как соотношение [антитело]_{с железом}/[антитело]_{без железа} в данный момент времени.

Фигура 5. Иллюстративные данные, демонстрирующие улучшение на 14 день плотности, жизнеспособности и титра клеток по сравнению с контролем после добавления 1 мМ железа к процессу культивирования Линии клеток 2. Плотность клеток измеряют как общее количество жизнеспособных клеток ×10⁶ клеток/мл в данный момент времени. Улучшение плотности клеток представляется как соотношение плотности клеток_{с железом}/плотность клеток_{без железа}. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени. Улучшение жизнеспособности измеряют как соотношение % жизнеспособности_{с железом}/% жизнеспособности_{6ез железа}. Титр антитела измеряют в граммах антитела/литр культуральной среды. Изменение титра антитела измеряют как соотношение [антитела]_{с железом}/[антитела]_{без железа} в данный момент времени.

Фигура 6. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) после 3-го дня на жизнеспособность и плотность жизнеспособных клеток Линии клеток 1 при культивировании с подпиткой на 14 день во встряхиваемых колбах. Плотность жизнеспособных клеток измеряют как общее количество жизнеспособных клеток ×10⁶ клеток/мл в данный момент времени. Улучшение плотности жизнеспособных клеток представлено как соотношение плотности клеток_{с железом}/плотности клеток_{без железа}.

Фигура 7. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на жизнеспособность клеток СНО, вырабатывающих нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 8. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на титр клеток СНО, вырабатывающих нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 9. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на общую продуктивность клеток СНО, вырабатывающих нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 10. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на выработку лактата клетками СНО, вырабатывающими нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 11. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) на плотность клеток подпитываемой культуры клона 2.8 во встряхиваемых колбах.

Фигура 12. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) на жизнеспособность подпитываемой культуры клона 2.8 во встряхиваемых колбах.

Фигура 13. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) на общую продуктивность подпитываемой культуры клона 2.8 во встряхиваемых колбах.

Фигура 14. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние разных доз добавляемого железа на 0-й день на жизнеспособность Линии клеток 1 на 3-й день во встряхиваемых колбах. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает, помимо прочего, способы и композиции для повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток продукта путем добавления композиции, включающей железо, в один или несколько моментов времени на протяжении процесса культивирования клеток. Настоящее изобретение включает неожиданное обнаружение того факта, что добавление железа к культуре клеток может задерживать и/или предотвращать гибель клеток в конце культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления добавление железа к культуре клеток может ингибировать апоптоз в культуре клеток.

Железо является важным компонентом среды для культивирования клеток для выращивания клеток млекопитающих. Однако до настоящего изобретения считалось, что низкий уровень железа может ингибировать рост клеток после исчерпание железа, в то время, как высокий уровень железа может ингибировать рост клеток из-за токсичности (например, окислительного стресса и образования свободных радикалов). Таким образом, считалось, что баланс между благоприятными и токсичными свойствами железа важен для культивирования клеток млекопитающих. До настоящего изобретения в традиционных композициях сред применяли низкую концентрацию железа для достаточной поддержки роста клеток с одновременным сохранением уровня концентрации железа ниже токсичного. Как описывается в разделе примеров, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что добавление железа к культуре клеток, включение железа в концентрациях, которые считаются высокими, приводит к улучшению роста клеток и задержке гибели культивируемых клеток, в результате чего, помимо других преимуществ, значительно повышается плотность, жизнеспособность и титр клеток. Такой эффект не зависит от линии клеток, масштаба, продукта, и источника железа. Кроме того, на качество продукта не влияла высокая концентрация железа. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новый и экономичных подход к улучшенному культивированию клеток.

Разные аспекты изобретения подробно описываются в следующих разделах. Эти разделы не ограничивают объем изобретения. Каждый раздел может относиться к любому аспекту изобретения. Однако специалистам в данной области станет понятно, что различные модификации этих вариантов осуществления охватываются объемом прилагаемой формулы изобретения. Именно формула изобретения и ее эквиваленты определяют объем настоящего изобретения, который не ограничивается и не должен ограничиваться этим описанием отдельных вариантов осуществления.

Композиции железа

Большое множество разнообразных железосодержащих композиций может применяться в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В соответствии с настоящим изобретением, железо может применяться в разной концентрации. Как правило, железо обеспечивается в среде в концентрации, превышающей “следовую концентрацию”. Термин “следовая концентрация” в контексте данного описания касается концентрации, уровень которой может быть меньшим, чем поддающийся привычному и простому измерению. Например, следовой уровень соединения может составлять <10^-5, <10^-6, <10^-7 или <10^-8 М. В некоторых вариантах осуществления железо предусмотрено в среде в концентрации от приблизительно 100 мкМ до 5 мМ (например, приблизительно 100 мкМ - 4,5 мМ, 100 мкМ - 3,0 мМ, 100 мкМ - 2,5 мМ, 100 мкМ - 1,0 мМ, 100 мкМ - 1,0 мМ, 200 мкМ - 2,0 мМ, 200 мкМ - 1,5 мМ, 200 мкМ - 1,0 мМ, 150 мкМ - 4,5 мМ, 150 мкМ - 3,5 мМ, 150 мкМ - 2,5 мМ, 150 мкМ - 1,5 мМ, 150 мкМ - 1,0 мМ, 200 мкМ - 1,5 мМ, 200 мкМ - 1,0 мМ, 200 мкМ - 2,5 мМ, 300 мкМ - 2,5 мМ, 300 мкМ - 1,5 мМ, 300 мкМ - 2,0 мМ). В некоторых вариантах осуществления железо предусмотрено в среде в концентрации приблизительно 100 мкМ, 150 мкМ, 200 мкМ, 250 мкМ, 300 мкМ, 350 мкМ, 400 мкМ, 450 мкМ, 500 мкМ, 550 мкМ, 600 мкМ, 650 мкМ, 700 мкМ, 750 мкМ, 800 мкМ, 850 мкМ, 900 мкМ, 950 мкМ, 1 мМ, 1,5 мМ, 2 мМ, 2,5 мМ, 3 мМ, 3,5 мМ, 4 мМ, 4,5 мМ или 5 мМ, или в любом диапазоне этих концентраций. В некоторых вариантах осуществления железо предусмотрено в среде в концентрации от приблизительно 300 мкМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток повышается на протяжении процесса культивирования клеток.

Настоящее изобретение также включает обнаружение того факта, что композиция, включающая железо, может обеспечиваться в среде в любой момент в процессе культивирования клеток. Композиция, включающая железо, может добавляться для достижения желаемой концентрации железа в культуральной среде путем добавления композиции в один или несколько моментов в течение периода времени. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в 0-й день или после 0-го дня процесса культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют после 0-го дня. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20-й день процесса культивирования клеток (например, процесса культивирования продуцирующих клеток) или после них, или при любой комбинации вышеупомянутых моментов. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 3-й день или после него.

Специалист в данной области сможет выбрать точную концентрацию железа и время добавления в этих пределах согласно изобретению на основе конкретных характеристик его экспериментального плана, включая характер культивируемых клеток, характер любого продукта (например, антитела или рекомбинантного белка), вырабатываемого клетками в культуре, присутствия или отсутствия других компонентов в среде, в которой выращивают клетки, и условий роста. Например, клетки, выращиваемые в статичной культуре, могут быть способны более или менее оптимально использовать железо по сравнению с клетками, выращиваемыми во встряхиваемой культуре (см., например, документ WO 94/02592).

Среды для выращивания культур

Термины “среда”, “среда для культивирования клеток” и “культуральная среда” в контексте данного описания означают раствор, содержащий питательные вещества, которые подпитывают растущие клетки млекопитающих. Как правило, такие растворы обеспечивают незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, требуемые клетками для минимального роста и/или выживания. Такой раствор также может содержать дополнительные компоненты, увеличивающие рост и/или выживаемость до показателя, превышающего минимальный, включая, помимо прочих, гормоны и/или другие факторы роста, конкретные ионы (такие, как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низкой конечной концентрации), неорганические соединения, присутствующие в высокой конечной концентрации (например, железо), аминокислоты, липиды и/или глюкоза или другой источник энергии. В некоторых вариантах осуществления pH и концентрацию солей в среде надлежащим образом регулируют до оптимального для выживания и пролиферации клеток уровня. В некоторых вариантах осуществления среда является питательной средой, которую добавляют после начала культивирования клеток.

В соответствии с настоящим изобретением, могут применяться различные среды для роста клеток млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетки могут выращиваться в одной из различных химически определенных сред, причем компоненты сред являются известными и контролируемыми. В некоторых вариантах осуществления клетки могут выращиваться в комплексной среде, в которой не все компоненты являются известными и/или контролируемыми.

Химически определенные среды для роста культивируемых клеток млекопитающих широко разрабатывались и публиковались в течение последних нескольких десятилетий. Все компоненты определенных сред хорошо изучены, и определенные таким образом среды не содержат сложных добавок, таких, как сыворотка или гидролизаты. Первые композиции сред разрабатывались таким образом, чтобы обеспечивалась возможность роста клеток и поддержания жизнеспособности, без учета или почти без учета выработки белка. В последнее время композиции сред разрабатывались с конкретной целью поддержки высокопродуктивных вырабатывающих рекомбинантный белок культур клеток.

Не все компоненты комплексных сред являются хорошо изученными, поэтому комплексные среды могут содержать добавки, к которым, помимо прочих, относятся простые и/или сложные источники углерода, простые и/или сложные источники азота и сыворотка. В некоторых вариантах осуществления комплексные среды, подходящие с точки зрения настоящего изобретения, содержит добавки, такие, как гидролизаты, в дополнение к другим компонентам описанной авторами определенной среды.

В некоторых вариантах осуществления определенные среды, как правило, включают примерно пятьдесят химических структурных единиц в известной концентрации в воде. Большинство из них также содержат один или несколько хорошо изученных белков, таких, как инсулин, IGF-1, трансферрин или BSA, а другие не требуют белковых компонентов и поэтому называются безбелковыми определенными средами. Типичные химические компоненты сред разделяются на пять широких категорий: аминокислоты, витамины, неорганические соли, микроэлементы и смешанную категорию, определяющую чистую категоризацию.

Среда для культивирования клеток необязательно может дополняться и другими компонентами. Термин “дополнительные компоненты” в контексте данного описания означает компоненты увеличивающие рост и/или выживаемость до показателя, превышающего минимальный, включая, помимо прочих, гормоны и/или другие факторы роста, конкретные ионы (такие, как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низкой конечной концентрации), аминокислоты, липиды, и/или глюкоза или другой источник энергии. В некоторых вариантах осуществления к первоначальной культуре клеток могут добавляться дополнительные компоненты. В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты могут добавляться после начала культивирования клеток.

Как правило, к микроэлементам относятся различные неорганические соли, включенные на микромолярном или более низком уровне. Например, часто включаемыми микроэлементами являются цинк, селен, медь и другие. В некоторых вариантах осуществления железо (железистые или железные соли) может быть включено как микроэлемент в первичную среду для культивирования клеток в микромолярной концентрации. Как обсуждалось выше, настоящее изобретение обеспечивает способы, включающие добавление железа дополнительно к следовому количеству железа, присутствующему в первичной среде для культивирования клеток, таким образом, чтобы концентрация железа в среде для культивирования клеток превышала следовое количество (например, более 100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ, 600 мкМ, 700 мкМ, 800 мкМ, 900 мкМ или 1 мМ). Марганец также часто включают среди микроэлементов как двухвалентный катион (MnCl₂ или MnSO₄) в диапазоне концентраций от наномолярной до микромолярной. В наномолярных концентрациях обычно добавляют многие менее распространенные микроэлементы.

Клетки

Любая клетка-хозяин, восприимчивая к культивированию клеток, может использоваться в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является клеткой млекопитающего. Неограничивающими примерами клеток млекопитающих, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть линия миеломы мыши BALB/c (NSO/I, ЕСАСС No: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6, CruCell, Leiden, Нидерланды); линия почек обезьян CV1, трансформированная SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); клетки мезонефроса человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка +/-DHFR (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216, 1980); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251, 1980); клетки почек обезьян (CV1 АТСС CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, АТСС CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клетки легких человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68, 1982); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2).

Кроме того, любое количество выпускаемых или не выпускаемых серийно линий клеток гибридомы может использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Термин “гибридома” в контексте данного описания означает клетку или потомство клетки, получаемые от слияния иммортализованных и вырабатывающих антитело клеток. Такая образуемая в результате гибридома является иммортализованной и вырабатывает антитела. Отдельные клетки, используемые для создания гибридомы, могут быть взяты из организма любого млекопитающего, включая, помимо прочих, крысу, свинью, кролика, овцу, козу и человека. В некоторых вариантах осуществления гибридома представляет собой линию клеток триомы, которая образуется в случае, когда потомство слияний гетерогибридной миеломы, которые являются продуктами слияния между клетками человека и линией клеток миеломы мыши, впоследствии сливается с клетками плазмы. В некоторых вариантах осуществления гибридома может быть любой линией иммортализованных гибридных клеток, которая вырабатывает антитела такой, как, например, квадрогибридомы (см., например, Milstein et al., Nature, 537: 3053, 1983). Специалисту в данной области станет понятно, что линии клеток гибридомы могут иметь различные требования к питанию и/или могут требовать разных условий культивирования для оптимального роста, и существует возможность изменения условий согласно потребности.

Способы культивирования клеток

Термины “культура” и “культура клеток” в контексте данного описания означают популяцию клеток, суспендированную в среде в условиях, подходящих для выживания и/или роста популяции клеток. Как станет понятно специалистам в данной области, в некоторых вариантах осуществления эти термины в контексте данного описания означают комбинацию, включающую популяцию клеток и среду, в которой суспендирована популяция. В некоторых вариантах осуществления клетки культуры клеток включают клетки млекопитающих.

Настоящее изобретение может применяться с любым способом культивирования клеток, к которому применим соответствующий процесс (например, выработка рекомбинантного белка (например, антитела)). В качестве неограничивающего примера, клетки могут выращиваться в периодических или подпитываемых культурах, причем культивирование прекращают после достаточной экспрессии рекомбинантного белка (например, антитела), после чего экспрессированный белок (например, антитело) собирают. В альтернативном варианте, в качестве еще одного неограничивающего примера, клетки могут выращиваться в режиме культивирования с периодическим повторным подпитыванием или перфузионного культивирования, причем культивирование не прекращают и новые питательные вещества и другие компоненты периодически или непрерывно добавляют к культуре, и в это время периодически или непрерывно собирают экспрессированный рекомбинантный белок (например, антитело). Другие подходящие способы (например, культивирование с центрифугированием пробирок) известны специалистам в данной области и могут применяться для практического осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток, подходящее для настоящего изобретения, является культивированием с подпиткой. Термин “культивирование с подпиткой” в контексте данного описания означает способ культивирования клеток, при котором в культуру вводят дополнительные компоненты один или несколько раз после начала процесса культивирования. К таким компонентам обычно относятся питательные компоненты для клеток, истощенных в процессе культивирования. В дополнительном или альтернативном варианте к таким дополнительным компонентам могут относиться описываемые авторами дополнительные компоненты. В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты обеспечиваются в питательной среде, как описывается авторами. Культивирование с подпиткой обычно прекращают в определенный момент и клетки и/или компоненты в среде собирают и необязательно очищают.

В некоторых вариантах осуществления культивированием клеток, подходящим с точки зрения настоящего изобретения, является культивирование с повторной подпиткой. Термин “культивирование с повторной подпиткой” в контексте данного описания означает способ культивирования клеток, при котором часть клеток (например, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизитель