Способы и композиции для лечения болезней мозга

Способы и композиции для лечения болезней мозга

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие предоставляет способы лечения болезни или доставки терапевтического средства млекопитающему, включающие введение в мозжечково-мозговую цистерну и/или желудочек млекопитающего rAAV частицы, содержащей вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический белок, вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, таким образом, что клетки, имеющие доступ к спинномозговой жидкости (CSF), экспрессируют терапевтическое средство и в некоторых вариантах осуществления секретируют терапевтическое средство в CSF для распространения в мозге.

Уровень техники

В настоящее время перенос генов получил широкое признание как мощное средство для анализа биологических событий и хода развития болезней на клеточном и молекулярном уровне. В последние годы применению генной терапии для лечения болезней человека, врожденных (например, дефицита аденозин дезаминазы (ADA)) или приобретенных (например, рака или инфекционной болезни), уделяется значительное внимание. С появлением усовершенствованных методов переноса генов и установлением постоянно расширяющейся библиотеки болезней, связанных с дефектными генами, генная терапия быстро развивается от теории лечения до практического дела.

Согласно сложившимся представлениям, генная терапия определяется как процедура, при которой экзогенный ген вводится в клетки пациента для того, чтобы исправить врожденную генетическую ошибку. Несмотря на то, что более 4500 болезней человека в настоящее время классифицируются как генетические, специфические мутации в геноме человека установлены для относительно немногих из этих болезней. Еще недавно эти редкие генетические болезни представляли эксклюзивные мишени для попыток генной терапии. Соответственно, в настоящее время большинство из одобренных Национальным институтом здоровья (NIH) протоколов генной терапии направлены на введение функциональной копии дефектного гена в соматические клетки индивидуума, имеющего известную врожденную генетическую ошибку. Только недавно исследователи и клиницисты начали принимать во внимание, что большая часть раков человека, отдельные формы сердечно-сосудистых болезней и многие дегенеративные заболевания также имеют важные генетические составляющие, и при разработке новых видов генной терапии следует рассматривать "генетические нарушения." Поэтому в последнее время генная терапия широко определяется как коррекция фенотипа болезни посредством введения новой генетической информации в «пораженный» организм.

При генной терапии in vivo вносимый ген вводится в клетки организма реципиента in situ, говоря другими словами, вводится реципиенту. Генная терапия in vivo была исследована на нескольких животных моделях. В некоторых последних публикациях сообщалось о возможности прямой передачи генов in situ в органы и ткани, такие как мышца, гематопоэтические стволовые клетки, артериальная стенка, нервная система и легкие. Также сообщалось о прямой инъекции ДНК в скелетную мышцу, сердечную мышцу и инъекции ДНК-липидных комплексов в сосудистую сеть с получением обнаружимого уровня экспрессии введенного генного продукта(ов) in vivo.

Лечение болезней центральной нервной системы, например, наследственных генетических заболеваний мозга, остается трудноразрешимой проблемой. Примерами подобных болезней являются лизосомные болезни накопления и болезнь Альцгеймера. В совокупности, распространенность лизосомных болезней накопления (LSD) составляет 1 на 10000 рождений по всему миру, и в 65% случаев наблюдается значительная вовлеченность в процесс центральной нервной системы (ЦНС). Дефицитные при таких заболеваниях протеины при внутривенной доставке не преодолевают гематоэнцефалический барьер или, при доставке непосредственно в мозг, не распространяются широко. Таким образом, имеется необходимость совершенствования терапии дефицитов ЦНС.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способ доставки терапевтического средства (например, протеина или нуклеиновой кислоты) в центральную нервную систему млекопитающего, включающий введение в мозжечково-мозговую цистерну млекопитающего rAAV частицы, содержащей AAV капсидный белок и вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтическое средство, вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, с целью эффективного инфицирования клеток млекопитающего, контактирующих со спинномозговой жидкостью (CSF), для того, чтобы клетки экспрессировали терапевтическое средство у млекопитающего.

Настоящее изобретение предоставляет способ лечения болезни у млекопитающего, включающий введение в мозжечково-мозговую цистерну млекопитающего rAAV частицы, содержащей AAV капсидный белок и вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтическое средство (например, терапевтическую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту, кодирующую протеин), вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, с целью эффективного инфицирования клеток млекопитающего, контактирующих со спинномозговой жидкостью (CSF), для того, чтобы клетки экспрессировали терапевтическое средство для лечения болезни.

В некоторых вариантах осуществления AAV частица является rAAV2 частицей. Использованный в описании термин AAV2/1 подразумевает AAV2 ITR и AAV1 капсид, термин AAV2/2 обозначает AAV2 ITR и AAV2 капсид, термин AAV2/4 обозначает AAV2 ITR и AAV4 капсид и т.д. В некоторых вариантах осуществления AAV частица обозначает rAAV8 частицу. В некоторых вариантах осуществления AAV частица представляет собой rAAV9 частицу. В некоторых вариантах осуществления AAV частица представляет собой rAAVrh10 частицу. В некоторых вариантах осуществления rAAV капсид обладает, по меньшей мере, 80% гомологией с AAV2 капсидным белком VP1, VP2 и/или VP3. В некоторых вариантах осуществления rAAV2 капсид обладает 100% гомологией с AAV2 капсидом VP1, VP2 и/или VP3. В некоторых вариантах осуществления rAAV капсид обладает, по меньшей мере, 80% гомологией с AAV4 капсидным белком VP1, VP2 и/или VP3. В некоторых вариантах осуществления rAAV4 капсид обладает 100% гомологией с AAV4 капсидом VP1, VP2 и/или VP3. В некоторых вариантах осуществления rAAV капсид обладает, по меньшей мере, 80% гомологией с AAV9 капсидным белком VP1, VP2 и/или VP3. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 капсид обладает 100% гомологией с AAV9 капсидом VP1, VP2 и/или VP3.

В некоторых вариантах осуществления rAAV частица является rAAV2 частицей, которая инфицирует эпендимные клетки, не являющиеся клетками грызунов, на уровне больше на 20%, чем уровень инфекционности AAV4, например, на уровне больше на 50%,или 100%, 1000% или 2000%, чем уровень инфекционности AAV4.

В некоторых вариантах осуществления клетка экспрессирует терапевтическое средство и секретирует терапевтическое средство в CSF. В некоторых вариантах осуществления клетка является эпендимной клеткой, пиальной (клеткой мягкой мозговой оболочки), эндотелиальной или менингеальной клеткой. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение rAAV в желудочек мозга приматов, не относящихся к человеческому роду, субарахноидальное пространство и/или интратекальное пространство.

Настоящее изобретение предоставляет способ доставки нуклеиновой кислоты в клетку мозга млекопитающего, включающий введение в клетку мозга AAV частицы, содержащей вектор, включающий нуклеиновую кислоту, вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, тем самым доставляя нуклеиновую кислоту в клетку мозга. В некоторых вариантах осуществления rAAV представляет собой rAAV2 частицу, которая инфицирует клетку мозга на уровне инфекционности на 20% больше, чем уровень инфекционности AAV4, например, на уровне инфекционности больше, чем на 50% или 100%, 1000% или 2000%, чем уровень инфекционности AAV4.

В некоторых вариантах осуществления болезнь является лизосомной болезнью накопления (LSD). В некоторых вариантах осуществления LSD представляет собой детский или поздний детский цероидный липофусциноз, нейропатию Гоше, юношескую болезнь Баттена, болезнь Фабри, метахроматическую лейкодистрофию MLD, болезнь Санфилиппо А, болезнь Хантера, болезнь Краббе, болезнь Моркио, болезнь Помпе, болезнь Ниманна-Пика тип С, болезнь Тэя-Сакса, болезнь Гурлера (MPS-I Н), болезнь Санфилиппо В, болезнь Марото-Лами, болезнь Ниманна-Пика тип А, цистиноз, болезнь Гурлера-Шейе (MPS-I H/S), мукополисахаридоз (MPS VII), синдром Шейе (MPS-I S), детскую болезнь Баттена, GM1 ганглиозидоз, муколипидоз типа II/III или болезнь Сандхоффа. В некоторых вариантах осуществления болезнь представляет собой поздний младенческий неврональный цероид-липофусциноз (LINCL). В некоторых вариантах осуществления болезнь является нейродегенеративной болезнью, такой как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофически склероз (ALS), врожденная спастическая гемиплегия, первичный латеральный склероз, спинальная мышечная атрофия, болезнь Кеннеди, полиглутаминное повторное заболевание или болезнь Паркинсона.

В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является млекопитающим, не относящимся к грызунам, таким как примат, лошадь, овца, коза, свинья или собака. В некоторых вариантах осуществления примат является человеком.

В некоторых вариантах осуществления терапевтичекое средство является терапевтической нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления терапевтичекое средство является белком.

В некоторых вариантах осуществления данная нуклеиновая кислота кодирует лизосомальную гидролазу. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ТРР1.

В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок является защитной изоформой белка АроЕ. Использованный в описании термин "защитная изоформа АроЕ" применяется для того, чтобы отличить АроЕ изоформы, снижающие риск развития болезни Альцгеймера, по меньшей мере, на 5%, например, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или больше.

В некоторых вариантах осуществления защитная изоформа АроЕ имеет, по меньшей мере, примерно 80% гомологию с АроЕ ε2. В некоторых вариантах осуществления защитная изоформа АроЕ имеет 100% гомологию с АроЕ ε2.

В некоторых вариантах осуществления rAAV частица вводится в 1-3 местоположения в мозге, например в одно, два или три места в мозге.

Краткое описание чертежей

Фигура 1А - выравнивание AAV2 (SEQ ID NO: 1) и AAV4 (SEQ ID NO: 2) белков, и Фигура 1В - выравнивание AAV2 (SEQ ID NO: 3) и AAV4 (SEQ ID NO: 4) нуклеотидов исходя из последовательности AAV2 (NC_001401) и AAV4 (NC_001829).

Фигура 2 предоставляет иллюстрацию "перекрестной коррекции (кросс-коррекции)" между клетками. Sands и Davidson, Mol Ther 13(5):839-849, 2006.

Фигура 3. Сверху: Иммуногистохимическое окрашивание человеческого ТРР1 после опосредованной AAV2 доставки собаке с моделью LINCL, при которой имеется дефицит собачьего ТРР1. Слева, леченая собака. Справа - нелеченое животное с дефицитом. Сравнение резко-положительного окрашивания слева с фоновым окрашиванием на правой панели. Внизу: Вестерн-блоттинг ТРР1, показывающий наличие человеческого ТРР1 у нелеченой собаки с LINCL с дефицитом. И у нормальной собаки и у собаки с дефицитом наблюдается отсутствие полосы, поскольку у них не экспрессируется человеческий ТРР1.

Фигура 4А. Микрофотографии, показывающие характерную автофлуоресценцию, отражающую патологическое накопление липофусцина при неврональном цероид-липофусцинозе. Левая панель, автофлуоресценция у собаки с LINCL, которую лечили AAV2.TPP1. Правая панель, автофлуоресценция у контрольных, нелеченых собак с LINCL. Следует отметить уменьшение автофлуоресценции при использовании терапии.

Фигура 4В. MRI-сканы нелеченых собак с LINCL (верхняя левая), нелеченой нормальной собаки (верхняя правая) и двух собак, леченых AAV.TPP1 (нижние панели). Объемы доставленного вектора показаны на нижней левой панели. Концентрация (титр) вируса составляла приблизительно 1e13 геномов/мл.

Фигура 4С. Объемное восстановление желудочков собак, изображенных на 4В (левые панели). График на правой панели показывает объемы изображений, представленных на левых панелях. Следует отметить экстенсивное уменьшение объема желудочка даже при этих низких дозах вектора (указаны в подписи к фигуре 4В).

Фигура 4D. Иммуногистохимическое окрашивание разных участков мозга показывает широкое распространение белка ТРР1 после AAV.TPP1 переноса гена в желудочковую систему собаки с LINCL. Верхние панели представляют собой фронтальные срезы мозга собаки; вставки внизу справа показывают, где проходит фронтальный срез на продольном срезе. Нижние панели - иммуногистохимически окрашенные срезы, взятые из этих участков. Взятые вместе, результаты показывают широкое распространение фермента.

Фигура 5. Активность фермента huTPP1 в CSF после AAV.TPP1 доставки уменьшается вскоре после переноса вирусного гена. Левая панель: ТРР1 активность в CSF у леченых животных Со и S превышает уровни нормальной активности довольно скоро после AAV.TPP1 переноса гена, и затем быстро снижается до необнаружимых уровней. Животные N, Ро и Pi являются нормальными или гетерозиготными собаками и показаны только для сравнения диапазона уровней ТРР1 активности у клинически нормальных собак.

Фигура 6 показывает результаты предварительной обработки микофенолатом для обеспечения длительной активности.

Фигура 7. Введение микофенолата во время уменьшения активности фермента или до переноса гена значительно повышает продолжительность экспрессии ТРР1 у собаки после AAV.TPP1 доставки в эпендиму. Левый и правый верхние графики: Ферментативная активность в зависимости от времени. Также показано время введения микофенолата. Следует отметить высокие и длительные уровни после восстановления от потери экспрессии у животных SR и В и очень высокие устойчивые уровни у животного F. Таким образом, предварительная обработка микофенолатом у животных, не имеющих рекомбинантного белка, помогает обеспечивать устойчивую экспрессию гена в трансфектированных клетках мозга. Нижний график: Увеличение верхнего правого графика с целью показать, что фермент присутствует на уровнях выше исходных уровней и близко к нормальным уровням или выше (0,1-0,4 пмоль/мг).

Фигура 8. Длительная экспрессия фермента в CSF повышает интерстициальные (внутритканевые) уровни фермента. Ферментативная активность в разных участках мозга превышает нормальную.

Фигура 9А и 9В. Иммуногистохимическое окрашивание в разных участках мозга показывает широкое распространение ТРР1 белка после переноса гена AAV.TPP1 в желудочковую систему собаки с LINCL. На рисунке из атласа мозга собаки линией обведены подвергнутые исследованию области, которые также показаны в увеличенном виде. Вместе взятые данные показывают широкое распространение фермента.

Фигура 10. Генная терапия AAV.TPP1 задерживает появление фенотипических проявлений болезни (появление первой красной линии слева в противовес первой синей линии слева) и прогрессирование болезни (расстояние между красными линиями в противовес расстоянию между синими линиями). Продолжительность жизни у некоторых собак увеличивалась почти вдвое, другие все еще остаются под наблюдением.

Фигура 11. На животных с длительной секрецией ТРР1 из эпендимной клетки было продемонстрировано подтверждение ферментативной активности в периферических органах и твердой мозговой оболочке. У двух животных, BG и SR, наблюдалась заметная ферментативная активность в твердой мозговой оболочке, а также в печени.

Фигура 12. Подход, примененный для получения клинического результата у собаки с LINCL, был использован в отношении приматов. Макаки-резус получали внутрижелудочковую инъекцию AAV2.TPP1 (1.5 мл 1е13 векторных геномов (vg)/мл), после чего была измерена ТРР1 активность в стволе мозга (медулла; левый график) и CSF (правый график), спустя 3 месяца после переноса гена. Это нормальные обезьяны с нормальными уровнями ТРР1 активности (отмеченный интервал - Контроль). У всех, кроме одного животного, ферментативная активность превышает активность у нормальных обезьян. Доказательство активности ТРР1 в мозге обезьяны через 3 месяца после переноса гена с использованием иммуногистохимического окрашивания против рекомбинантного человеческого ТРР1, экспрессированного из AAV вектора.

Фигура 13 показывает вестибулярное поле (ствол мозга) у приматов, не относящихся к человеческому роду.

Фигура 14 показывает аминокислотную последовательность человеческого ТРР1.

Фигура 15 показывает последовательность нуклеиновых кислот человеческого ТРР1.

Фигура 16 показывает аминокислотную последовательность ТРР1 Масаса mulatta.

Фигура 17 показывает аминокислотную последовательность ТРР1 Масаса fascicularis.

Осуществление изобретения

Аденоассоциированный вирус (AAV) - это небольшой непатогенный вирус семейства парвовирусов. AAV отличается от других членов этого семейства тем, что его репликация зависит от вируса-помощника. При отсутствии вируса-помощника AAV может интегрироваться локус-специфическим образом в q-плечо хромосомы 19. Геном AAV приблизительно 5 kb состоит из одного сегмента одноцепочечной ДНК с полярностью плюс или минус. Концами генома являются короткие инвертированные концевые повторы, которые могут сворачиваться в шпилечные структуры и служат в качестве начала репликации вирусной ДНК. По конструкции вирион парвовируса не имеет оболочки, и его икосаэдрический капсид составляет приблизительно 20 нм в диаметре.

В настоящее время идентифицированы многочисленные серологически отличные AAV и более дюжины выделены у людей или приматов. Геном AAV2 составляет 4680 нуклеотидов в длину и содержит две открытые рамки считывания (ORF). Левая ORF кодирует неструктурные Rep белки, Rep 40, Rep 52, Rep 68 и Rep 78, которые вовлечены в регуляцию репликации и транскрипции в дополнение к продуцированию одноцепочечных геномов потомства. Кроме того, два из Rep белков связаны с предпочтительной интеграцией AAV геномов в участок q-плеча хромосомы 19 человека. Также показано, что Rep68/78 обладает NTP-связывающей активностью, а также ДНК- и РНК-геликазной активностью. Белки Rep обладают клеточным сигналом внутриядерной Локализации, а также имеют некоторое количество сайтов возможного фосфорилирования. Мутация одного из этих киназных сайтов приводила к потере репликационной активности.

Концами генома являются короткие инвертированные концевые повторы (ITR), обладающие возможностью сворачиваться в Т-образные шпилечные структуры, которые служат в качестве начала ДНК-репликации. В пределах ITR участка описаны два элемента, являющиеся главными для функционирования ITR, повторный мотив GAGC и сайт концевого разрешения (trs). Показано, что повторный мотив связывается с Rep, когда ITR представляет собой линейную или шпилечную конформацию. Это связывание предназначено для положения Rep68/78 для расщепления при trs, которое происходит сайт- и цепь-специфическим образом. В дополнение к их роли в репликации, эти два элемента, по-видимому, являются главными в вирусной интеграции. Содержащийся в хромосоме 19 локус интеграции представляет собой Rep-связывающий сайт вместе с соседним trs. Показано, что эти элементы являются функциональными и необходимы для локус-специфической интеграции.

Вирион AAV является икосаэдрической, не имеющей оболочки частицей, приблизительно 25 нм в диаметре, состоящей из трех родственных белков, называемых VP1, VP2 и VP3. Правая ORF кодирует капсидные белки VP1, VP2 и VP3. Эти белки обнаруживаются в соотношении 1:1:10, соответственно, и все происходят от правой ORF. Капсидные белки отличаются друг от друга использованием альтернативного сплайсинга и необычным инициирующим кодоном. Делеционный анализ показывает, что удаление или изменение VP1, который транслируется из подвергнутого альтернативному сплайсингу транскрипта, приводит к уменьшенному выходу инфекционных частиц. Мутации в области, кодирующей VP3, приводят к неспособности продуцировать какое-либо одноцепочечное потомство ДНК или инфекционные частицы. AAV частица является вирусной частицей, содержащей AAV капсидный белок. AAV капсидный полипептид может кодировать полный VP1, VP2 и VP3 полипептид. Частица может быть частицей, содержащей AAV2 и другие AAV капсидные белки (т.е., химерный белок, такой как AAV4 и AAV2). Изменения в аминокислотной последовательности AAV2 капсидного белка предусматриваются настоящим документом, поскольку полученная в результате вирусная частица, содержащая AAV2 капсид, остается антигенно или иммунологически отличной от AAV4, что можно в рабочем порядке установить с помощью стандартных методов. В частности, например, для установления является ли вирусная частица антигенно или иммунологически отличной от AAV4 могут использоваться ELISA и вестерн-блоттинг. Кроме того, AAV2 вирусная частица предпочтительно сохраняет тропизм к ткани, отличный от AAV4.

Частица AAV2 является вирусной частицей, содержащей AAV2 капсидный белок. AAV2 капсидный полипептид, кодирующий полный VP1, VP2 и VP3 полипептид, может в целом иметь гомологию (или идентичность), по меньшей мере, около 63% с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, кодированную нуклеотидами, установленными в SEQ ID NO: 1 (AAV2 капсидный белок). Капсидный белок может обладать гомологией, по меньшей мере, около 70%, примерно 75% гомологией, 80% гомологией, 85% гомологией, 90% гомологией, 95% гомологией, 98% гомологией, 99% гомологией, или даже 100% гомологией с белком, установленным в SEQ ID NO: 1. Капсидный белок может обладать идентичностью около 70%, идентичностью около 75%, 80% идентичностью, 85% идентичностью, 90% идентичностью, 95% идентичностью, 98% идентичностью, 99% идентичностью или даже 100% идентичностью с белком, установленным в SEQ ID NO: 1. Частица может быть частицей, содержащей другой AAV и AAV2 капсидный белок, т.е. химерным белком. Изменения в аминокислотной последовательности AAV2 капсидного белка предусматриваются настоящим документом, поскольку полученная в результате вирусная частица, содержащая AAV2 капсид, остается антигенно или иммунологически отличной от AAV4, что можно в рабочем порядке установить с помощью стандартных методов. В частности, например, для установления является ли вирусная частица антигенно или иммунологически отличной от AAV4 могут использоваться ELISA и вестерн-блоттинг. Кроме того, AAV2 вирусная частица предпочтительно сохраняет тропизм к ткани, отличный от AAV4, например, как проиллюстрировано в примерах в данном документе, в то время как AAV2 химерная частица, содержащая, по меньшей мере, один AAV2 белок оболочки, может иметь тропизм к ткани, отличный от тропизма AAV2 частицы, состоящей только из AAV2 белков оболочки.

Как показано на Фигурах 1А и 1В, последовательность AAV2 капсида и последовательность AAV4 капсида являются примерно на 60% гомологичными. В некоторых вариантах осуществления AAV2 капсид содержит последовательность (или состоит из последовательности), которая является гомологичной, по меньшей мере, на 65% с аминокислотной последовательностью, установленной в SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления изобретение дополнительно предоставляет AAV2 частицу, содержащую, т.е., инкапсулирующую вектор, содержащий пару AAV2 инвертированных концевых повторов. Нуклеотидная последовательность AAV2 ITRs известна в данной области техники. Кроме того, частица может быть частицей, содержащей и AAV4 и AAV2 капсидный белок, т.е. химерным белком. Более того, частица может быть частицей, инкапсулирующей вектор, содержащий пару AAV инвертированных концевых повторов от других AAV (например, AAV1-AAV9 и AAVrh10). Вектор, инкапсулированный в частицу, может кроме того содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, вставленную между инвертированными концевыми повторами.

Следующие характерные черты AAV делают его приемлемым вектором для генного переноса. Показано, что AAV векторы in vitro устойчиво интегрируют в клеточный геном; обладают широким спектром хозяев; подвергают трансдукции и делящиеся и неделящиеся клетки in vitro и in vivo и поддерживают высокие уровни экспрессии трансдуцированных генов. Вирусные частицы являются термически стабильными, устойчивыми к растворителям, детергентам, изменениям рН, температуры, при этом, чтобы их сконцентрировать, используют градиент хлорида цезия CsCl или другие способы. Настоящее изобретение предоставляет способы введения AAV частиц, рекомбинантных AAV векторов и рекомбинантных AAV вирионов. Например, AAV2 частица является вирусной частицей, содержащей AAV2 капсидный белок, или AAV4 частица является вирусной частицей, содержащей AAV4 капсидный белок. Рекомбинантный AAV2 вектор представляет собой нуклеиновокислотный конструкт, содержащий, по меньшей мере, одну уникальную нуклеиновую кислоту AAV2. Рекомбинантный AAV2 вирион представляет собой частицу, содержащую рекомбинантный AAV2 вектор. Для того, чтобы рассматриваться в пределах термина "AAV2 ITRs", нуклеотидная последовательность должна сохранять один или оба признака, описанных в этом документе, которые отличают AAV2 ITR от AAV4 ITR: (1) три (а не четыре, как в AAV4) "GAGC" повтора и (2) в AAV2 ITR Rep сайте связывания четвертый нуклеотид в первых двух "GAGC" повторах представляет собой С, а не Т.

Промотор, предназначенный для управления экспрессией белка, или последовательности, кодирующей другой агент, который должен быть доставлен, может быть любым желаемым промотором, выбранным в соответствии с известными соображениями, такими как уровень экспрессии нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, и тип клетки, в которой вектор должен использоваться. Промоторы могут быть экзогенными или эндогенными промоторами. Промоторы могут включать, например, известные активные промоторы, такие как SV40 или индуцибельные промоторы металлотионеина, или AAV промотор, такой как AAV р5 промотор. Дополнительные примеры промоторов включают промоторы, происходящие из генов актина, генов иммуноглобулина, цитомегаловируса (CMV), аденовируса, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовирусных промоторов, таких как основной поздний аденовирусный промотор, индуцибельный промотор теплового шока, промотор респираторно-синцитиального вируса, вируса саркомы рауса (RSV) и т.д.

Вектор AAV может дополнительно содержать экзогенную (гетерологичную) нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором. "Гетерологичная нуклеиновая кислота" подразумевает, что любая гетерологичная или экзогенная нуклеиновая кислота может быть вставлена в вектор для переноса в клетку, ткань или организм. Нуклеиновая кислота может кодировать полипептид или белок или антисмысловую РНК, например. "Функционально связанный" означает, что промотор может способствовать экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, как известно в данной области" техники, например, означает соответствующую ориентацию промотора относительно гетерологичной нуклеиновой кислоты. Кроме того, гетерологичная нуклеиновая кислота предпочтительно имеет все соответствующие последовательности для экспрессии нуклеиновой кислоты, как известно в данной области техники, для того, чтобы функционально кодировать, т.е., обеспечивать экспрессию нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота может включать, например, последовательности, контролирующие экспрессию, такие как энхансер, и необходимые сайты обработки информации, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и транскрипционные терминаторные последовательности. Нуклеиновая кислота может кодировать более, чем один генный продукт, ограниченный только размером нуклеиновой кислоты, которая может быть упакована.

Гетерологичная нуклеиновая кислота может кодировать полезные белки, которые заменяют недостающие или дефектные белки, необходимые субъекту, которому перенесен вектор, или может кодировать цитотоксический полипептид, который может нацеливаться, например, на раковые клетки или другие клетки, гибель которых могла бы быть полезна субъекту. Гетерологичная нуклеиновая кислота также может кодировать антисмысловые РНК, которые могут связываться и тем самым инактивировать мРНК, продуцируемые субъектом, которые кодируют вредные белки. В одном варианте осуществления антисмысловые полинуклеотиды могут продуцироваться из гетерологичной экспрессионной кассеты в AAV вирусном конструкте, причем экспрессионная кассета содержит последовательность, которая способствует экспрессии, специфической для данного типа клеткок.

Примеры гетерологичных нуклеиновых кислот, которые могут быть введены в клетку или субъекту, в качестве части настоящего AAV вектора, могут включать, но не ограничиваются этим, нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические средства, такие как лизосомальные гидролазы; факторы некроза опухолей (TNF), такие как TNF-альфа; интерфероны, такие как интерферон-альфа, интерферон-бета и интерферон-гамма; интерлейкины, такие как IL-1, IL-1бета и интерфероны со 2-ого по 14-ый; GM-CSF; аденозиндезаминаза; секретируемые факторы, такие как факторы роста; ионные каналы; химиотерапевтические средства; лизосомальные белки; антиапоптотические продукты гена; белки, способствующие выживанию нейронов, такие как глутаматные рецепторы и факторы роста; факторы роста клеток, такие как лимфокины; растворимый CD4; фактор VIII; фактор IX; Т-клеточные рецепторы; LDL рецептор; АроЕ; АроС; альфа-1 антитрипсин; орнитинтранскарбамилаза (ОТС); муковисцидозный трансмембранный рецептор (CFTR); инсулин; Fc рецепторы для антигенсвязывающих доменов антител, таких как иммуноглобулины; и антисмысловые последовательности, ингибирующие репликацию вирусов, такие как антисмысловые последовательности, которые ингибируют репликацию вирусов гепатита В или вируса гепатита ни А ни В. Кроме того, нуклеиновая кислота может кодировать более, чем один генный продукт, ограниченный только размером нуклеиновой кислоты, которая может быть упакована.

Частица AAV2 - это вирусная частица, содержащая AAV2 капсидный белок. Изменения в аминокислотной последовательности AAV2 капсидного белка предусматриваются в описании, при условии, что полученная в результате вирусная частица, содержащая AAV2 капсид, остается антигенно или иммунологически отличной от AAV4, что можно определить обычным способом с помощью стандартных методов. В частности, например, ELISA и вестерн-блоттинг могут использоваться для определения, является ли вирусная частица антигенно или иммунологически отличной от других AAV серотипов.

Использованный в описании термин "полипептид" имеет отношение к полимеру, состоящему из аминокислот, и включает полноразмерные белки и их фрагменты. Таким образом, "белок" и "полипептид" часто используются в описании взаимозаменяемым образом. С помощью известных параметров могут быть выбраны нейтральные замены. Специалистам в данной области техники понятно, что изобретение также включает полипептиды, имеющие небольшие изменения в аминокислотных последовательностях или других свойствах. Такие изменения могут возникать в естественных условиях в виде аллельных вариантов (например, вследствие генетического полиморфизма) или могут являться результатом вмешательства человека (например, посредством мутагенеза клонированных последовательностей ДНК), таким как вызванные точковые мутации, делеции, вставки и замены. Особенно предпочтительными являются незначительные изменения в аминокислотной последовательности, такие как консервативные аминокислотные замены, небольшие внутриклональные делеции или вставки, и дополнения или делеции на концах молекул. Эти модификации могут приводить к изменениям в аминокислотной последовательности, обеспечить молчащие мутации, модифицировать сайт рестрикции или обеспечить другие специфические мутации.

Настоящий метод обеспечивает способ доставки нуклеиновой кислоты в клетку, включающий введение в клетку AAV частицы, содержащей вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, тем самым доставляющий нуклеиновую кислоту в клетку. Введение в клетку может осуществляться любыми способами, включая простое контактирование частицы, необязательно содержащейся в необходимой жидкости, такой как среда для культуры ткани, или забуференный физиологический раствор, с клетками. Частица может находиться в контакте с клетками в течение любого желаемого промежутка времени и, как правило, частицу вводят и оставляют на неопределенный срок. Для подобных in vitro методов, вирус может быть введен в клетку с помощью обычных методов трансдукции, известных в данной области техники и приведенных в описании в качестве примеров. Титры (концентрация) вируса, предназначенного для введения, могут варьировать, в частности, в зависимости от типа клеток, но будут типичными титрами, которые используются для AAV трансдукции в целом. В дополнение к этому могут использоваться титры, обычно используемые для трансдукции определенных клеток в настоящих примерах. Клетки могут включать любые желательные клетки людей, а также других крупных (не грызунов) млекопитающих, таких как приматы, лошади, овцы, козы, свиньи и собаки.

Конкретнее, настоящее изобретение предоставляет способ доставки нуклеиновой кислоты в клетку, контактирующую с циркулирующей CSF, такую как эпендимная клетка, пиальная клетка, менингиальная клетка, эндотелиальная клетка мозга, включающий введение в клетку AAV частицы, содержащей вектор, включающий нуклеиновую кислоту, вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, и таким образом обеспечивающий доставку нуклеиновой кислоты в клетку.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ доставки нуклеиновой кислоты в клетку субъекта, включающий введение субъекту AAV частицы, содержащей нуклеиновую кислоту, вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, таким образом, доставляя нуклеиновую кислоту в клетку субъекта.

Также предоставляется способ доставки нуклеиновой кислоты в эпендимную клетку, пиальную или другую менингеальную клетку у субъекта, включающий введение субъекту AAV частицы, содержащей нуклеиновую кислоту, вставленную между парой AAV инвертированных концевых повторов, таким образом доставляя нуклеиновую кислоту в эпендимную, пиальную или другую менингеальную клетку у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность, которая нацеливается на эндотелий сосудов мозга, нацеливается на эндотелий сосудов мозга у субъекта, имеющего заболевание, например, лизосомную болезнь накопления.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность, которая нацеливается на эндотелий сосудов мозга, нацеливается на эндотелий сосудов мозга у субъекта, не имеющего лизосомной болезни накопления.

В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является ТРР1.

Некоторые варианты осуществления настоящего раскрытия предоставляют клетку, содержащую вирусный вектор, описанный в данном документе.

Некоторые варианты осуществления настоящего раскрытия предоставляют способ лечения болезни у млекопитающего, включающий введение млекопитающему вирусного вектора или клетки, как описано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является человеком.

В некоторых вариантах осуществления болень является лизосомной болезнью накопления (LSD). В некоторых вариантах осуществления LSD представляет собой детский или поздний детский цероидный липофусциноз, нейропатию Гоше, юношескую болезнь Баттена, болезнь Фабри, метахроматическую лейкодистрофию (MLD), болезнь Санфилиппо А, позднюю детскую болезнь Баттена, болезнь Хантера, болезнь Краббе, болезнь Моркио, болезнь Помпе, болезнь Ниманна-Пика типа С, болезнь Тэя-Сакса, болезнь Гурлера (MPS-I Н), болезнь Санфилиппо В, болезнь Марото-Лами, болезнь Ниманна-Пика типа А, цистиноз, болезнь Гурлера-Шейе (MPS-I H/S), мукополисахаридоз (MPS VII), синдром Шейе (MPS-I S), детскую болезнь Баттена, GM1 ганглиозидоз, муколипидоз типа II/III или болезнь Сандхоффа.

В некоторых вариантах осуществления болезнь является нейродегенеративной болезнью. В некоторых вариантах осуществления нейродегенеративная болезнь представляет собой болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, ALS, врожденную спастическую гемиплегию, первичный латеральный склероз, спинальную мышечную атрофию, болезнь Кеннеди, полиглутаминовую повторную болезнь или болезнь Паркинсона.

Некоторые варианты осуществления наст