Композиция культуральной среды и способ культивирования клетки или ткани с использованием указанной композиции

Композиция культуральной среды и способ культивирования клетки или ткани с использованием указанной композиции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к композиции среды, содержащей структуру, способную суспендировать клетки или ткани, и к способу культивирования клеток или тканей с использованием этой композиции среды. Композицию среды и способ культивирования клеток с использованием этой среды по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать для культивирования клеток и/или тканей животных или растений, в частности, в суспендированном состоянии.

Уровень техники

В последние годы разработаны технологии пролиферации и поддержания различных органов, тканей и клеток in vitro, которые играют различные роли в организме животных и растений. Пролиферацию или поддержание органов и тканей in vitro называют культурой органов и культурой тканей, соответственно, и пролиферацию, дифференцировку или поддержание клеток, отделенных от органа или ткани in vitro, называют клеточной культурой. Клеточная культура представляет собой технологию пролиферации, дифференцировки или поддержания разделенных клеток in vitro в среде, и она является незаменимой для детального анализа функций и структуры различных органов, тканей и клеток in vivo. Кроме того, клетки и/или ткани, культивируемые по этой технологии, используют в различных областях для оценки эффективности и токсичности химических веществ, фармацевтических продуктов и т.п., крупномасштабной продукции полезных веществ, таких как ферменты, факторы роста клеток, антитела и т.п., в регенеративной медицине для замены органа, ткани и клетки, которые были утрачены вследствие заболевания и недостаточности, улучшения сорта растений, получения продуктов рекомбинактных генов и т.п.

Клетки животного происхождения ориентировочно подразделяют на не прикрепляющиеся клетки и прикрепляющиеся клетки, исходя из их свойств. Не прикрепляющиеся клетки представляют собой клетки, которые не требуют каркаса для роста и пролиферации, и прикрепляющиеся клетки представляют собой клетки, для роста и пролиферации которых требуется каркас. Большинство клеток, составляющих живой организм, являются последними из них прикрепляющимися клетками. В качестве способов культивирования прикрепляющихся клеток известны культура в монослое, дисперсионная культура, погруженная культура, культура в микроносителе, сферическая культура и т.п.

Культура в монослое представляет собой способ культивирования клеток в качестве единичного слоя с использованием, в качестве каркаса, контейнера для культивирования, изготовленного из стекла или синтетического полимерного материала, который подвергнут различным обработкам поверхности, или поддерживающих клеток, называемых фидерными клетками, и она наиболее распространена. Например, были разработаны способы культивирования с использованием контейнеров для культивирования с различной формой или свойствами, таких как полистироловый контейнер, подвергнутый различным поверхностным обработкам (обработка плазмой, коронная обработка и т.д.), который покрыт факторами адгезии клеток, такими как коллаген, фибронектин, полилизин и т.п. или на который заранее посеяны фидерные клетки и т.п. Однако культура в монослое является проблематичной в том, что клетки не могут сохранять конкретные функции, которые они имеют in vivo, в течение длительного времени, поскольку среда двумерной культуры полностью отличается от среды in vivo, клетки не могут восстанавливать ткань аналогично ткани in vivo, она не пригодна для массового культивирования клеток, поскольку количество клеток на постоянную площадь ограничено, и т.п. (патентный документ 1). Кроме того, способ культивирования рассматриваемой клетки на фидерных клетках иногда сталкивается с проблемой отделения рассматриваемых клеток от фидерных клеток (непатентный документ 1).

Дисперсионная культура представляет собой способ культивирования прикрепляющихся клеток в суспендированном состоянии, который включает посев клеток на среду и перемешивание культуральной среды в контейнере для культивирования, подвергнутом поверхностной обработке для ингибирования адгезии клеток, чтобы ингибировать прикрепление клеток к контейнеру для культивирования. Однако прикрепляющиеся клетки, культивируемые таким способом, не могут прикрепляться к каркасу, и, таким образом, способ нельзя применять к клетке, для которой обязательно требуется прикрепление к каркасу для пролиферации клеток. Кроме того, вследствие постоянного воздействия усилия сдвига, клетка не может проявлять присущую ей клеточную функцию, и, таким образом, функциональные клетки иногда нельзя культивировать в большом количестве (непатентный документ 2).

Погруженная культура представляет собой способ культивирования клеток путем погружения и фиксации клеток в твердом или полутвердом гелеобразном субстрате, таком как агар, метилцеллюлоза, коллаген, желатин, фибрин, агароза, альгинаты и т.п. Поскольку способ обеспечивает трехмерное культивирование клеток в состоянии, более близком к состоянию in vivo, и гелеобразный субстрат сам по себе иногда обеспечивает пролиферацию и дифференцировку клеток, клетки можно культивировать при высокой плотности с одновременным сохранением функции клеток, по сравнению с культурой единичных клеток и дисперсионной культурой (патентные документы 2, 3). Более того, также разработан способ культивирования клеток, включающий формирование микрокапсулы размером 100-300 мкм путем заключения клеток в гелеобразный субстрат и культивирование клеток в среде в виде водного раствора, в то время как микрокапсулы находятся в дисперсном состоянии (непатентный документ 3). Однако эти способы сталкиваются с проблемами, состоящими в том, что последующее наблюдение культивируемых клеток не является возможным, если видимый свет не проникает через гелеобразный субстрат, восстановление клеток из среды требует затрудненных действий, которые повреждают клетки, таких как обработка ферментом (например, обработка коллагеназой в случае коллагенового геля) и т.п., поскольку среда и микрокапсулы, содержащие гелеобразный субстрат, имеют высокую вязкость, замена среды, необходимая для длительного культивирования, является трудной и т.п. В последние годы были разработаны способы, обеспечивающие восстановление клеток из гелеобразного субстрата посредством обработки нагреванием, сдвиговых усилий и т.п. Однако нагревание, сдвиговые усилия и т.п. могут оказывать неблагоприятный эффект на функцию клеток, и безопасность гелеобразного субстрата для живого организма еще не была установлена (патентные документы 4, 5, непатентные документы 4, 5, 6, 7). Кроме того, в области подпитки разработана подпитка sol food для предотвращения преципитации и всплытия подпитки в форме частиц, такой как фрукты, овощи и т.п., нарезанные мелко, чтобы поддерживать однородность диспергированной и суспендированной подпитки. Однако подпитка sol food не обеспечивает извлечение диспергированной подпитки в форме частиц, и не исследовано, можно ли клетки и ткани подвергать суспензионной культуре (патентный документ 6).

Культура на микроносителе представляет собой способ культивирования клеток в суспендированном состоянии посредством пролиферации клеток в виде единичного слоя на поверхности тонких частиц, немного более тяжелых, чем вода (далее также обозначаемых как микроноситель) и перемешивания тонких частиц в контейнере для культивирования, таком как колба и т.п. Как правило, микроноситель, используемый в способе, представляет собой сферическую частицу, имеющую диаметр 100-300 мкм, площадь поверхности 3000-6000 см²/г, удельный вес 1,03-1,05, и состоит из материала, такого как декстран, желатин, альгиновая кислота, полистирол и т.п. Также на поверхности микроносителя могут быть нанесены коллаген, желатин или заряженная группа, такая как диметиламикоэтил и т.п., чтобы облегчить прикрепление клетки. Этот способ применяют для массивного культивирования клеток, поскольку он может значительно увеличивать площадь культуры (патентные документы 7, 8). Однако трудно прикреплять рассматриваемые клетки практически единообразно ко всем микроносителям, и возникают проблемы, такие как открепление клеток от микроносителя вследствие сдвиговых усилий во время перемешивания, повреждения клеток и т.п. (непатентный документ 8).

Сферическая культура представляет собой способ культивирования, включающий формирование агрегата, состоящего из от нескольких дюжин до нескольких сотен рассматриваемых клеток (далее также обозначаемого как сфера), и культивирование агрегатов путем выдерживания или встряхивания в среде. Известно, что сфера имеет высокую плотность клеток, реконструирует взаимодействия клетка-клетка и клеточную структуру аналогично среде in vivo, и ее можно культивировать при сохранении клеточной функции в течение боле длительного периода времени по сравнению с культурой в монослое и способом дисперсионной культуры (непатентные документы 9, 10). Однако сферическая культура не может образовывать крупную сферу, поскольку предоставление питания внутрь сферы и отведение отходов затрудняются, когда размер сферы является слишком большим. Кроме того, поскольку образовавшуюся сферу необходимо культивировать в дисперсном состоянии на дне контейнера для культивирования, количество сфер на данный объем не может увеличиваться с легкостью, и она не пригодна для массивной культуры. Более того, в качестве способа формирования сферы известны культура с висячей каплей, культура на не адгезивной для клеток поверхности, культура внутри микролунки, вращающаяся культура, культура с использованием клеточного каркаса, коагуляции с помощью центробежной силы, ультразвуковой обработки, электрического поля или магнитного поля и т.п. Однако эти способы являются проблематичными в том, что их осуществление является затрудненным, выделение сфер является трудным, затруднены контроль размера и крупномасштабная продукция, неизвестно влияние на клетку, необходимы специальный особенный контейнер и устройство и т.п. (патентный документ 9).

С другой стороны, что касается растений, клетку, протопласт без клеточной стенки или орган, ткань, каллюс растения, как например, лист, стебель, корень, конус нарастания, семя, эмбрион, пыльца и т.п., также можно выращивать путем культивирования в асептических условиях. С использованием способа культивирования для таких тканей и клеток растений стало возможным улучшение сортов растений и продуцирование полезных веществ. В качестве способа пролиферации клеток и тканей в большом количестве в течение короткого периода времени, известен способ суспензионного культивирования клеток растений в жидкой среде (непатентный документ 11). Для обеспечения высокой пролиферации, являются важными предоставление достаточного количества кислорода, поддержание состояния однородного перемешивания, предупреждение повреждения клеток и т.п. Предоставление кислорода культуральной среде и суспендирование клеток и тканей можно проводить с помощью комбинирования аэрации и механического перемешивания или с помощью только аэрации. Первое из них может приводить к дефектной пролиферации вследствие повреждения клеток и тканей посредством перемешивания, а последняя из них затруднена, поскольку, даже несмотря на то, что напряжение сдвига клеток и тканей является меньшим, и, поскольку состояние однородного перемешивания может быть трудно поддерживать в культуре высокой плотности, клетки и ткани образуют осадок, уменьшающий эффективность пролиферации и т.п.

Более того, для исследования и разработки лекарственного средства против злокачественной опухоли или выбора подходящего лекарственного средства против злокачественной опухоли при лечении злокачественной опухоли, активность лекарственного средства, направленную против злокачественной опухоли, оценивают культивированием злокачественных клеток in vitro в культуральной среде, содержащей являющееся кандидатом лекарственное средство или лекарственное средство против злокачественной опухоли. Однако существующие способы оценки активности, направленной против злокачественной опухоли, имеет проблемы, состоящие в различии между результатами оценки in vitro и истинными клиническими эффектами и т.п. Для решения проблем были разработаны способы оценки активности в условиях культивирования клеток, воспроизводящих условия in vivo настолько, насколько это возможно. Например, был разработан способ, включающий погружение злокачественных клеток в подложку, такую как мягкий агар, коллагеновый гель, гидрогель и т.п., чтобы обеспечить культивирование клеток в среде, ингибирующей адгезию к контейнеру для культивирования, и оценку лекарственного средства против злокачественной опухоли (патентный документ 10, непатентные документы 12, 13). Кроме того, был разработан способ, включающий ингибирование клеточной адгезии путем покрытия поверхности контейнера для культивирования материалом, ингибирующим клеточную адгезию, или с использованием специальной обработки поверхности, культивирование злокачественных клеток в коагулированном состоянии (сферическая культура) и оценку активности, направленной против злокачественной опухоли (патентные документы 11, 12).

Однако эти способы культивирования злокачественных клеток имеют различные проблемы, состоящие в том, что процесс изготовления контейнера для культивирования и осуществление культивирования клеток являются затрудненными, является затрудненным осуществление отделения клеток от подложки, такой как коллаген, и т.п. с последующей оценкой активности, направленной против злокачественной опухоли, предоставление подложки иногда ограничено, когда подложка представляет собой компонент животного происхождения, поскольку она является дорогостоящей, клеточные агрегаты (сферы) ассоциируют до избыточного размера, тем самым снижая уровень выживаемости клеток и воспроизводимость, и т.п. Более того, когда проводят скрининг лекарственного средства против злокачественной опухоли, является желательным способ культивирования злокачественных клеток, который является удобным, может осуществлять обработку большого количества единообразных образцов и имеет высокую воспроизводимость.

Кроме того, различные виды активности лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, и фармацевтического продукта, в отношении гепатоцитов оценивают путем культивирования гепатоцитов in vitro в культуральной среде, содержащей лекарственное средство, являющееся кандидатом для фармацевтического продукта, или фармацевтический продукт. Однако, поскольку функция, от природы выполняемая гепатоцитами in vivo, может утрачиваться вследствие культивирования гепатоцитов in vitro, существующие способы культивирования гепатоцитов имеют проблемы, состоящие в том, что точная оценка лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, и фармацевтического продукта не доступна, оценка множества образцов является затрудненной и т.п. Для преодоления таких проблем был разработан способ проведения оценки активности в условиях культивирования клеток, воспроизводящих условия in vivo настолько, насколько это возможно. Например, был разработан способ, включающий культивирование гепатоцитов на внеклеточном матриксе, таком как коллаген, ламинин, матригель (зарегистрированный торговый знак) и т.п., поддерживающем функцию гепатоцитов (патентный документ 13, непатентные документы 14, 15). Кроме того, был разработан способ, включающий формирование агрегата (сферы) из гепатоцитов путем обработки, например для ингибирования клеточной адгезии, посредством покрытия поверхности контейнера для культивирования материалом, ингибирующим адгезию клеток, или с использованием специальной обработки поверхности контейнера, встряхивания контейнера для культивирования и т.п., тем самым сохраняя функцию гепатоцитов (патентные документы 14, 15, непатентные документы 16, 17).

Однако эти способы культивирования гепатоцитов имеют различные проблемы, состоящие в том, что процесс изготовления контейнера для культивирования и осуществление культивирования клеток являются затрудненными, является затрудненным осуществление отделения клеток от подложки, такой как коллаген и т.п., и является затрудненной оценка функции гепатоцитов, предоставление подложки иногда ограничено, когда подложка представляет собой подложку животного происхождения, поскольку она является дорогостоящей, клеточные агрегаты (сферы) ассоциируют до избыточного размера, тем самым снижая уровень выживаемости клеток и воспроизводимость, и т.п. Более того, когда проводят скрининг лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, или фармацевтического продукта, является желательным способ культивирования гепатоцитов, который является удобным, может осуществлять обработку большого количества единообразных образцов и имеет высокую воспроизводимость.

Перечень патентных документов

[Патентный документ 1] JP-A-2001-128660.

[Патентный документ 2] JP-A-S62-171680.

[Патентный документ 3] JP-A-S63-209581.

[Патентный документ 4] JP-A-2009-29967.

[Патентный документ 5] JP-A-2005-60570.

[Патентный документ 6] JP-A-8-23893.

[Патентный документ 7] JP-A-2004-236553.

[Патентный документ 8] WO 2010/059775.

[Патентный документ 9] JP-A-2012-65555.

[Патентный документ 10] JP-A-2008-11797.

[Патентный документ 11] JP-A-2008-61609.

[Патентный документ 12] JP-A-2012-249547.

[Патентный документ 13] WO20005/028639.

[Патентный документ 14] WO2010/079602.

[Патентный документ 15] JP-A-2009-50194.

[Непатентные документы

[Непатентный документ 1] Klimanskaya et al., Lancet 2005, 365:1636-1641.

[Непатентный документ 2] King et al., Curr Opin Chem Biol. 2007, 11:394-398.

[Непатентный документ 3] Murua et al., J. of Controlled Release 2008, 132:76-83.

[Непатентный документ 4] Mendes, Chemical Society Reviews 2008, 37:2512-2529.

[Непатентный документ 5] Moon et al., Chemical Society Reviews 2012, 41:4860-4883.

[Непатентный документ 6] Рек et al., Nature Nanotechnol. 2008, 3:671-675.

[Непатентный документ 7] Liu et al., Soft Matter 2011, 7:5430-5436.

[Непатентный документ 8] Leung et al., Tissue Engineering 2011, 17:165-172.

[Непатентный документ 9] Stahl et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 2004, 322:684-692.

[Непатентный документ 10] Lin et al., Biotechnol J. 2008, 3:1172-1184.

[Непатентный документ 11] Weathers et al., Appl Microbiol Biotechnol 2010, 85:1339-1351.

[Непатентный документ 12] Takamura et al., Int. J. Cancer 2002, 98: 450-455.

[Непатентный документ 13] Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76: 3401-3405.

[Непатентный документ 14] Bissell et al., J. Clin. Invest. 1987, 79: 801-812.

[Непатентный документ 15] LeCluyse et al., Critical Reviews in Toxicology 2012, 42:501-548.

[Непатентный документ 16] Brophy et al., Hepatology 2009, 49:578-586.

[Непатентный документ 17] Franziska et al., World J Hepatol 2010, 2:1-7.

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые с помощью изобретения

Задачей настоящего изобретения является решение упомянутых выше проблем уровня техники и предоставление композиции среды для культивирования клеток и/или тканей животного или растения, в частности, в трехмерном или в суспендированном состоянии, и способ культивирования клеток и/или тканей животных или растений с использованием композиции среды.

Также задачей настоящего изобретения является решение упомянутых выше проблем уровня техники и предоставление композиции среды для культивирования агрегата (сферы) злокачественных клеток в трехмерной окружающей среде и способа исследования злокачественных клеток с использованием композиции среды.

Альтернативно задачей настоящего изобретения является решение упомянутых выше проблем уровня техники и предоставление композиции среды для культивирования агрегата (сферы) гепатоцитов в трехмерной окружающей среде и способа исследования злокачественных клеток с использованием композиции среды.

Более того, задачей настоящего изобретения является предоставление добавки в среду, которая стимулирует пролиферацию злокачественных клеток при культивировании злокачественных клеток и добавки в среду, которая ингибирует уменьшение количества гепатоцитов при культивировании гепатоцитов.

Способы решения проблем

Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования различных соединений и эффекта суспендирования клеток и/или тканей в жидкой среде, содержащей их, и успешно нашли структуру, способную однородно диспергировать клетки и/или ткани в суспендированном состоянии, по существу не повышая вязкости жидкой среды. Они открыли, что клетки и/или ткани можно подвергать пролиферации, дифференцировке или поддержанию, одновременно сохраняя суспензионное состояние, с использованием композиции среды, содержащей по меньшей мере указанную структуру. Более того, они также открыли, что культивируемые клетки и/или ткани можно без труда выделять из среды, что обеспечивает осуществление настоящего изобретения.

Авторы настоящего изобретения также провели тщательные исследования эффекта различных соединений и жидких сред, содержащих их, на агрегат злокачественных клеток (сферу), и успешно выявили композицию среды, которая препятствует ассоциации сфер и обеспечивает однородное диспергирование. Они обнаружили, что с использованием композиции среды сферу можно культивировать с высоким уровнем выживаемости, и активность лекарственного средства, направленную против злокачественной клетки, можно оценивать эффективно и с высокой чувствительностью. Более того, они также выявили, что культивируемую сферу можно без труда выделять из среды и оценивать, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.

Также авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования эффекта различных соединений и жидкой среды, содержащей их, на агрегат гепатоцитов (сферу), и успешно выявили композицию среды, которая препятствует ассоциации сфер и обеспечивает однородное диспергирование. Они обнаружили, что сферу можно культивировать с высоким уровнем выживаемости при - сохранении функции гепатоцитов, и с использованием композиции среды можно эффективно и с высокой чувствительностью оценивать эффект лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, или фармацевтического продукта на гепатоциты. Более того, они также обнаружили, что культивируемые сферы можно без труда выделять из среды и оценивать, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.

Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что пролиферация злокачественных клеток может быть значительно ускорена добавлением деацилированной геллановой камеди или ее соли в среду, содержащую злокачественные клетки, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что уменьшение количества гепатоцитов может ингибироваться путем добавления деацилированной геллановой камеди или ее соли в среду, содержащую гепатоциты, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему:

(1) Композиция среды, содержащая структуру, способную культивировать клетки или ткани путем суспендирования их.

(2) Композиция среды согласно (1), позволяющая обработку для замены композиции среды во время культивирования и выделение клеток или тканей после завершения культивирования.

(3) Композиция среды согласно (1), которая не требует никакого изменения температуры, химической обработки, ферментативной обработки и сдвигового усилия во время выделения клеток или тканей из среды.

(4) Композиция среды согласно (1), имеющая вязкость не более 8 мПа⋅с.

(5) Композиция среды согласно (1), где упомянутая выше структура имеет такой размер, что она проходит через фильтр, имеющий размер пор от 0,2 мкм до 200 мкм, когда ее пропускают через фильтр.

(6) Композиция среды согласно (1), где упомянутая выше структура содержит полимерное соединение.

(7) Композиция среды согласно (6), где упомянутое выше полимерное соединение включает полимерное соединение, имеющее анионную функциональную группу.

(8) Композиция среды согласно (6), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой полисахарид.

(9) Композиция среды согласно (7), где упомянутая выше анионная функциональная группа относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из карбоксигруппы, сульфогруппы и фосфатной группы.

(10) Композиция среды согласно (8), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, геллановой камеди, деацилированной геллановой камеди, рамсановой камеди, диутановой камеди, ксантановой смолы, каррагенана, фукоидана, пектина, пектовой кислоты, пектиновой кислоты, гепарансульфата, гепарина, гепаритинсульфата, кератосульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, рамнансульфата и их соли.

(11) Композиция среды согласно (10), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, деацилированной геллановой камеди, диутановой камеди, ксантановой смолы, каррагенана и их соли.

(12) Композиция среды согласно (10) или (11), где упомянутый выше полисахарид представляет собой деацилированную геллановую камедь или ее соль.

(13) Композиция среды согласно (12), где конечная концентрация упомянутой выше деацилированной геллановой камеди или ее соли в композиции среды составляет 0,001-1,0% (масса/объем).

(14) Композиция среды согласно (13), дополнительно содержащая полисахарид, отличный от деацилированной геллановой камеди или ее соли.

(15) Композиция среды согласно (14), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из ксантановой смолы, альгинозой кислоты, харрагенана, диутановой камеди и их соли.

(16) Композиция среды согласно (14), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из метилцеллюлозы, смолы плодоворожкового дерева и их соли.

(17) Композиция среды согласно любому из (1)-(16), дополнительно содержащая ион металла.

(18) Композиция среды согласно (17), где упомянутый выше ион представляет собой ион двухвалентного металла.

(19) Композиция среды согласно (18), где упомянутый выше ион металла относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из иона кальция, иона магния, иона цинка, иона железа и иона меди.

(20) Композиция среды согласно (19), где упомянутый выше ион металла представляет собой ион кальция.

(21) Композиция среды согласно (20), дополнительно содержащая ион металла, отличный от иона кальция.

(22) Композиция среды согласно (21), где упомянутый выше ион металла относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из иона магния, иона натрия и иона кальция.

(23) Композиция среды согласно любому из (1)-(22), дополнительно содержащая молекулу внеклеточного матрикса и/или молекулу клеточной адгезии.

(24) Композиция среды согласно (23), где упомянутый выше внеклеточный матрикс относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из коллагена, гиалуроновой кислоты и протеогликана.

(25) Композиция среды согласно (23), где упомянутая выше молекула клеточной адгезии относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из кадгерина, ламинина, фибронектина и витронектина.

(26) Композиция среды согласно любому из (1)-(25), которая предназначена для культивирования клеток.

(27) Композиция среды согласно (26), где упомянутая выше клетка представляет собой прикрепляющуюся клетку или не прикрепляющуюся клетку.

(28) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка прикреплена к микроносителю.

(29) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка погружена в носитель.

(30) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка представляет собой сферу.

(31) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка выбрана из группы, состоящей из плюрипотентной стволовой клетки, злокачественной клетки и гепатоцита.

(32) Культура клеток или ткани, содержащая композицию среды согласно любому из (1)-(31) и клетки или ткани.

(33) Способ культивирования клетки или ткани, включающий культивирование клетки или ткани в композиции среды согласно любому из (1)-(31).

(34) Способ культивирования согласно (33), где упомянутая выше клетка выбрана из группы, состоящей из плюрипотентной стволовой клетки, злокачественной клетки и гепатоцита.

(35) Способ выделения клетки или ткани, включающий извлечение клетки или ткани из культуры согласно (32).

(36) Способ выделения согласно (35), где упомянутое выше извлечение проводят путем фильтрации, центрифугирования или магнитного разделения.

(37) Способ получения сферы, включающий культивирование прикрепляющейся клетки в композиции среды согласно любому из (1)-(31).

(38) Способ скрининга лекарственного средства против злокачественной опухоли, включающий

(a) стадию культивирования злокачественной клетки в присутствии исследуемого вещества и в его отсутствие в композиции среды согласно любому из п. 1-31, и

(b) стадию анализа изменений пролиферации злокачественной клетки.

(39) Способ согласно (38), дополнительно включающий стадию отбора в качестве вещества-кандидата вещества, которое подавляет пролиферацию злокачественной клетки относительно пролиферации в отсутствие исследуемого вещества.

(40) Способ скрининга вещества, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, который действует на гепатоциты, включающий

(a) стадию культивирования гепатоцитов в присутствии исследуемого вещества и в его отсутствие в композиции среды согласно любому из п. 1-31, и

(b) стадию анализа изменений физиологической функции гепатоцитов.

(41) Способ согласно (40), дополнительно включающий стадию отбора в качестве вещества-кандидата вещества, которое подавляет или усиливает физиологическую функцию гепатоцитов относительно физиологической функции в отсутствие исследуемого вещества.

(42) Способ оценки эффективности или токсичности вещества, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, который действует на гепатоциты, включающий

(a) стадию культивирования гепатоцитов в присутствии исследуемого вещества и в отсутствие его в композиции среды согласно любому из пп. 1-31, и

(b) стадию анализа изменений физиологической функции гепатоцитов.

(43) Добавка в среду для получения композиции среды, в которой можно культивировать клетки или ткани путем их суспендирования, содержащая полимерное соединение, растворенное или диспергированное в растворителе.

(44) Добавка в среду согласно (43), которая находится в стерилизованном состоянии.

(45) Добавка в среду согласно (43) или (44), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой полимерное соединение, имеющее анионную функциональную группу.

(46) Добавка в среду согласно (43) или (44), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой деацилированую геллановую камедь или ее соль.

(47) Способ получения композиции среды, в которой могут культивироваться клетки или ткани путем суспендирования их, включающий смешение полимерного соединения и среды.

(48) Способ согласно (47), включающий смешение добавки в среду согласно любому из (43)-(46) и среды.

(49) Способ согласно (48), где упомянутую выше среду растворяют или диспергируют в растворителе.

(50) Способ согласно (47), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой полимерное соединение, имеющее анионную функциональную группу.

(51) Способ согласно (50), где упомянутое полимерное соединение представляет собой деацилированную геллановую камедь или ее соль.

(52) Способ согласно (47), где упомянутое выше полимерное соединение и среда смешаны с водой.

(53) Способ согласно (52), включающий нагревание при 80-130°С после смешения с водой.

(54) Способ согласно (53), включающий нагревание при 100-125°С.

(55) Способ согласно (47), включающий стерилизацию фильтрованием.

(56)Способ согласно (55), где упомянутая выше стерилизация фильтрованием включает пропускание через 0,1-0,5 - мкм фильтр.

(57) Добавка в среду для злокачественных клеток, содержащая деацилированную геллановую камедь или ее соль, или диутановую камедь или ее соль.

(58) Добавка согласно (57), которая ускоряет пролиферацию злокачественной клетки при культивировании злокачественной клетки.

(59) Добавка согласно (57), которую используют для оценки активности, направленной против злокачественной опухоли, у лекарственного средства против злокачественной опухоли.

(60) Композиция среды для злокачественных клеток, содержащая добавку согласно любому из (57)-(59).

(61) Способ культивирования злокачественной клетки, включающий культивирование злокачественной клетки в присутствии добавки согласно любому из (57)-(59), или в композиции среды согласно (60).

(62) Способ оценки активности лекарственного средства против злокачественной опухоли в отношении злокачественной клетки, включающий культивирование злокачественной клетки в присутствии добавки согласно любому из (57)-(59), или в композиции среды согласно (60).

(63) Способ согласно (61) или (62), где злокачественные клетки образуют клеточный агрегат в композиции среды для злокачественной клетки.

(64) Способ согласно (61) или (62), где контейнер для культивирования злокачественной клетки подавляет прикрепление злокачественной клетки.

(65) Добавка в среду для гепатоцитов, содержащая деацилированную геллановую камедь или ее соль, или диутановую камедь или ее соль.

(66) Добавка согласно (65), которая ингибирует снижение количества гепатоцитов при культивировании гепатоцитов.

(67) Добавка согласно (65), которую используют для оценки эффекта фармацевтического продукта и лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, на гепатоциты.

(68) Композиция среды для гепатоцитов, содержащая добавку согласно любому из (65)-(67).

(69) Способ оценки активности фармацевтического продукта и лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, в отношении гепатоцитов, включающий культивирование гепатоцитов в присутствии добавки согласно любому из (65)-(67), или в композиции среды согласно (68).

(70) Способ согласно (69), где гепатоциты образуют клеточный агрегат в композиции среды для гепатоцитов.

(71) Способ согласно (69), где контейнер для культивирования гепатоцитов ингибирует прикрепление гепатоцитов.

Эффекты изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции среды, содержащей структуру конкретного соединения (далее также называемую конкретным соединением), в частности полимерного соединения, имеющего анионную функциональную группу. С использованием композиции среды клетки и/или ткани можно культивировать в суспендированном состоянии без таких действий, как встряхивание, вращение и т.п., которые обладают риском возникновения повреждения и утраты функции клеток и тканей. Более того, при использовании композиции среды среду можно без труда заменять во время культивирования и культивируемые клетки и/или ткани также можно без труда выделять. Настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток и/или тканей, полученных из организма животного или организма растения, и оно может обеспечивать получение рассматриваемых клеток и/или тканей в большом количестве без нарушения их функций. Клетки и/или ткани, полученные способом культивирования, можно использовать для проведения оценки эффективности и токсичности химических веществ, фармацевтических продуктов и т.п., крупномасштабной продукции полезных веществ, таких как ферменты, факторы роста клеток, антитела и т.п., в регенеративной медицине для замены органа, ткани и клетки, которые были утрачены вследствие заболевания и недостаточности, и т.п. В частности, композиция среды, полученной с использованием деацилированной геллановой камеди, является улучшенной и имеет следующие характеристики. Поскольку концентрация для того, чтобы проявлялись свойства, является крайне низкой (на один порядок или около того ниже), влияние на компоненты среды может снижаться до минимума. Поскольку образование комка при растворении в воде затруднено, крупномасштабная продукция практически не является проблематичной. Более того, поскольку вязкость в диапазоне концентраций, в которой проявляется свойство, является низкой, функциональность, такая как выделение клеток и/или тканей и т.