Микроорганизмы, продуцирующие путресцин, и способ получения путресцина с использованием этих микроорганизмов

Микроорганизмы, продуцирующие путресцин, и способ получения путресцина с использованием этих микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному микроорганизму, имеющему повышенную путресциновую продуктивность, и к способу получения путресцина с высоким выходом с использованием этого микроорганизма.

2. Описание предшествующего уровня техники

Полиамины, такие как спермидин, спермин или тому подобное, присутствуют в большинстве живых клеток, и путресцин (или 1,4-бутандиамин) используется в качестве предшественника в метаболизме спермидина и спермина. Путресцин обнаружен у грамотрицательных бактерий и грибов и присутствует в высоких концентрациях у различных видов, указывая на то, что он играет важную роль в метаболических путях микроорганизмов.

В целом, путресцин является важным сырьем в синтезе полиамина нейлона-4, 6, получаемого взаимодействием с адипиновой кислотой. Путресцин получают главным образом химическим синтезом через акрилонитрил и сукцинонитрил из пропилена. Этот химический синтез представляет собой трехстадийный процесс, включающий реакцию каталитического окисления, реакцию с использованием цианидного соединения и реакцию гидрогенизации с использованием водорода под высоким давлением. Существуют проблемы, заключающиеся в том, что этот химический синтез вреден для окружающей среды и, кроме того, потребляет большое количество энергии, приводя к истощению запасов нефти. Таким образом, существует потребность в разработке более безопасного для окружающей среды и энергоэффективного способа получения путресцина, включающего использование биомассы.

У микроорганизмов путь биосинтеза путресцина идентичен пути синтеза аргинина от глутамата до синтеза орнитина. Возможны два пути биосинтеза путресцина у микроорганизмов. В одном пути происходит декарбоксилирование орнитина как промежуточного продукта с образованием путресцина. В другом пути происходит образование агматина посредством декарбоксилирования аргинина, синтезированного из орнитина, с последующим синтезом путресцина из агматина (Morris et al., J Biol. Chem. 241: 13, 3129-3135, 1996). Эти два пути приводят к выработке энергии, необходимой для метаболизма или позволяющей клетке быть устойчивой к окислительному стрессу.

В качестве способа получения путресцина с использованием микроорганизма был заявлен способ получения путресцина в высокой концентрации трансформацией Е. coli и Corynebacterium (международная патентная публикация № WO 06/005603; международная патентная публикация № WO 09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 17-30, 2011). Например, в WO 09/125924 раскрыт способ получения путресцина с высоким выходом путем улучшения биосинтетического пути орнитина, вместо инактивации путей, вовлеченных в деградацию и утилизацию путресцина, присутствующих у Е. coli, и инактивации превращения орнитина, как предшественника путресцина, в аргинин. Кроме того, в Schneider (2010) раскрыт способ получения путресцина в высокой концентрации путем введения и улучшения белка, способного превращать орнитин в путресцин, в штамм Corynebacterium sp., не продуцирующий путресцин.

Кроме того, в последнее время активно проводятся исследования транспортеров путресцина в клетках Е. coli, дрожжей, растений и животных (К Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506-512, 2010). Транспорт путресцина в Ε. coli происходит 4 путями; potABCD или potFGHI, зависимыми от гидролиза АТФ, и potE как Н⁺-котранспортером, и puuP из пути puu. Относительно значений Km этих комплексов, вовлеченных в транспорт путресцина, для PotFGHI, potABCD, potE и puuP они составляют 0,5 мМ, 1,5 мМ, 1,8 мМ и 3,7 мМ, соответственно. Из этих четырех путей транспорта путресцина комплекс potFGHI считают наиболее подходящим. Кроме того, транспортер potE имеет функции транспорта путресцина как внутрь клетки, так и из нее. При нейтральном рН путресцин проникает в клетки вместе с протонами. Тем не менее, поскольку экспрессия путресцинсинтазы (speF) происходит в условиях кислого рН, проникновение в клетки внеклеточного орнитина и внеклеточное выведение путресцина, синтезированного в клетках, происходят одновременно (Kurihara et. al., J. Bacteriology 191: 8, 2776-2782, 2009).

Известными экспортерами путресцина у дрожжей являются TPO1 и TPO4. Эти аминокислотные последовательности очень похожи на аминокислотные последовательности бациллярного мультилекарственного транспортера (bacillus multidrug transporter) Bit.

Характеристики этих двух экспортеров сходны с potE у Е. coli, и они имеют функции импорта путресцина, спермидина и спермина в щелочных условиях и их экспорта в кислых условиях. Кроме того, дрожжи со сверхэкспрессией гена TPO5 резистентны к 120 мМ путресцина, в то время как мутанты с инактивированным геном TPO5 чувствительны к 90 мМ путресцина (Tachihara et. al., J. Biological Chemistry, 280(13): 12637-12642, 2005).

Регуляция синтеза и разрушения, а также проникновения и выведения путресцина в клетках животных происходит различными путями. Несмотря на отсутствие исследований выведения полиаминов в клетках животных, а также у Е. coli или дрожжей, есть сообщение о том, что SLC3A2 (аргинин/диаминовый экспортер) функционирует, обеспечивая импорт аргинина в клетки и экспорт путресцина, ацетилспермидина и ацетилспермина в клетках эпителия толстой кишки. Тем не менее, сообщений о проникновении путресцина в клетки растений и его экспорте из них не было (Igarashi et al., Plant Physiol. & Biochem. 48: 506-512, 2010).

С другой стороны, поскольку микроорганизм Corynebacterium sp. не имеет пути биосинтеза путресцина, исследований относительно экспорта путресцина проведено не было. Согласно недавнему сообщению, сверхэкспрессия мембранного белка cg2983 у штамма, продуцирующего кадаверин, приводит к восстановлению клеточного роста и повышению кадавериновой продуктивности (Kind et. al., Metabolic Engineering 13: 617-627, 2011).

Тем не менее, сообщений о связи экспортера путресцина с продуцированием путресцина или ростом микроорганизмов, продуцирующих путресцин, не было. В указанной выше литературе нет упоминаний о связи мембранного белка cg2983 со способностью к экспорту путресцина.

С учетом этих данных, авторы настоящего изобретения приложили многочисленные усилия для разработки штамма, способного продуцировать путресцин с более высоким выходом. В результате, было установлено, что NCgl2522 функционирует как экспортер путресцина у штамма, продуцирующего путресцин, микроорганизма Corynebacterium sp., и что путресцин можно получать с высоким выходом путем усиления активности NCgl2522, по сравнению с его эндогенной активностью. Кроме того, количество путресцина в культуральной среде может быть увеличено экспрессией NCgl2522 у Е. coli, имеющей путь синтеза путресцина, и, таким образом, авторы настоящего изобретения предположили, что NCgl2522 также функционирует как экспортер путресцина у Е. coli, завершив посредством этого настоящее изобретение.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является обеспечение рекомбинантного микроорганизма, модифицированного для усиления активности NCgl2522, продуцирующего посредством этого путресцин с высоким выходом.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения путресцина с высоким выходом с использованием этого микроорганизма.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 представлена диаграмма, на которой показано, что NCgl2522 включен в клон (В19), окончательно селектированный из трансформированных колоний, в которые была введена хромосомная библиотека Corynebacterium по настоящему изобретению.

На ФИГ. 2 представлен результат оценки резистентности к путресцину у рекомбинантного штамма с делецией или усилением NCgl2522 по настоящему изобретению.

1: КССМ11240Р

2: КССМ11240Р ΔNCgl2522

3: КССМ11240Р P(CJ7)-NCgl2522

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

В одном аспекте для выполнения указанной задачи согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, где указанный микроорганизм модифицирован для усиления активности белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21 или 23.

В одном конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, где указанный микроорганизм дополнительно модифицирован для ослабления активности орнитинкарбамоилтрансферазы (ArgF) и белка (NCgl1221), вовлеченного в экспорт глутамата, по сравнению с их эндогенной активностью, и в который введена активность орнитиндекарбоксилазы (ODC).

В другом конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, где орнитинкарбамоилтрансфераза (ArgF) имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29, белок (NCgl1221) вовлеченный в экспорт глутамата, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30, и орнитиндекарбоксилаза (ODC) имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33.

В еще одном конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, где указанный микроорганизм дополнительно модифицирован для усиления активности ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктазы (ArgC), ацетилглутаматсинтазы или орнитинацетилтрансферазы (ArgJ), ацетилглутаматкиназы (ArgB) и ацетилорнитинаминотрансферазы (ArgD), по сравнению с их эндогенной активностью.

В еще одном конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, где ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктаза (ArgC), ацетилглутаматсинтаза или орнитинацетилтрансфераза (ArgJ), ацетилглутаматкиназа (ArgB) и ацетилорнитинаминотрансфераза (ArgD) имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 25, 26, 27 и 28, соответственно.

В еще одном конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, активность ацетилтрансферазы (NCgl1469) которого дополнительно ослаблена.

В еще одном конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, где ацетилтрансфераза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31 или 32.

В еще одном конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, представляющий собой Escherichia sp. или Corynebacterium sp.

В еще одном конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий путресцин, представляющий собой Е. coli или Corynebacterium glutamicum.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения путресцина, включающий стадии культивирования микроорганизма, продуцирующего путресцин, с получением клеточной культуры и выделения путресцина из культивированного микроорганизма или клеточной культуры.

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный микроорганизм Corynebacterium sp., где микроорганизм Corynebacterium sp., продуцирующий путресцин, модифицирован для усиления активности NCgl2522, по сравнению с его эндогенной активностью, и, таким образом, он имеет повышенную путресциновую продуктивность.

При использовании здесь термин «NCgl2522» относится к пермеазе, принадлежащей к MFS (суперсемейство мембранных транспортеров), представляющей собой мембранный белок, выделенный из Corynebacterium glutamicum АТСС13032. Известно, что NCgl2522 экспортирует диаминопентан из Corynebacterium glutamicum. В настоящем изобретении было подтверждено, что NCgl2522 функционирует как транспортер, обеспечивающий внеклеточный экспорт путресцина, продуцируемого внутри клеток. На основании этого факта, согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный микроорганизм, демонстрирующий продукцию путресцина с высоким выходом, где NCgl2522 модифицирован для усиления активности, по сравнению с его эндогенной активностью, и, таким образом, экспорт продуцируемого внутриклеточно путресцина повышен.

При использовании здесь термин «эндогенная активность» относится к активности фермента, которой микроорганизм обладает в его нативном состоянии, то есть в состоянии без модификации, и значение «модифицирован для усиления активности, по сравнению с эндогенной активностью», состоит в том, что активность фермента введена впервые или дополнительно улучшена, по сравнению с активностью соответствующего фермента до модификации.

В настоящем изобретении «усиление ферментативной активности» включает улучшение ферментативной активности путем улучшения активности эндогенного гена, амплификации эндогенного гена внутренними или внешними факторами, удаления регуляторного фактора, подавляющего экспрессию гена, увеличения числа копий гена, повышения активности путем введения чужеродного гена или модификацией регуляторной последовательности экспрессии, в частности, заменой или модификацией промотора и мутацией внутри гена, а также введение или улучшение активности самого фермента с достижением эффектов, выходящих за пределы эндогенных функций.

В настоящем изобретении «модифицирован для усиления активности, по сравнению с эндогенной активностью» означает, что активность микроорганизма повышена после манипуляции, такой как введение гена, проявляющего активность, или увеличение числа копий гена, удаление регуляторного фактора, подавляющего экспрессию гена, или модификация регуляторной последовательности экспрессии, например, использование улучшенного промотора, по сравнению с активностью микроорганизма до манипуляции.

NCgl2522, активность которого повышена по настоящему изобретению, может представлять собой, без ограничения, белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 или 23, или аминокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную ей, предпочтительно на 80% или более гомологичную ей, более предпочтительно на 90% или более гомологичную ей, намного более предпочтительно на 95% или более гомологичную ей, намного более предпочтительно на 98% или более гомологичную ей и наиболее предпочтительно на 99% или более гомологичную ей. Кроме того, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего активность, может различаться в зависимости от вида или штамма микроорганизма, белок не ограничен ими. То есть, белок может представляет собой мутантный белок или искусственный вариант, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или более чем одном положении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 или 23, при условии, что белок способствует повышению путресциновой продуктивности благодаря усилению его активности. При использовании здесь термин «несколько» аминокислот означает конкретно от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и более предпочтительно от 2 до 5 аминокислот, хотя он может различаться в зависимости от положения или типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Кроме того, замена, делеция, вставка, добавление или инверсия аминокислот могут включать мутации, встречающиеся в природе, обусловленные индивидуальными или видовыми различиями микроорганизмов, имеющих активность полипептида, или искусственные изменения.

У микроорганизма Corynebacterium sp. нет путей биосинтеза путресцина. Тем не менее, при введении внешней орнитиндекарбоксилазы (ODC) происходит синтез путресцина и его выведение за пределы клеток, что указывает на присутствие транспортера, то есть экспортера, функционирующего как переносчик путресцина, среди множества мембранных белков микроорганизма Corynebacterium sp.Соответственно, для выделения экспортера путресцина из микроорганизма Corynebacterium sp., авторы настоящего изобретения получили хромосомную библиотеку дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС13032, трансформировали этой библиотекой путресцин-продуцирующий штамм Corynebacterium glutamicum КССМ11138Р и селектировали штаммы, растущие в минимальной среде, содержащей путресцин. Селекцией третичных колоний был окончательно селектирован клон (В19), имеющий резистентность к путресцину, и было проведено секвенирование для подтверждения того, что клон содержит NCgl2522 (см. ФИГ. 1). В качестве экспортера путресцина, NCgl2522, имеющий происхождение от Corynebacterium glutamicum АТСС13032, имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, и NCgl2522, имеющий происхождение от Corynebacterium glutamicum АТСС13869, на 98% гомологичный указанной выше аминокислотной последовательности, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.

Полинуклеотид, кодирующий NCgl2522 по настоящему изобретению, может включать полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 или 23, или аминокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную ей, предпочтительно на 80% или более гомологичную ей, более предпочтительно на 90% или более гомологичную ей, намного более предпочтительно на 95% или более гомологичную ей, намного более предпочтительно на 98% или более гомологичную ей и наиболее предпочтительно на 99% или более гомологичную ей, при условии, что белок имеет активность, сходную с активностью белка NCgl2522, и может включать нуклеотидную последовательность 20 или 22.

При использовании здесь термин "гомология" относится к сходству между двумя аминокислотными последовательностями, и она может быть определена хорошо известными способами с использованием BLAST 2.0, рассчитывающего такие параметры, как показатель, идентичность и сходство.

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий NCgl2522 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант, гибридизующийся в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 20 или 22, или зонд, имеющий происхождение от указанной выше нуклеотидной последовательности, при условии, что он кодирует функциональный NCgl2522. При использовании здесь термин «строгие условия» означает условия, позволяющие проводить специфичную гибридизацию полинуклеотидов. Например, такие строгие условия подробно описаны в литературе (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

В настоящем изобретении «модификация для усиления активности NCgl2522, по сравнению с эндогенной активностью», может быть проведена способом, выбранным из способов увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок, модификации последовательности регуляции экспрессии для повышения экспрессии полинуклеотида, модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме для усиления активности фермента, удаления регуляторного фактора, подавляющего экспрессию гена, и их комбинаций.

Число копий полинуклеотида может быть, без ограничения, увеличено функциональным связыванием полинуклеотида с вектором или его интеграцией в геном клетки-хозяина. Конкретно, число копий полинуклеотида в геноме клетки-хозяина может быть увеличено путем введения в клетку-хозяина вектора, функционально связанного с полинуклеотидом, кодирующим белок по настоящему изобретению, проходящего репликацию и функционирующего независимо от клетки-хозяина, или путем введения в клетку-хозяина вектора, функционально связанного с полинуклеотидом, способного интегрировать полинуклеотид в геном клетки-хозяина.

При использовании здесь термин «вектор» относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую желаемый белок, функционально связанную с подходящей последовательностью регуляции экспрессии для экспрессии желаемого белка в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность включает промотор, способный инициировать транскрипцию, возможно, последовательность оператора для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы на мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После трансформации вектором подходящей клетки-хозяина он может проходить репликацию или функционировать независимо от генома хозяина и может быть интегрирован в сам геном.

Вектор, используемый в настоящем изобретении, не ограничен особым образом, при условии, что он способен к репликации в клетке-хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в данной области. Примеры традиционных векторов могут включать естественную или рекомбинантную плазмиду, космиду, вирус и бактериофаг. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, АРМ, t10, t11, Charon4A и Charon21A. В качестве плазмидного вектора могут быть использованы тип pBR, тип pUC, тип pBluescriptll, тип pGEM, тип pTZ, тип pCL и тип рЕТ. Вектор, применимый в настоящем изобретении, не ограничен особым образом, и может быть использован любой известный вектор экспрессии. Предпочтительно, может быть использован вектор pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 или pCCIBAC, и, более предпочтительно, может быть использован вектор pDZ.

Далее, полинуклеотид, кодирующий желаемый белок в хромосоме, может быть заменен мутантным полинуклеотидом с использованием вектора для хромосомной вставки. Введение полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено любым способом, известным в данной области, например, гомологичной рекомбинацией. Поскольку вектор по настоящему изобретению может быть введен в хромосому гомологичной рекомбинацией, он может дополнительно содержать селекционный маркер для подтверждения хромосомной вставки. Селекционный маркер предназначен для селекции клеток, трансформированных вектором, то есть для подтверждения вставки желаемого полинуклеотида, и селекционный маркер может включать маркеры, обеспечивающие селектируемые фенотипы, такие как резистентность к лекарственным средствам, ауксотрофность, резистентность к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных белков. Только клетки, экспрессирующие селекционный маркер, способны выживать или демонстрировать различные фенотипы в среде, обработанной селективным агентом, и, таким образом, можно селектировать трансформированные клетки.

При использовании здесь термин «трансформация» означает введение вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, таким образом, что в клетке-хозяине происходит экспрессия белка, кодируемого полинуклеотидом. При условии, что трансформированный полинуклеотид может быть экспрессирован в клетке-хозяине, он может быть интегрирован или помещен в хромосому клетки-хозяина или существовать вне хромосомы. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующую целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой генную конструкцию, содержащую все элементы, необходимые для ее автономной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета содержит промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигналы терминации транскрипции, сайты связывания рибосом или сигналы терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть представлена в форме самореплицируемого вектора экспрессии. Полинуклеотид может также быть сам по себе введен в клетку-хозяина и функционально связан с последовательностями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине.

Более того, при использовании здесь термин «функционально связанный» обозначает функциональную связь между полинуклеотидной последовательностью, кодирующей желаемый белок, и последовательностью промотора, инициирующего и опосредующего транскрипцию полинуклеотидной последовательности.

Кроме того, модификация регуляторной последовательности экспрессии для повышения экспрессии полинуклеотида может быть, без ограничения, проведена путем индукции модификации в регуляторной последовательности экспрессии посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены нуклеотидной последовательности или их комбинации с целью дополнительного усиления активности регуляторной последовательности экспрессии или заменой регуляторной последовательности экспрессии нуклеотидной последовательностью, имеющей более сильную активность. Регуляторная последовательность экспрессии включает, без ограничения, промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции.

Сильный гетерологичный промотор вместо исходного промотора может быть связан выше экспрессионной единицы полинуклеотида, и примеры сильного промотора могут включать промотор CJ7, промотор lysCPI, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асеА или асеВ и, более предпочтительно, промотор lysCP1 или промотор CJ7 как промотор, имеющий происхождение от Corynebacterium, и полинуклеотид, кодирующий фермент, функционально связан с ним, таким образом, что интенсивность его экспрессии может быть повышена. Здесь промотор lysCP1 представляет собой промотор, улучшенный заменой нуклеотидной последовательности промоторной области полинуклеотида, кодирующего аспартаткиназу и аспартатполуальдегиддегидрогеназу, и является сильным промотором, повышающим экспрессию гена аспартаткиназы, приводя к 5-кратному повышению активности соответствующего фермента по сравнению с диким типом (WO 2009/096689). Кроме того, промотор CJ7 представляет собой промотор, обнаруженный при исследовании последовательности сильного промотора у Corynebacterium ammoniagenes, и его экспрессия и сильная промоторная активность подтверждены у Corynebacterium ammoniagenes и Escherichia. Промотор CJ7 представляет собой промотор, который также демонстрирует высокую экспрессионную активность у Corynebacterium glutamicum (патент Кореи №0620092 и WO 2006/065095).

Далее, модификация последовательности полинуклеотида в хромосоме может быть, без ограничения, проведена путем индукции мутации регуляторной последовательности экспрессии посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены последовательности полинуклеотида или их комбинации с целью дополнительного усиления активности последовательности полинуклеотида или заменой последовательности последовательностью полинуклеотида, модифицированной для усиления активности.

В одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения для обеспечения микроорганизма Corynebacterium sp. с повышенной путресциновой продуктивностью, число копий гена может быть увеличено путем введения в хромосому полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 или 22, кодирующего NCgl2522, вовлеченный в выведение путресцина, или собственный промотор NCgl2522 может быть заменен промотором, имеющим улучшенную активность, предпочтительно промотором CJ7, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 24.

При использовании здесь термин "микроорганизм, имеющий путресциновую продуктивность" или "микроорганизм, продуцирующий путресцин" относится к микроорганизму, полученному приданием путресциновой продуктивности исходному штамму, не имеющему путресциновой продуктивности. Микроорганизм, которому придана путресциновая продуктивность или который продуцирует путресцин, может, без ограничения, представляет собой микроорганизм, имеющий повышенную продуктивность орнитина для использования в качестве исходного вещества для биосинтеза путресцина, модифицированный для повышения активности ацетилглутаматсинтазы, превращающей глутамат в ацетилглутамат (N-ацетилглутамат), или орнитинацетилтрансферазы (ArgJ), превращающей ацетилорнитин в орнитин, ацетилглутаматкиназы (ArgB), превращающей ацетилглутамат в ацетилглутамилфосфат (N-ацетилглутамилфосфат), ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктазы (ArgC), превращающей ацетилглутамилфосфат в ацетилглутаматполуальдегид (N-ацетилглутаматполуальдегид), или ацетилорнитинаминотрансферазы (ArgD), превращающей ацетилглутаматполуальдегид в ацетилорнитин (N-ацетилорнитин), по сравнению с эндогенной активностью, для усиления пути биосинтеза от глутамата до орнитина. Кроме того, микроорганизм представляет собой микроорганизм, модифицированный для ослабления активности орнитинкарбамоилтрансферазы (ArgF), вовлеченной в синтез аргинина из орнитина, белка (NCgl1221), вовлеченного в выведение глутамата, и/или белка (NCgl469), ацетилирующего путресцин, по сравнению с эндогенной активностью, и/или модифицированный для придания активности орнитиндекарбоксилазы (ODC).

В этой связи, ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктаза (ArgC), ацетилглутаматсинтаза или орнитинацетилтрансфераза (ArgJ), ацетилглутаматкиназа (ArgB), ацетилорнитинаминотрансфераза (ArgD), орнитинкарбамоилтрансфераза (ArgF), белок (NCgl1221), вовлеченный в экспорт глутамата, и орнитиндекарбоксилаза (ODC) могут предпочтительно иметь, без ограничения, аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30 и 33, соответственно, или аминокислотные последовательности, на 70% или более гомологичные им, более предпочтительно на 80% или более гомологичные им или намного более предпочтительно на 90% или более гомологичные им, соответственно. Кроме того, белок (NCgl469), ацетилирующий путресцин, может предпочтительно иметь, без ограничения, аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31 или 32, или аминокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную им, более предпочтительно на 80% или более гомологичную им или намного более предпочтительно на 90% или более гомологичную им.

Из этих белков, повышение активности ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктазы (ArgC), ацетилглутаматсинтазы или орнитинацетилтрансферазы (ArgJ), ацетилглутаматкиназы (ArgB), ацетилорнитинаминотрансферазы (ArgD) и орнитиндекарбоксилазы (ODC) может быть достигнуто описанным выше способом повышения активности NCgl2522, например, способом, выбранным из способов увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок, модификации последовательности регуляции экспрессии для повышения экспрессии полинуклеотида, модификации последовательности полинуклеотида в хромосоме для усиления активности фермента, удаления регуляторного фактора, подавляющего экспрессию полинуклеотида фермента, и их комбинаций.

Кроме того, активность орнитинкарбамоилтрансферазы (ArgF), белка (NCgl1221), вовлеченного в экспорт глутамата, и белка (NCgl469), ацетилирующего путресцин, может быть уменьшена способом выбранным из группы, состоящей из частичной или полной делеции полинуклеотида, кодирующего белок, модификации последовательности регуляции экспрессии для подавления экспрессии полинуклеотида, модификации последовательности полинуклеотида в хромосоме для уменьшения активности белка и их комбинаций.

Подробнее, частичная или полная делеция полинуклеотида, кодирующего белок, может быть проведена введением вектора для хромосомной вставки в микроорганизм с заменой посредством этого полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой белок, в хромосоме на частично удаленный полинуклеотид или маркерный ген. «Частичный» может варьировать в зависимости от типа полинуклеотида, но конкретно относится к 1-300, предпочтительно 1-100 и более предпочтительно 1-50 нуклеотидам.

Кроме того, модификация регуляторной последовательности экспрессии может быть проведена путем индукции модификации регуляторной последовательности экспрессии посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены нуклеотидной последовательности или их комбинации с целью уменьшения активности регуляторной последовательности экспрессии или заменой регуляторной последовательности экспрессии нуклеотидной последовательностью, имеющей более слабую активность. Регуляторная последовательность экспрессии включает промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции.

Кроме того, модификация последовательности полинуклеотида в хромосоме может быть проведена индукцией мутации последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены последовательности полинуклеотида или их комбинации с целью уменьшения ферментативной активности или заменой последовательности последовательностью полинуклеотида, модифицированной для ослабления активности.

Более того, регуляторный фактор, подавляющий экспрессию полинуклеотида фермента, может быть удален путем замены полинуклеотида фактора, подавляющего экспрессию, на частично удаленный полинуклеотид или маркерный ген. «Частичный» может варьировать в зависимости от типа полинуклеотида, но конкретно относится к 1-300, предпочтительно 1-100 и более предпочтительно 1-50 нуклеотидам.

В то же время, микроорганизм по настоящему изобретению представляет собой микроорганизм, продуцирующий путресцин, и включает прокариотический микроорганизм, экспрессирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21 или 23, и его примеры могут включать микроорганизмы, принадлежащие к Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobactersp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwiniasp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomanas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Arcanobacterium sp., Alcaligenes sp. или тому подобным. Микроорганизм по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой микроорганизм, принадлежащий к Escherichia sp., или микроорганизм, принадлежащий к Corynebacterium sp., и более предпочтительно Е. coli или Corynebacterium glutamicum.

В определенном воплощении настоящего изобретения микроорганизм Corynebacterium sp. с регистрационным номером КССМ11138Р (публикация патента Кореи №2012-0064046) и микроорганизм Corynebacterium sp. с регистрационным номером КССМ11240Р (заявка на патент Кореи №2012-0003634) использовали в качестве штаммов, имеющих усиленный синтетический путь от глутамата до путресцина, получая посредством этого путресцин в высокой концентрации.

В еще одном воплощении настоящего изобретения были использованы путресцин-продуцирующие штаммы КССМ11138Р и КССМ11240Р, основанные на Corynebacterium glutamicum АТСС13032, и путресцин-продуцирующие штаммы DAB12-a и DAB12-D, основанные на Corynebacterium glutamicum АТСС13869, имеющие одинаковый генотип. Штамм АТСС13869 может быть получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС). То есть, каждому штамму в каталоге АТСС присвоен уникальный регистрационный номер, и штамм можно заказать по регистрационному номеру. Конкретно, путресцин-продуцирующий штамм DAB12 характеризуется делецией гена, кодирующего орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF), и гена, кодирующего экспортер глутамата NCgl1221, введением гена, кодирующего орнитиндекарбоксилазу (OCD), и заменой промотора оперона гена биосинтеза орнитина (argCJBD) улучшенным промотором у Corynebacterium glutamicum АТСС13869. Кроме того, штамм DAB12-D характеризуется тем, что он получен модификацией штамма DAB12-a для ослабления активности белка (NCgl1469), ацетилирующего путресцин, по сравнению с эндогенной активностью.

Согласно одному предпочтительному Примеру, в качестве путресцин-продуцирующих штаммов были получены Corynebacterium glutamicum КССМ11138Р, полученный делецией гена, кодирующего орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF), и гена, кодирующего экспортер глутамата NCgl1221, заменой собственного промотора генного кластера ArgCJBD, кодирующего фермент, вовлеченный в биосинтез орнитина из глутамата, на улучшенный промотор, и введением гена, кодирующего орнитиндекарбоксилазу (OCD), в хромосому Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа, и Corynebacterium glutamicum КССМ11240Р, полученный дополнительным ослаблением гена, кодирующего ацетилтрансферазу NCgl1469 у данного микроорганизма.

В то же время, для получения штамма с делецией NCgl2522, имеющего происхождение от Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, получали плазмиду pDZ-1'NCgl2522(K/O), основанную на нуклеотидной последовательности NCgl2522, имеющей происхождение от Corynebacterium glutamicum АТСС13032.

Плазмидой pDZ-1'NCgl2522(K/0) трансформировали полученные путресцин-продуцирующие штаммы КССМ11138Р и КССМ11240Р, селектировали штаммы с делецией NCgl2522 и обозначали их КССМ11138Р ΔNCgl2522 и КССМ11240Р ΔNCgl2522, соответственно. Таким же образом получали штаммы с делецией NCgl2522, имеющие происхождение от Corynebacterium glutamicum АТСС13869, и обозначали их DAB12-a ΔNCgl2522 и DAB12-D ΔNCgl2522.

Путресциновую продуктивность 4 типов штаммов с делецией NCgl2522, полученных таким образом, сравнивали с путресциновой продуктивностью исходного штамма, и, в результате, у всех КССМ11138Р ΔNCgl2522, КССМ11240Р ΔNCgl2522, DAB12-a ΔNCgl2522 и DAB12-b ΔNCgl2522 с делецией NCgl2522 путресциновая продуктивность была снижена, по сравнению с исходным штаммом (см. Таблицу 3). На основании этого результата, авторы настоящего изобретения подтвердили, что актив