Композиции neisseria meningitidis и способы их применения

Композиции neisseria meningitidis и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается композиций Neisseria meningitidis и способов их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Neisseria meningitidis является грамотрицательной инкапсулированной бактерией, способной вызывать сепсис, менингит и смерть. N. meningitidis может разделяться приблизительно на 13 серогрупп (включая серогруппы А, В, С, Е29, H, I, К, L, W-135, X, Y и Z) на основе химических и антигенных различий полисахаридных капсул. Болезнь обусловлена, главным образом, пятью из серогрупп (А, В, С, Y и W135).

Менингококковый менингит является тяжелым заболеванием, способным убивать детей и молодых взрослых людей за несколько часов, несмотря на наличие антибиотиков. Существует потребность в улучшенных иммуногенных композициях против менингококковых серогрупп А, В, С, Y и W135 и/или X.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для удовлетворения этой и других потребностей настоящее изобретение обеспечивает композиции Neisseria meningitidis и способы их применения.

В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 1-184 SEQ ID NO: 71.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 158-185 SEQ ID NO: 71. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 159-186 SEQ ID NO: 71.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает, по меньшей мере, 6 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в позициях 185-254 SEQ ID NO: 71.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.

В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 76, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.

В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.

В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления. В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из описанных авторами вариантов осуществления.

В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.

В одном варианте осуществления выделенная нуклеиновокислотная последовательность включает SEQ ID NO: 72.

В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, два конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, три конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

В одном варианте осуществления полипептид является полипептидом подсемейства А.

В одном варианте осуществления полипептид является полипептидом подсемейства В.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А05.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А12.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А22.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В01.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В09.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В44.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В22.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В24.

В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А62.

В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.

В одном аспекте изобретение касается способа вызывания иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В, и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппы С у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.

В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппа Y у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.

В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

В другом аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis у млекопитающего, включая введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1A-1F: Вариантные нуклеиновокислотные последовательности Р2086.

Фигура 2А-2С: Вариантные аминокислотные последовательности Р2086. Ствол Gly/Ser в N-концевом хвосте каждого варианта подчеркнут.

Фигура 3: Структура белка ORF2086

Фигура 4: Удаление N-концевого Cys в результате ведет к потере экспрессии в Е. coli.

Фигура 5: Влияние длины ствола Gly/Ser на экспрессию нелипидированного варианта ORF2086. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В01, представлена в SEQ ID NO: 35. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В44, представлена в SEQ ID NO: 36. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А05, представлена в SEQ ID NO: 37. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А22, представлена в SEQ ID NO: 38. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В22, представлена в SEQ ID NO: 39. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А19, представлена в SEQ ID NO: 40.

Фигура 6: Высокий уровень экспрессии нелипидированного В09, несмотря на короткий ствол Gly/Ser. Первые две полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-делетированного варианта В09 до и после индукции. Третья и четвертая полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-положительного варианта В09 до и после индукции. Крайняя правая полоса представляет стандарт молекулярной массы. Аминокислотная последовательность, показанная под изображением, представлена в SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант А22, указанный на фигуре как "А22_001", представлена в последовательности SEQ ID NO: 42, показанной на фигуре под SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В22, указанный на фигуре как "В22_001", представлена в SEQ ID NO: 52. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В09, указанный на фигуре как "В09_004", представлена в SEQ ID NO: 53.

Фигура 7: Оптимизация кодонов повышает экспрессию нелипидированных вариантов В22 и А22. Слева показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта В22 до (полосы 1 и 3) и после (полосы 2 и 4) индукции IPTG. Справа показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта А22 до (полоса 7) и после (полоса 8) индукции IPTG. Полосы 5 и 6 представляют стандарты молекулярной массы.

Фигура 8А-8Н: Вариантные нуклеиново- и аминокислотные последовательности Р2086

Фигура 9А-9В: Выравнивание последовательности выбранных вариантов дикого типа подсемейств А и В ffHBP, обсуждаемых в Примерах 15-19. Следует заметить, что N-конец А62 является на 100% идентичным В09, а его С-конец является на 100% идентичным А22. Показанными последовательностями являются А05 (SEQ ID NO: 13); А12 (SEQ ID NO: 14); A22 (SEQ ID NO: 15); A62 (SEQ ID NO: 70); B09 (SEQ ID NO: 18); B24 (SEQ ID NO: 20); и консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 78).

ОПРЕДЕЛИТЕЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А04 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 3 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 4 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12-2 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 5 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 6 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В02 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 7 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант ВОЗ гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 8 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 9 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 10 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В24 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 11 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.

SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А04, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 13 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А12, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 15 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В02, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 17 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант ВОЗ, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 19 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 20 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 21 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 22 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2.

SEQ ID NO: 23 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2.

SEQ ID NO: 24 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.

SEQ ID NO: 25 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.

SEQ ID NO: 26 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.

SEQ ID NO: 27 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.

SEQ ID NO: 28 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.

SEQ ID NO: 29 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 28.

SEQ ID NO: 30 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.

SEQ ID NO: 31 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 30.

SEQ ID NO: 32 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.

SEQ ID NO: 33 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 34.

SEQ ID NO: 34 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.

SEQ ID NO: 35 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, показанную на Фигуре 5.

SEQ ID NO: 36 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, показанную на Фигуре 5.

SEQ ID NO: 37 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, показанную на Фигуре 5.

SEQ ID NO: 38 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 5.

SEQ ID NO: 39 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 5.

SEQ ID NO: 40 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А19, показанную на Фигуре 5.

SEQ ID NO: 41 представляет аминокислотную последовательность для N-конца а N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант, показанную на Фигуре 6.

SEQ ID NO: 42 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 6.

SEQ ID NO: 43 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pDK087 включает SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 44 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44. SEQ ID NO: 44 идентична SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 21 делетирован. SEQ ID 44 кодируется, например, SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 45 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован, и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ0б3 включает SEQ ID NO: 45.

SEQ ID NO: 46 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ064 включает SEQ ID NO: 46.

SEQ ID NO: 47 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ065 включает SEQ ID NO: 47.

SEQ ID NO: 48 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида pLA134 включает SEQ ID NO: 48.

SEQ ID NO: 49 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09. SEQ ID NO: 49 идентична SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 18 делетирован. SEQ ID 49 кодируется, например, последовательностью ДНК, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48.

SEQ ID NO: 50 представляет аминокислотную последовательность для Ν. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 50 кодируется, например, SEQ ID NO: 45.

SEQ ID NO: 51 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pLN056 включает SEQ ID NO: 51.

SEQ ID NO: 52 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 6.

SEQ ID NO: 53 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, показанную на Фигуре 6.

SEQ ID NO: 54 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 55 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 55 идентична SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 13 делетирован. SEQ ID NO: 55 кодируется, например, SEQ ID NO: 54.

SEQ ID NO: 56 представляет аминокислотную последовательность серино-глициновой последовательности повтора, как показано в Примере 7.

SEQ ID NO: 57 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01. SEQ ID NO: 57 идентична SEQ ID NO: 58, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 58 делетирован.

SEQ ID NO: 58 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 59 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В15, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 60 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В16, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 61 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на кодон для глицина.

SEQ ID NO: 62 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на глицин.

SEQ ID NO: 63 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на кодон для глицина.

SEQ ID NO: 64 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на глицин.

SEQ ID NO: 65 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (рЕВ042), кодирующую нелипидированный, непирувилированный полипептид А05.

SEQ ID NO: 66 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант A12. SEQ ID NO: 66 идентична SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 14 делетирован. SEQ ID NO: 66 кодируется, например, SEQ ID NO: 67.

SEQ ID NO: 67 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида A12.

SEQ ID NO: 68 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22. SEQ ID NO: 68 идентична SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 15 делетирован. SEQ ID NO: 68 кодируется, например, SEQ ID NO: 69.

SEQ ID NO: 69 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида А22.

SEQ ID NO: 70 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis серогруппа В, 2086, вариант А62, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 71 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А62. SEQ ID NO: 71 идентична SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 70 делетирован.

SEQ ID NO: 72 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для SEQ ID NO: 71.

SEQ ID NO: 73 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (pDK086) для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 74 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А29, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.

SEQ ID NO: 75 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22. SEQ ID NO: 75 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 19 делетирован.

SEQ ID NO: 76 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05.

SEQ ID NO: 77 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 77 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 76 отсутствует.

SEQ ID NO: 78 представляет аминокислотную последовательность для консенсусной последовательности, показанной на ФИГ. 9А-9В.

SEQ ID NO: 79 идентична SEQ ID NO: 78, за исключением того, что Cys в позиции 1 SEQ ID NO: 78 отсутствует.

SEQ ID NO: 80 представляет аминокислотную последовательность для Ν. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 80 идентична SEQ ID NO: 20, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 20 делетирован.

SEQ ID NO: 81 представляет аминокислотную последовательность для Ν. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 81 идентична SEQ ID NO: 20, в которой остатки в позициях 1-3 SEQ ID NO: 20 делетированы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если нет иного определения, все применяемые авторами технические и научные термины имеют такие же значения, общепринятые среди специалистов в области, к которой относится это изобретение. Хотя при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения могут применяться способы и материалы, подобные или равноценные описываемым авторами, приемлемые способы и материалы описываются ниже. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничительные. Все публикации, патенты и другие упомянутые авторами документы включены путем ссылки в их полном объеме.

Определения

Термин "антиген" в целом касается биологической молекулы, как правило, белка, пептида, полисахарида, липида или конъюгата, который содержит по меньшей мере один эпитоп, с которым может быть выборочно связано родственное антитело; или, в некоторых случаях, иммуногенного вещества, которое может стимулировать выработку антител или вызывать Т-клеточные иммунные реакции, или и то, и другое, в организме животного, включая композиции, вводимые путем инъекции или абсорбируемые организмом животного. Иммунная реакция может быть вызвана для всей молекулы или для одной или нескольких разных частей молекулы (например, эпитопа или гаптена). Этот термин может применяться по отношению к отдельной молекуле или к гомогенной или гетерогенной популяции антигенных молекул. Антиген распознается антителами, Т-клеточными рецепторами или другими элементами специфического гуморального и/или клеточного иммунитета. Термин "антиген" включает все соответствующие антигенные эпитопы. Эпитопы данного антигена могут быть распознаны с применением любого количества способов картирования эпитопов, хорошо известных среди специалистов в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Например, линейные эпитопы могут определяться путем одновременного синтезирования большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям молекулы белка, и приведения пептидов в реакцию с антителами, пока пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие технологии известны специалистам в данной области и описываются, например, в Патенте США №4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. Подобным образом конформационные эпитопы могут распознаваться путем определения пространственной конформации аминокислот, например, при помощи рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Кроме того, в контексте настоящего изобретения термин "антиген" также может применяться по отношению к белку, включающему модификации, такие, как делеции, добавления и замещения (как правило, консервативного характера, хотя они могут быть и неконсервативными) в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет способность к вызыванию иммунологической реакции. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, путем сайт-специфического мутагенеза или с применением конкретных процедур синтеза или при помощи генной инженерии, или же могут быть случайными, например, при мутации хозяев, вырабатывающих антигены. Кроме того, антиген может быть извлечен, получен или выделен из микроба, например, бактерии, или может быть целым организмом. Подобным образом определение также включает олигонуклеотид или полинуклеотид, экспрессирующий антиген, например, при иммунизации нуклеиновой кислотой. Также включаются синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75: 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 - Jul. 3, 1998).

Термин "консервативные" по отношению к аминокислотным замещениям может применяться на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера задействованных остатков. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, триптофан и метионин; к полярным/нейтральным аминокислотам относятся глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; к положительно заряженным (основным) аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин; и к отрицательно заряженным (кислотным) аминокислотам относятся аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления изменения консервативной аминокислоты меняют первичную последовательность полипептидов ORF2086, но не меняют функцию молекулы. При создании этих мутантов может учитываться индекс гидропатичности аминокислот. Значение индекса гидропатичности аминокислот в обеспечении интерактивной биологической функции на полипептиде в целом осознается специалистами в данной области (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1): 105-32). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими подобный индекс или показатель гидропатичности, и образуемый в результате полипептид все равно обладает подобной биологической активностью. Каждая аминокислота получает свой индекс гидропатичности на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Их показатели таковы: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серии (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3.9); и аргинин (-4,5).

Считается, что относительный гидропатический характер аминокислотного остатка определяет вторичную и третичную структуру образуемого в результате полипептида, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие полипептида с другими молекулами, такими, как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и т.п. Специалистам в данной области известно, что аминокислота может быть замещена другой аминокислотой, имеющей подобный индекс гидропатичности, и при этом может быть получен функционально равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтение отдается замещению аминокислот, индексы гидропатичности которых находятся в пределах +/-2, особенно предпочтительно - в пределах +/-1, и еще более предпочтительно - в пределах +/-0,5.

Консервативные аминокислотные замещения или вставки также могут осуществляться на основе гидрофильности. Как описывается в Патенте США №4,554,101, включенном в данное описание путем ссылки, наибольшая локальная средняя гидрофильность полипептида, определяемая гидрофильностью прилегающих к нему аминокислот, коррелирует с иммуногенностью и антигенностью, т.е., с биологическими свойствами полипептида. В Патенте США №4,554,101 указывается, что аминокислотные остатки имеют следующие показатели гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); пролин (-0,5±1); треонин (-0,4); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Следует понимать, что аминокислота может быть замещена другой, имеющей подобный показатель гидрофильности, и при этом может быть получен биологически равноценный, в частности, иммунологически равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтительными являются замещения аминокислот, показатели гидрофильности которых находятся в пределах ±2; особенно предпочтительно - в пределах ±1; и еще более предпочтительно - в пределах ±0,5. Типичные замещения, при которых учитываются разные из вышеуказанных характеристик, хорошо известны специалистам в данной области, и к ним, помимо прочих, относятся: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.

Термин "эффективное иммуногенное количество" в контексте данного описания означает количество полипептида или композиции, включающей полипептид, которое является эффективным для вызывания иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Например, эффективное иммуногенное количество белка rLP2086 согласно этому изобретению означает количество, которое является эффективным при вызывании иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Конкретная "эффективная иммуногенная доза или количество" зависит от возраста, массы и медицинского состояния хозяина, а также от способа введения. Соответствующие дозы легко определяются специалистами в данной области.

Термин "ствол Gly/Ser" в контексте данного описания означает ряд остатков Gly и Ser непосредственно после N-концевого Cys остатка белка, кодируемого ORF2086. В стволе Gly/Ser может существовать от 5 до 12 остатков Gly и Ser. Соответственно, ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Предпочтительно ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Стволы Gly/Ser вариантов Р2086 согласно настоящему изобретению представлены подчеркнутыми последовательностями на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 12-21). Как показано авторами, длина ствола Gly/Ser может влиять на устойчивость уровня экспрессии нелипидированного варианта Р2086. В типичном варианте осуществления эффект от влияния на длину ствола Gly/Ser сравнивают с показателями соответствующего варианта дикого типа.

Термин "иммуногенный" относится к способности антигена или вакцины к вызыванию иммунной реакции, гуморальной или клеточно-опосред