Антитела к jagged и способы их применения

Антитела к jagged и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка является непредварительной заявкой, поданной в соответствии с §1.53 (b) (1) раздела 37 Свода федеральных нормативных документов, и испрашивает приоритет в соответствии с Кодексом законов США, раздел 35, §119 (е) на основании предварительной заявки на патент США №61/682640, поданной 13 августа 2012 года, и предварительной заявки на патент США №61/784332, поданной 14 марта 2013 года, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в формате ASCII с помощью системы EFS-Web и тем самым полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. Копия указанного перечня в формате ASCII, созданная 9 августа 2013 года, имеет название P4959R1_WO_SeqList.txt, и размер данного файла составляет 121708 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителам к Jagged и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Путь передачи сигналов, в котором задействованы рецепторы Notch, обеспечивает регуляцию широкого спектра клеточных функций (Kopan et al., Cell 137, 216-233 (2009)). У млекопитающих были идентифицированы четыре типа рецепторов Notch, а именно Notch 1-4, которые содержат одинаковые основные структурные элементы, включающие внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Аналогичным образом, канонические лиганды рецептора Notch имеют определенное структурное сходство, однако был идентифицирован и ряд неканонических лигандов Notch (Kopan et al., Cell 137, 216-233 (2009)). Пять канонических лигандов у млекопитающих включают Delta-подобный лиганд 1, Delta-подобный лиганд 3, Delta-подобный лиганд 4, Jagged1 и Jagged2. Связывание лиганда Notch с внеклеточным доменом рецептора Notch инициирует запуск сигнального каскада, который начинается с протеолитического расщепления во внеклеточном сайте S2 под действием альфа-секретазы семейства ADAM (дизинтегрин и металлопротеаза). После расщепления в сайте S2 происходит протеолитическое расщепление во внутриклеточном сайте S3 под действием гамма-секретазы, в результате чего происходит высвобождение внутриклеточного домена и последующие события каскада, которые, в конечном итоге, активируют Notch-зависимые факторы транскрипции, такие как Hes1 и Неу.

Поскольку нарушение экспрессии и передачи сигнала Notch связывают с рядом заболеваний, включая рак (Koch et al., Cell. Mol. Life Sci. 64, 2746-2762 (2007)), были проведены исследования модуляторов сигнальных путей, в которых задействованы Notch, как потенциальных терапевтических средств для лечения таких заболеваний. Например, ингибиторы гамма-секретазы изучали в клинических исследованиях для установления их эффективности при лечении различных злокачественных новообразований (Shih et al, Cancer Res. 67, 1879-1882 (2007)). Ингибиторы гамма-секретазы предотвращают расщепление в сайте S3 и тем самым предотвращают передачу сигналов посредством рецепторов Notch. Однако ингибиторы гамма-секретазы не обладают специфичностью в отношении различных членов семейства Notch и, следовательно, ингибируют передачу сигналов через несколько рецепторов одновременно, а также через другие сигнальные пути (Beel et al., Cell. Mol. Life Sci. 65, 1311-1334 (2008)). Следовательно, введение ингибиторов гамма-секретазы связано с токсичностью в отношении кишечника, которая проявляется в виде потери массы тела и метаплазии бокаловидных клеток кишечника, что свидетельствует о роли Notch в определении судьбы клеток путем поддержания пролиферации клеток-предшественников кишечных крипт и подавления дифференциации в секреторные клетки (See van Es et al., Nature 435:959-963 (2005)). Аналогичным образом, ингибирование путей передачи сигналов, опосредованных как Notch 1, так и Notch2, с помощью условного нокаута генов Notch (Riccio et al., EMBO Rep. 9:377-383 (2008)) или путем ингибирования с применением антител-антагонистов (публикация заявки на патент США №2010/0080808) также вызывает метаплазию бокаловидных клеток кишечника.

Ввиду серьезной токсичности, связанной с применением ингибиторов нескольких рецепторов Notch, в данной области техники существует значительная потребность в направленном ингибировании передачи сигналов через конкретные рецепторы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены антитела к Jagged и способы их применения.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с Jagged1. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное антитело является антагонистом Jagged1-опосредованной передачи сигналов. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть гипервариабельных областей (HVR), выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84; (с) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87; (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110; (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111; и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с Jagged2. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело является антагонистом Jagged2-опосредованной передачи сигналов. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89; (с) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94; (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115; (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116; и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115; (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, предложено выделенное антитело, которое связывается с Jagged1 и Jagged2 (Jagged1/2). Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело является антагонистом Jagged1/2-опосредованной передачи сигналов. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96; (с) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99; (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123; (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; (с) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109; (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации представляет собой моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации представляет собой фрагмент антитела.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, предложено выделенное антитело, описанное выше, дополнительно содержащее каркасный участок (FR) вариабельного домена легкой цепи FR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; FR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; FR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; и FR4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит каркасный участок вариабельного домена тяжелой цепи FR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50; FR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; FR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и FR4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит каркасный участок вариабельного домена тяжелой цепи FR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50; FR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48; FR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и FR4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, предложено выделенное антитело, которое связывается с Jagged1, содержащее (а) последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; (b) последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; или (с) последовательность VH, приведенную в (а), и последовательность VL, приведенную в (b). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 10. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 19. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 10, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 19. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит (а) последовательность VH, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11; (b) последовательность VL, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; или (с) последовательность VH, приведенную в (а), и последовательность VL, приведенную в (b). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 11. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 20. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 11, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 20.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, предложено выделенное антитело, которое связывается с Jagged1, содержащее (а) последовательность VH, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15; (b) последовательность VL, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24; или (с) последовательность VH, приведенную в (а), и последовательность VL, приведенную в (b). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 24. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 15, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 24.

Согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации указанное антитело может представлять собой полноразмерное антитело IgG1.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено выделенное антитело, которое конкурирует с любым из антител, описанных в вышеупомянутых вариантах реализации, за специфичное связывание с Jagged1. Согласно другому аспекту настоящего изобретения, предложено выделенное антитело, которое конкурирует с любым из антител, описанных в вышеупомянутых вариантах реализации, за специфичное связывание с Jagged2. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая выделенное антитело согласно вышеупомянутым вариантам реализации. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина с получением тем самым антитела.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен иммуноконъюгат, содержащий антитело согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации и цитотоксический агент.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен фармацевтический состав, содержащий антитело согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено антитело согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации для применения в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено антитело согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации для применения в лечении рака. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено антитело согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации для применения в уменьшении роста раковых клеток.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ ингибирования Jagged1-опосредованной передачи сигналов. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, предложен способ ингибирования Jagged1-опосредованной передачи сигналов в условиях in vitro. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, предложен способ ингибирования Jagged1-опосредованной передачи сигналов в условиях in vivo.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта, страдающего раком, включающий введение субъекту эффективного количества антитела согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения рак выбран из группы, состоящей из: рака молочной железы, рака легких, рака мозга, рака шейки матки, рака толстой кишки, рака печени, рака желчных протоков, рака поджелудочной железы, рака кожи, В-клеточных злокачественных новообразований и Т-клеточных злокачественных новообразований.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ. 1 приведены типичные аминокислотные последовательности человеческого и мышиного белка Jagged1.

На ФИГ. 2 приведены типичные аминокислотные последовательности человеческого и мышиного белка Jagged2.

На ФИГ. 3A-D приведены аминокислотные последовательности пептидов, использованных для скрининга и селекции фаговых библиотек антител. Все белки экспрессировали в виде секретируемого белка в клетках BEVS, и их последовательности показаны в направлении от N-конца к С-концу. (А) Аминокислотная последовательность экспрессированного мышиного белка Jagged 1-DSL-EGF1-4 (Q34-D377). Жирный шрифт на N-конце обозначает короткую линкерную последовательность (ADLGS) (SEQ ID NO: 31). Жирный шрифт на С-конце обозначает короткую линкерную последовательность (EFG), сайт расщепления тромбином (LVPRGS) (SEQ ID NO: 137), G-спейсер и 6-His метку (SEQ ID NO: 138). (В) Аминокислотная последовательность экспрессированного человеческого белка Jagl-DSL-EGFl-4. Показана только последовательность Jag1, несмотря на то, что антиген также содержал сайт расщепления протеазой TEV и 6-His метку (SEQ ID NO: 138) на С-конце. (С) Аминокислотная последовательность экспрессированного мышиного белка Jag2-DSL-EGF1-4 (М27-Е388). Жирный шрифт на N-конце обозначает короткую линкерную последовательность (ADLGS) (SEQ ID NO: 31). Жирный шрифт на С-конце обозначает короткую линкерную последовательность (EFG), сайт расщепления тромбином (LVPRGS) (SEQ ID NO: 137), G-спейсер и 6-His метку (SEQ ID NO: 138). (D) Аминокислотная последовательность экспрессированного человеческого белка Jag2-DSL-EGF 1-4 (R2-E388). Жирный шрифт на С-конце обозначает короткую линкерную последовательность (EFG), сайт расщепления тромбином (LVPRGS) (SEQ ID NO: 137), G-спейсер и 6-His метку (SEQ ID NO: 138).

На ФИГ. 4A-1-B-2 приведены результаты сопоставления аминокислотных последовательностей вариабельных доменов тяжелой (ФИГ. 4А-1 и ФИГ. 4А-2) и легкой цепей (ФИГ. 4В-1 и ФИГ. 4В-2) антител к Jagged (пример 1-2). На фигуре указаны положения аминокислотных остатков областей, определяющих комплементарность (CDR).

На ФИГ. 5А-В приведены типичные акцепторные консенсусные последовательности каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH) человека для применения при реализации настоящего изобретения. Идентификационные номера последовательностей представлены ниже:

- консенсусная последовательность каркаса VH подгруппы I человека «А» минус CDR в соответствии с системой нумерации Кабат (SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35).

- консенсусные последовательности каркасов VH подгруппы I человека «В», «С» и «D» минус расширенные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 36, 37, 34, 35; SEQ ID NO: 36, 37, 38, 35 и SEQ ID NO: 36, 37, 39, 35).

- консенсусная последовательность каркаса VH подгруппы II человека «А» минус CDR в соответствии с системой нумерации Кабат (SEQ ID NO: 40, 41, 42, 35).

- консенсусные последовательности каркасов VH подгруппы II человека «В», «С» и «D» минус расширенные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 43, 44, 42, 35; SEQ ID NO: 43, 44, 45, 35 и SEQ ID NO: 43, 44, 46, и 35).

- консенсусная последовательность каркаса VH подгруппы III человека «А» минус CDR в соответствии с системой нумерации Кабат (SEQ ID NO: 47, 48, 49, 35).

- консенсусные последовательности каркасов VH подгруппы III человека «В», «С» и «D» минус расширенные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 50, 51, 49, 35; SEQ ID NO: 50, 51, 52, 35 и SEQ ID NO: 50, 51, 53, 35).

- акцепторная последовательность каркаса VH человека «А» минус CDR в соответствии с системой нумерации Кабат (SEQ ID NO: 54, 48, 55, 35).

- акцепторные последовательности каркасов VH человека «В» и «С» минус расширенные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 50, 51, 55, 35 и SEQ ID NO: 50, 51, 56, 35).

- 2 акцепторная последовательность каркаса VH человека «А» минус CDR в соответствии с системой нумерации Кабат (SEQ ID NO: 54, 48, 57, 35).

- 2 акцепторные последовательности каркасов VH человека «В», «С» и «D» минус расширенные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 50, 51, 57, 35; SEQ ID NO: 50, 51, 58, 35 и SEQ ID NO: NO: 50, 51, 59, 35).

На ФИГ. 6 приведены типичные акцепторные консенсусные последовательности каркасов вариабельного домена легкой цепи (VL) человека, использованные при реализации настоящего изобретения. Идентификационные номера последовательностей приведены ниже:

- консенсусная последовательность каркаса VL каппа-цепи подгруппы I человека (κv1): SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63,

- консенсусная последовательность каркаса VL каппа-цепи подгруппы II человека (κv2): SEQ ID NO: 64, 65, 66, 63,

- консенсусная последовательность каркаса VL каппа-цепи подгруппы III человека (κv3): SEQ ID NO: 67, 68, 69, 63

- консенсусная последовательность каркаса VL каппа-цепи подгруппы IV человека (κv4): SEQ ID NO: 70, 71, 72, 63.

На ФИГ. 7A-F приведены последовательности гипервариабельных областей тяжелой цепи HVR H1, Н2 и Н3 антител к Jagged, описанных в примерах. Положения аминокислот пронумерованы в соответствии с системой нумерации Кабат, описанной ниже.

На ФИГ. 8А-Е приведены последовательности гипервариабельных областей легкой цепи HVR L1, L2 и L3 антител к Jagged, описанных в примерах. Положения аминокислот пронумерованы в соответствии с системой нумерации Кабат, описанной ниже.

На ФИГ. 9 приведены последовательности каркаса легкой и тяжелой цепей антител к Jagged, описанных в примерах. Числа в верхнем индексе указывают на положение аминокислот в соответствии с системой нумерации Кабат.

На ФИГ. 10А-В приведены результаты исследования специфичности связывания антител, полученных в ходе первого (ФИГ. 10А) и второго (ФИГ. 10 В) раунда скрининга. (А) Результаты измерения методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) связывания антитела D-1 (левая панель) и С-1 (правая панель) с Jagged1 человека (hJag-1), Jagged2 человека (hJag-2), Jagged2 мыши (mJag-2), Delta-подобным лигандом 1 человека (hDLL-1), Delta-подобным лигандом 1 мыши (mDLL-1), или Delta-подобным лигандом 4 человека (hDLL-4). Концентрации антител указаны на оси X, и величина оптической плотности при длине волны 650 нм (OD650) указана на оси Y. (В) Результаты измерения методом ИФА специфичности связывания антител А и В, оба антитела были идентифицированы в ходе дальнейшего скрининга с использованием Jag1-DSL-EGF1-4 человека (ФИГ. 3В) для антитела А и Jag2-DSL-EGF1-4 мыши и человека (ФИГ. 3С и D) для антитела В. Черные столбики = связывание с человеческим Jagged1; серые столбики = связывание с человеческим Jagged2. С-1 использовали в качестве контроля для связывания как с Jagged1, так и Jagged2.

На ФИГ. 11 приведены величины констант связывания антител А, А-1, А-2, В, В-1, В-2, В-3, С, С-1, D, D-1 и D-2 с очищенным лигандом Jagged1 человека (Jag1 человека), Jagged2 человека (Jag2 человека) и Jagged2 мыши (Jag2 мыши).

На ФИГ. 12 показано дозазависимое ингибирование Jagged1-индуцированной передачи сигналов посредством рецептора Notch 1 под действием антител к Jagged. Результаты были получены в экспериментах с использованием смешанной культуры, в которых проводили измерение Jagged1-индуцированной передачи сигналов посредством рецептора Notch 1, как описано в примере 4. На оси Y показаны уровни экспрессии Notch-зависимого гена-репортера люциферазы светлячка относительно экспрессии контрольного гена (конститутивно активный промотор, инициирующий экспрессию гена люциферазы Renilla). На оси X показаны концентрации антител D и С (0,4-50 мкг/мл). Смешанную культуру без антител (J1-индуцированный положительный контроль) использовали в качестве положительного контроля для оценки Jagged1-индуцированной передачи сигналов. Изотипическое контрольное антитело использовали в качестве контроля при оценке специфичного ингибирования под действием антител. Ингибитор гамма-секретазы (соединение Е+) использовали в качестве контроля при оценке ингибирования Notch-зависимой передачи сигналов.

На ФИГ. 13А-В приведены результаты оценки ингибирования Notch-зависимой передачи сигналов под действием антител к Jagged с созревшей аффинностью. Количественные исследования с использованием смешанной культуры проводили, как описано на ФИГ. 12 и в примере 4. (А) Фаговые антитела и их концентрации (мкг/мл) указаны на оси X (исходные антитела С и D использовали в качестве контроля). Ингибиторы гамма-секретазы (GSIs), соединение Е (CmpE) и N-[N-(3,5-дифторфенилацетил)-L-аланил]-8-фенилглицина трет-бутиловый эфир (DAPT), в указанных концентрациях использовали в качестве положительного контроля при оценке ингибирования Notch-зависимой передачи сигналов; ДМСО использовали в качестве контроля носителя для GSIs; нецелевое антитело, изотип которого соответствовал таковому для антител, исследуемых в панели, использовали в качестве антитела для контроля изотипа. (В) Фаговые антитела в указанных концентрациях показаны на оси X. DAPT в указанных концентрациях использовали в качестве положительного контроля при оценке ингибирования Notch-зависимой передачи сигналов; ДМСО использовали в качестве контроля носителя. Процесс передачи сигналов индуцировали Jagged1 (темно-серые колонки) или Jagged2 (светло-серые колонки). Необработанные = культуры, которые не стимулировали лигандом и не обрабатывали антителом; Нестимулированные или 3Т3Р = культуры, которые не стимулировали лигандом; agD или gD = антитело для контроля изотипа; Stim/no АВ или No Ab = культуры, которые стимулировали лигандом, но не обрабатывали антителом; ингибитором гамма-секретазы DAPT или ДМСО, использованным в качестве контроля носителя для DAPT.

На ФИГ. 14А-В показано, что комбинированное ингибирование Jagged1 и Jagged2 вызывает быструю потерю массы тела. (А) Мышам вводили два раза в неделю антитело к Jagged1/2, С-1 (антитело к J1/2; 5-10 мг/кг), антитело к Jagged1-2, антитело А-2 (антитело к J1; 5-20 мг/кг), антитело к Jagged2, антитело В-3 (антитело к J2; 5-20 мг/кг), комбинацию антител А-2 и В-3 (антитело к J1 и J2; каждое по 5 мг/кг) или изотопическое контрольное антитело (20 мг/кг). Общая концентрация антител при каждом дозировании была доведена до 20 мг/кг с использованием изотопического контрольного антитела, в случае необходимости. Среднее изменение массы тела (ось Y) представлено в графической форме в виде процентного изменения исходной массы тела с течением времени (ось X). (В) Мышам линии Balb/c (по десять животных в группе, индивидуально размещенных) вводили внутрибрюшинно (в/б) два раза в неделю 30 мг/кг изотопического контрольного антитела анти-gD или комбинацию 15 мг/кг антитела А-2 плюс 15 мг/кг антитела В-3 в течение восьми дней. Потребление пищи оценивали с помощью ежедневного взвешивания полученной и оставшейся пищи в каждой клетке. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения (n=10).

На ФИГ. 15А-В приведены результаты стандартных гистологических исследований тканей кишечника после лечения антителами к Jagged. (А) Образцы тканей кишечника мышей, получавших антитела, как описано в примере 6, выделяли и окрашивали гематоксилином и эозином (ФИГ. 15А, Н и Е) или альциановым синим (ФИГ. 15А, альциановый синий). (В) Срезы тканей кишечника окрашивали с использованием первичных антител к лизоциму или Ki-67 (ФИГ. 15В).

На ФИГ. 16А-1-В-2 приведены результаты оценки ингибирования роста клеток рака легких человека под действием антитела-антагониста к Jagged1 в условиях in vivo. Мышам с ксенотрансплантатами клеток рака легких человека вводили внутрибрюшинно (в/б) два раза в неделю 20 мг/кг контрольного изотопического антитела, анти-gD (антитело для контроля изотипа), или антитела к Jagged1, антитела А-2 (анти-Jag1), инъекции начинали после того, как средний объем опухолей (измеренный с помощью циркуля) достигал приблизительно 180 мм3. Объемы опухолей (ось Y) затем оценивали в течение 19 дней. ФИГ. 16А-1 и ФИГ. 16А-2: Средние объемы опухолей для каждой группы (n=10) были графически представлены в виде зависимости от времени (ось X) с использованием линейной модели со смешанными эффектами (ФИГ. 16А-1). Объемы опухолей для каждой мыши в каждой группе показаны на двух панелях на ФИГ. 16А-2. ФИГ. 16В-1 и ФИГ. 16В-2: Общую массу тела каждой мыши измеряли и графически представляли в виде процентного изменения, усредненного для каждой группы (ФИГ. 16В-1) или для каждой мыши в каждой группе (ФИГ. 16В-2).

На ФИГ. 17А-В приведены результаты оценки ингибирования роста клеток рака молочной железы человека под действием антител-антагонистов к Jagged1 и Jagged2 в условиях in vivo. Мышам С.В-17 SCID.bg с ксенотрансплантатами клеток рака молочной железы человека вводили изотипическое контрольное антитело анти-gD (анти-gD), изотипическое контрольное антитело, связывающее агглютинин амброзии (антитело к агглютинину амброзии), антитело к Jagged1A-2, содержащее каркас IgG1 человека (анти-Jag1 А-2 (hIgG1)), антитело к Jagged1 А-2, содержащее каркас IgG2a мыши (анти-Jag1 А-2 (mIgG2a)) или антитело к Jagged2 В-3, содержащее каркас IgG1 человека (анти-Jag2 В-3 (hIgG1)) на 0, 4, 7, 12, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 43, 50 и 57 дни. Объемы опухолей (ось Y) в группах, получавших лечение (А), или у отдельных животных (В) графически представляли в виде зависимости от времени (ось X) с использованием линейной модели со смешанными эффектами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Применительно к настоящему изобретению «акцепторный каркас человека» представляет собой каркас, содержащий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученный из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека, определенных ниже. Акцепторный каркас человека, «полученный из» каркаса иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека, может содержать ту же аминокислотную последовательность, или он может содержать аминокислотную последовательность с заменами остатков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество изменений аминокислотных остатков составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее либо 2 или менее. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность акцепторного каркаса VL человека идентична последовательности каркаса VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека.

Термин «аффинность» относится к силе всех нековалентных взаимодействий между отдельным участком связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, в настоящей заявке термин «аффинность связывания» относится к природной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие в соотношении 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y в общем случае может быть описана с помощью константы диссоциации (K_d). Величину аффинности можно измерить с по