Способ определения мальтазной активности ферментов

Способ определения мальтазной активности ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Фр г -,уг

1ii) 572496

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28.03.76 (21) 2337969/13 с присоединением заявки №

Государственный комитет (23) 1-1

3 Приоритет

Совета Министров СССР

fl0 делам изобретеиий Опубликовано 15.09.77. Бюллетень № 34 (51) М. Кл.е С 12D 13/10 (53) УДК 576.8(088.8) и открытий

Дата опубликования описания 20.10.77 (72) Авторы изобретения

В. Л. Яровенко, К. М. Бендецкий и E. С. Павлова (71) Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАЛЬТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

ФЕРМЕНТОВ пнф,н У,оп

Т=1

7 пнф,оп У,н

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам определения мальтазной активности ферментов.

Известны способы определения мальтазной активности ферментов путем приготовления инкубационной смеси, включающей ферментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор, причем в качестве обоих субстратов используется мальтоза (1). Мальтазную активность в этих способах определяют по скорости ферментативного гидролиза мальтозы.

Из известных способов определения мальтазной активности ферментов наиболее близким изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ, предусматривающий приготовление инкубационной смеси, включающей ферментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор — глицерин (2). Однако данный способ является неточным, так как присутствующие в препарате трансглюкозилазы способны образовывать продукты трансглюкозилирования, которые существующий метод не учитывает.

Целью изобретения является повышение точности определения за счет контроля трансглюкозилазной активности, являющейся частью мальтазной. Для достижения поставленной цели в способе, предусматривающем приготовление инкубационной смеси, включающей фсрментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор — глицерин, составляют дополнительную инкубационную смесь без субстрата-акцептора, сравнивают выход

5 глюкозы в обеих смесях и по разности судят о трансглюкозилазной активности.

В качестве субстрата-донора можно использовать паранитрофенилглюкозид или мальтозу.

10 Способ использования паранитрофеннлглюкозпда заключается в следующем.

Состаьляют две инкубационные смеси, одна из которых является опытной и содержит ферментный препарат, 0,5% парапитрофенилглюкозида (ПНФГ), ацетатцый буфер с рН

4,7 и 10% глицерина, другая смесь является контрольной и содержит все те же компоненты, за исключением глицерина.

Степень трансглюкозилпрованпя определяется по формуле

25 где AEпвф, H и ЛЕппф, оп — изменения оптической плотности окрашенных растворов паранитрофепола (ПНФ) — продукта превращения паранитрофенилглюкозпда в контроле и

30 в опыте соответственно.

572496

Степень трансглюкозилирования T опреде ляют графически.

По значениям выхода глюкозы в контроле

Ун находят величину мальтазной активности

5 к

МА =21 0,18 b

ЛЕ, „, и ЛЕт- „— изменение оптической плотности проб с глюкозооксидазным реактивом в контроле и в опыте.

Мальтазная активность (МА), приходящаяся на единицу препарата, вычисляется по формуле

МА=

0,18 t.b где У,» — прирост глюкозы в контроле за время инкубации, определяемый при помощи калибровочного графика;

2 — коэффициент;

/†время инкубации;

b — концентрация фермента в инкубационной смеси, г/мл, 0,18 — коэффициент перевода из мг в мкмоль. где Ун — выход глюкозы в мг на 1 мл контрольной инкубационной смеси;

1 — время инкубации;

Ь вЂ” концентрация фер мента, г/мл.

Способ использования мальтозы заключается в следующем.

Составляют две инкубационные смеси, одна из которых является опытной и содержит ферментный препарат, 0,05% мальтозы, 0,1 н. ацетатный буфер рН 4,7 и 10% глицерина. Другая смесь является контрольной и содержит те же компоненты, за исключением глицерина.

1О

Ацетатньш буфер

1и.рН 4,7

Раствор препарата фермента

Вода Итого

Глицерин

ПНФГ 0,25%

Контроль

Опыт 2

10

0,2 мл 5%-ной соды, Оптическую плотность окраски измеряли на ФЭКМ при синем све25 тофильтре при длине волны 400 — 450 нм.

Выход глюкозы определяли с глюкозооксидазным реактивом по модифицированному методу Далквиста. На анализ брали по

0,5 мл инкубационной смеси. В результате

30 получили данные, приведенные в табл. 1.

Значения степени трансглюкозилирования Т вычислили по формуле

Т=1

ДЕпнф к ДЕу оп

1 3

ДЕпнф,оп ДЕу,к где ЛЕнф,н и ЛЕпнф,,п — прирост экстинций

ПНФ за время инкубации в контроле и в опыте соответственно, ЛЕ, пп и AEy, — прирост экстинций проб с глюкозооксидазным

40 реактивом за время инкубации t в опыте и в контроле соответственно, Например, для (=30 мин

Т=1 0,117 — 0,054 0,080 — 0,031 0 24

0,092 — 0,052 0,141 — 0,040

Использовали препарат, полученный из глубинной культуры гриба Endomycopsis

species 20-9. Порошок растворяли в дистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл.

Инкубацию вели в ультратермостате при

30 C.

После указанных в табл. 1 сроков инкубации отбирали из инкубационной смеси пробы около 3 мл и нагревали в кипящей водяной бане 5 мин. В табл. 1 приведены оптические плотности, соответствующие выходу паранитрофенола и глюкозы в системе ПНФà — глицерин под действием ферментов.

Таблица 1

Контроль

Опыт

Срок пнкубации, мин пнф,к у к пн4>,on

y,on

0,054

0,117

0,150

60

0,040

0,141

0,225

0,052

0,092

0,120

0,031

0,080

0,128

0,24

0,26

Пример 2, Система; 0,05% мальтозы—

10% глицерина.

Составляли инкубационные смеси из следующих компонентов (мл) .

Для определения оптических плотностей свободного паранитрофенола к 0,5 мл пробы приливали 3,3 мл дистиллированной воды и

Ацетатный буфер

1н. рН 4,7

1,0

Раствор препарата

Л1альтоза 1%

Контроль 0,5

Опыт 0,5

Итого

Вода

Глицерин

8,1

0,4

1,0

0,4

1,0

7,1

Пример 1. Система: 0 05% паранитрофе20 нилглюкозида (ПНФГ) — 10% глицерина.

Составляли инкубационные смеси из следующих компонентов (мл).

57249G

Таблица 2

Взято на анализ мл пробы

Срок инкубации мин

1—

Еоп

Е„

Контроль Е„

Опыт Еоп

0,017

0,114

0,196

0,1

0,1

0,1

0,010

0,043

0,078

60

0,66

0,62

0,34

0,28

Формула изобретения

Составитель Т. Серебренникова

Корректор Л. Денискина

Техред Е. Семенов

Редактор Е. Хорина

Подписное

Заказ 2221/15 Изд. № 763 Тираж 563

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Инкубацию вели в ультратермостате при

30 С. После указанных в табл. 2 сроков инкубации отбирали из инкубационной смеси

В пробах определяли выход глюкозы (оптическую плотность) с глюкозооксидазным реактивом, Полученные данные представлены в табл. 2. Значения степени трансглюкозилирования (Т) определяют графически.

Значения, полученные в системах ПНФГ— глицерин и мальтоза — глицерин, близки.

Мальтазную активность рассчитывали по формуле

МА= =21 10 змг мл — мин —

0,13

30 2

В международных единицах

МА — 290 ед/г, 0,18 10 з.0,4

0,4 10 — з где концентрация препарата, г/мл

10 инкубационной смеси.

Способ прост, быстро дает надежную характеристику препаратов. Использование предлагаемой характеристики мальтазной активности с указанием степени трансглюкозилирования дает возможность правильно оценивать эффективность и направление амилолититнческого препарата на различных этапах превращения крахмалистого сырья. пробы около 2 мл и нагревали в кипящей бане 5 мин.

1. Способ определения мальтазной активности ферментов, предусматривающий приготовление инкубационной смеси, включающей ферментный препарат, субстрат-донор и суб10 страт-акцептор — глицерин, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности определения за счет контроля трансглюкозилазной активности, являющейся частью мальтазной, составляют дополнительную инкуба15 ционную смесь без субстрата-акцептора, сравнивают выход глюкозы в обеих смесях и по разности судят о трансглюкозилазной активностити.

2. Способ по и. 1, отл и ч а ю щи и ся тем, 20 что в качестве субстрата-донора используют паранитрофенилглюкозид.

3. Способ по п, 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата-донора используют мальтозу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бендецкий К. М., Яровенко В. Л., Сенаторова Т. П. Биохимия, 1975, т. 40, с. 1135.

30 2. Sugawara S, Gournal Faculty of Acticulture Hokkeido University 52, 257, 1962.