Способ культивирования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (») 611597 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 25.10.67 (21) 1192686/28 — 13 (23) Приоритет — (32) 31.10.66 (31) 71347/66 (33) Япония (43) Опубликовано 15.06.78. Бюллетень № 22 (45) Дата опубликования описания 19.05.78 (51) M. 1<л.

С 12 К 1/00

Госудврственнмй иомитет

Соввтв Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК

576.8.093.1 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Харукн Огана, Сигео Сузуки, Микио Савада и Акихиро Ямамото (Япония) Иностранная фирма

"Чугаи Сейяку Кабусики Канша и Кийова Хакко Когио Ко., Дтд" (Япония), (71) Заявитель (543 СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

STREPTOCOCCUS HEMOLYTiCUS

Изобретение относится к микробиологии и касается получения клеток гемолитического стрептококка с высокой противоопухолевой активностью.

Известен способ культивирования Streptococcus hemoiyticus на питательной среде, содержа- 5 щей экстракт бычьего сердца, пелтон, хлористый натрий, нукленнат натрия, фосфат натрия, бикарбонат натрия, ацид натрия, хлористый литий рибофлавин, уксуснокнслый таллий, дефибрннированную кровь и мальтозу с последующим отделением кле- 1О ток от среды 11) . Однако известный способ не обеспечивает высокой противоопухолевой активности культуры.

Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности культуры. 15

Эта цель достигается тем, что штамм Streptococcus hemolyticus АТСС 21060 выращивают на среде, содержащей 3,0 — 6,0% дромокевого экстракта, при рН 7,0 — 7,4.

Среду, которую используют для выращивания 20 культуры, получают путем растворения, например экстракта дромоней нли автолизата дрожжей в воде, нагревания раствора после нейтрализации и последующей фильтрации для отделения нерастворимой фракции, рН среды 7,0 — 7,4, концентрация дрожже- 25 вого экстракта 3,0 — 6 O o. Могут быль использованы также пептоны. или экстракты (рыбные или мясные из говядины, конского или китового мяса)

В качестве неорганических солей можно использовать, например хлористый натрий, первичный фосфат натрия или бнкарбонат натрия. Хорошие результаты получают при добавке рибонуклеиновой кислоты или рибонуклеазы. Посев бактерий производят путем добавки к среде бактериалыых клеток, подвергнутых предварительному выращиванию при температуре 30 — 40 С, преимущественно при 37 С.

В качестве среды для предварительного выращивания используют дрожжевой экстракт. В том случае, когда для получения культуры используют дрожжевой экстракт, противоопухолевая активность бактериальных клеток, которая увеличивается во время выращивания, несколько снижается по мере удлинения этого времени. Если для предварительного выращивания используют мясную воду, то допустимое время для выращивания бактерий увеличивается, лучше использовать для этого температуру 37 С и время 12 — 30 ч.

Можно использовать и другие среды, например состоящие из мясного экстракта, пептона и хлористого натрия. После завершения выращивания

Составитель С. Малютина

Техред М. Лев ицкая Корректор С. Шекьвр редактор Н. Потапова

Заказ 2943/49

Тираж 568 Подписное цИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР пе делам изобретений и открытиИ

113035, Москва, )К вЂ” 35, РауШская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент",, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 культуры бульон охлаждают и бактериальные клетки вьщеляют путем центрифугирова)ия.

Полученные клетки гемолитического стрептококка применяют для общего лечеш1я после уничтожения вирулентности этих клеток и способности их продуцировать гемолизин путем дробной термообработки при 30 — 38 С в течение 10 — 30 мин и затем при 40 45 Ñ в течение 20 — 40 мин и любой подходящей среде с содержанием, налример пеници)шина или основной среды Бернгеймера, состоящей) 0 из 6 мл раствора с содержанием 67,5 мг мальтозы и 20 o-ного водного раствора монокалийфосфата устанавливают рН 6,9 — 7,0 едким натром, 12 мп

2 o-ного водного раствора семиводного сернокислого магния и бб мл дистиллированной воды. 15

Пример 1. Приготовление среды иэ мясной воды.

50 г говядины, тщательно освобожденные от жира и сухожилий, измельчают и интенсивно встряхивают после добавки 100 мл дистиллированной 20 воды. Затем смесь оставляют на ночь в холодильнике, на следующие сутки ее нагревают при 100 С в течение 1,5 ч. Для получения необходимой среды ее фильтруют после охлаждения, к 100 мл этой среды добавляют 1 г пептона и 0 5 r хлористого натрия, кипятят 30 мин при 100 С и регулируют рН путем повторного нагревания при 100 С в течение 30 мин, при необходимости регулируют рН.

После этого фильтруют смесь через фильтровальную бумагу, наливают в несколько пробирок по 10 мп З0 в каждую и стерилизуют паром под давлением

1 кг/см в течение 10 мин.

Пример 2. Приготовление среды из дрожжевого экстракта. 9 г дрожжевого экстракта растворяют в 200 мл дистиллированной воды, уста- 35 навливают рН 7 0 — 7,2 10%-ным водным раствором едкого натра и нагревают 60 мин при 100 С. Выпавший осадок отфильтровывают и вновь регулируют рН фильтрата 10%-ным раствором едкого натра с последующим нагреванием при 100 C в течение 40

30 мин и фильтрацией. К полученному фильтрату добавляют воду до конечного объема 300 мл, разливают по колбам и стерилизуют паром под давлением 1 кг смг

Далее йсходят из запасной культуры гемолит 45 ческого стрептококка (штамм. St. АТСС 21060) в мясной воде, которой инокулируют 10 мл мясной воды и выращивают в течение 24 ч при 37 С. Предкультуральный бульон используют для инокуляции

300 мл выше указанной среды и выращивают ее в течение 20 ч при 37 С. Клетки гемолитического стрептококка с высокой противоопухолевой активностью получают путем последующего охлаждения культурального бульона льдом, центрифугирования и двухкратной промывки бактериальных клеток физиологическим раствором.

Запасную культуру гемолитического стрептококка (штамм St. АТСС 21060) используют для инокулирования 10 мл дрожжевого экстракта аналогично примеру 1. После этого выращивают бактериальную культуру в течение 24 ч при 37 С. Этот предкультуральный бульон служит для инокулирования 300 мл дрожжевого экстракта, который выращивают беэ перемешивания в течение 14 ч при

37 С. Бульон охлаждают затем льдом и центрифугируют. Путем промывки полученных бактериальных клеток физиологическим раствором получают клетки с высокой противоопухолевой активностью.

Пример 3. Готовят 300 мл культуральной среды из 15 мл дрожжевого экстракта и 10 мл предварительной культуральной среды. Для этой цели используют 0,5 r экстракта по примеру 1. При предварительном и последующем выращивании с применением запасной культуры (штамма Su.

АТСС 21060) в мясной воде с последующей обработкой культурального бульона получают бактериаль. ные клетки с высокой противоопухолевой активностью.

Испытания на противоопухолевую активность показали, что полученная культура обладает высокой противоопухолевой активностью на единит1у веса гемолитического стрептококка.

Формула изобретения

Способ культивирования Streptococcus hemolyticus us среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения .прожвоопухолевой активности культуры, штамм Streptococcus

hemolytlcus АТСС 21060 выращивают на среде, содержащей 3,0 — 6 0% дрожжевого экстракта, при рН 7,07,4.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: *

1. Многотомное руководство по микробиоло. гии т.1, 1962, с.312-321.