Способ получения ингибитора фосфолипазы с

Способ получения ингибитора фосфолипазы с

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик о>734260 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 170278 (21) 2581145/28-13 (5t)hA. Кл. с присоединением заявки ¹

С 12 D 13/00 (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 150580 Бюллетень № 18

Дата опубликования описания 150580 (5Ý) УДК 577. 15 (088. 8) И.М.Терешин,M.Ñ.Ïoëÿê,Å.Ï.ßêîíëåâà,Т.И.Рожанская, Н,Г.Васильева,Л.Г.Мясникова,А.Г.Рыбошлыков,A.À.Ñåëåçíåâà, Ж.Д,Мазунина,Л.Г.Масленникова и И.М.Рабинович (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ФОСФОЛИПАЭЫ

С CL05TRIDIUM PERFRINGENS

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в медицине.

Известен способ получения ингибнтора фосфолипазы С C)ostridium perfrirr

gens из крови иммунизированных лошадей (1) .

Однако известный способ не обеспечивает высокой детоксицирующей активности целевого продукта, так как антитоксические сыворотки для профилактики не используют, а эффективность серотерапии недостаточна, Целью изобретения является повышение детоксицирующей активности целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что штамм 5сгерсочегс1с1111um mycoheptinicum 255 выращивают на питатель- 2р ной среде, содержащей источники углерода, азота и минимальные соли, нативный раствор оснобождают от примесей последовательным пропусканием через анионит ФАФ в хлоридной форме, 25 подкислением до рН 5,3-5,5, riporpe-. ванием при 50-55ОС, обработкой сульфатом аммония до 55-60% насыщения, отстаиванием при 4-10 С в течение

18-20 ч, центрифугиронанием ультра- m3p диафильтрацией супернатанта, затем лиофильно высушивают и очищают от протеаз.

Способ осуществляют следующим образом.

Производят обработку натинного растнора Stv. mycoheptinicum †2 анионитом ФАФ (коэффициент набухания 4,2) в хлоридной форме н динамических условиях с целью частичного освобождения от балластных белков, пигмента и антибиотика микогептина. После этого подкисляют полученный раствор до рН=5,5-5,3, прогревают в течение 30 мин при 50

55 С с целью частичной кислотной и тепловой денатурации ряда балластных белков, в том числе протеаз.

Высаливают ряд балластных белкон, в том числе протеаз сульфатом аммония (55-60% насыщения). Осадок формируется при 4-10 С в течение 18-20 ч, затем его центрифугируют.

Осуществляют ультра- и диафильтрацию супернатента через ацетилцеллюлозную мембрану УАМ-150 М с диаметром пор не более 150 А и удельной скоростью фильтрации пэ воде не

-г г ! более 2.10 мл/мин.см атм — полностью

734260 йроницаемую для минеральных солей (в частности, сульфата аммония), в значительной степени проницаемую для пигмента и задерживающую ингибитор на 90-80%. Лиофильно высушивают деминерализованный концентрат, полученный в результате ультра- и диафильтрации.

Таким образом, получают препарат ингибитора полностью очищенный от

«нтибиотика микогептина, минеральных солей, ряда балластных белков и пигмента. Препарат содержит ингибитор фосфолипазы С с примесью протеаэы.

С целью полной очистки ингнбитора далее проводят либо гель-хроматографию препарата на сефадексе

6-50 fine, используя в качестве элюента 0,0005 M фосфатный буфер (рН 7,0), либо,изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности.

Полученные в результате гельхроматографии фракции, характеризующиеся ингибирующим действием на фосфолнпазу С, не содержащие пРотеаэу, лиофильно высушивают.

Аналогичные фракции, полученные в результате иэоэлектрического Фокусирования, перед лиофилизацией освобождают от амфолина и сахарозы ультрафильтрацией через ацетилцеллюлоэную мембрану УАМ-150 и с диаметром пор 120 А.

Полученный высокоочишенный ингибитор фосфолипаэы С прн содержании

0 65 мг белка/мл характеризуется е

60% ингибиции 0,,16 мг белка/мл — 26% ингибиции.

Выделенный ингибитор Фосфолипаэы С является. веществом белковой природы, гомогенный при диск-электроФорезе в полиакриламидном геле при рНе8,3. Молекулярная масса ингибитора определенная методом гель-хроматографии, составляет 3500-4000. При иэоэлектрическом,фокусировании в градиенте плотности ингибитор разделяется на 2 иэоформы с изоэлектрическими точками 8,50 и S, 15. i

Нативный раствор пропускают со скоростью 90-100 мл/ч ° см череэ коАФ лонку, загруженную 6 r анионита ФА в хлоридной форме с коэффициентом набухания 4,2. Анионит в значительной степени сорбирует антибиотик микогептин, пигменты, частично балластные белки; в том числе протеаэу, Полученный раствор подкисляют до рН 5,5, прогревают 30 мин при 55 С, быстро охлаждают до комнатной температуры. Затем проводят высаливание балластных белков, в том числе

55%

-4Q протеаэ сульфатом аммония до 55 насыщения (351 r на 1 л). После формированйя сУсадка на холоду в течение

18 ч осадок отделяют центрнфугироэанием и отбрасывают. Полученный ф5 рупернатант помешают в ультрафильтраультрафиолетовый спектр ингибитора я вляется характерным для белков, 0 максимум поглощения 278-28

Таким образом, выделенный ингибитор фосфолипазы С является основным полипептидом с мол. массой 3

3500-4000.

Активность йнгибитора фосфолипаз ы определяют по угнетанию специ фического гидролиэа фосфатидилхо илхолина (лецитина) в лецитевителлине методом диффузии в агар и серийном разведеВ первом случае учитывают вели) so вто чину эоны приципктации (6 мм), ром титр. Обсчет эффекта ведут по сравнению результатов в контроле к

Опыте по формуле - - 100, где Aвффект s контроле, В - эффект в опыте.

Показано, что выделенные образцы обладают ингибиторной активностью в отношении Фосфолипазы С- CI perfrinчепэ типа А.ЗД осоставляла (по белку) 0,55 мг/мл, л Д„о - 1,1-1,15мг/мл.

Связывание в выбранной системе (вода, иэотонический раствор, хлорида натрия, 0,005 М фосфатный буфер) было необратимым. Белки сыворотки крови на активность ингибитора не влияли.

Токсичность лиофильно высушенного ингибитора„ не содержащего биологически активные примеси, излучали в опытах на салицах белых мышей породы SHR весом 18 r. Препарат вводили однократно, внутрибрюшинно и (5 внутривенно (в хвостовую вену мышей) в иэотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,5 мл. Наблюдение за животными вели в течение 10 сут. Учи тывали выживаемость, активность и вес животных. Использованы следуяшие дозы ингибитора по белку l, l мг/ ьшь и 0,55 мг/мышь, что соответствовало 100 и 50%-ным ингибиторным концентрациям, Sa срок наблюдения группы животных, получавших однократно ингибитор внутривенно и внутрибрюшинно, были живы, активны и не теряли в весе (вес контрольной группы через

10 сут. 19 1,1 г, опытных соответственно 18,8+0,8 и 19,311,0 r. При контрольном вскрытии опытных мышей, забитых на 11 сут. после введения ингибитора, макроскопических изменений не выявлено.

Пример 1, В качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл соево-кукурузной среды, вносят 5 мл посевной культуры, выращенной в geчение 2 сут. при 28 С на среде, г/л соевая мука 20, глюкоза 20, хлорис40 тый натрий 1. Культивирование проводят в течение 5 сут. По окончании процесса ферментации культуральную жидкость сливают, центрифугируют при

3000 об/мин в течение 30 мин. Получают 300 мл нативного раствора, в котором содержался ингибитор.

734260

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Потапова Техред Я.Бирчак Корректор Г.Решетник

Заказ 2007/35 Тираж 522 Подписное (1НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал tltltl Патент, г. ужГород, ул. Проектная, 4 ционный аппарат периодического действия с перемещением. В качестве ультрафильтра используют селективно подобранную мембрану УАМ-150 М, характеризующуюся диаметром пор не выше 150 A,óäåëüíoé скоростью фильтраций по воде не выше 2,0 10 мл/мин

% см атм. Мембрана полностью проницаема для минеральных солей, в значительной степени для пигмента и задерживает ингибитор на 80-90%. Концентрирование проводят при давлении 2,5

3,0 атм. Затем проводят в этом же аппарате 3 диафильтрации при давлении 2,5-3,0 ати до полного обессоливания с последующим концентрированием, Концентрат лиофильно вы- 15 сушивают, затем растворяют в 2 мл фосфатного буфера и наносят на колонну, заполненную сефадексом G-50fins (1,0 х 60 cM) уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (pH 7,0). Злюцию 20 проводят этим же буфером со скоростью

12 мл/ч. Фракции, характеризующиеся ингибирующим действием на фосфолипаэу С, не содержащие протеаэу и другие балластные вещества, лиофильно высушивают, из 300 мл нативного раствора выделяется 29 мг высокоочищенного ингибитора.

Пример 2 ° 300 мл нативного раствора получают и обрабатывают также, как описано в примере 1 (обработка

ФАФ, подкисление, прогрев, высаливанне, ультра- и диафльтрация супернатанта, лиофильное высушивание). Далее проводят изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности лиофильно высушенного препарата. Фракции, обладающие ингибирующим действием на фосфалипазу С, не содержащие протеаэу, освобождают-от амфолинов и сахарозы диафильтрацией через ацетилцеллозную мембрану YAM-150 M и лиофильно высушивают. Иэ 300 мл нативного раствора выделяется 40 мг высокоочищенного ингибитора.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую детоксицирующую активность целевого продукта, что позволит снизить количество случаев тяжелых осложнений при травмах н ранениях.

Способ получения ингибитора фос-. фолипаэы С С1овтгЫ1ищ per fringens, отличающийся тем, что, с целью повышения детоксицирующей активности целевого продукта, штамм

ЯСгер очегМс IIium mycoheptinicum255 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли нативный раствор освобождают от примесей последовательным;пропусканием через анионит ФАФ в хлоридной форме, подкислением до рН 5,3-5,5, прогреванием при 50-55 С, обработкой сульфатом аммония до 55-60 Ъ насыщения, отстаиванием при 4-10еС в течение 18-20 ч, центрифугированием ультра- и диафильтрацией супернатанта, затем лиофильно высушивают и очищают от протеаэ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов.

М., Медицина, 1975, с. 95-96.