Питательная среда для культивирования продуцентов липолитических ферментов

Питательная среда для культивирования продуцентов липолитических ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскщ

Социалистических

Республик

<)>745945

-- )) Юс;,:рф) (61) Дополнительное к авт. свид-ву (я>м. к . (22) Заявлено 05.1277 (21) 2550008/28-l 3 с присоединением заявки ¹

С 12 К 1/06

Государственный комитет

СССР

f)0 делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 07.0780 Бюллетень Мо 25 (53) УДК 663. 14. 3 (088 ° 8) Дата опубликования описания 07.0780

Ю.Я. Свириденко, М.С. Умансккй, Е..С. Кузнецов

) Г.А, Казаков и Л.Б. Лобьтрева

/ (72) Авторы изобретения

Всесоюэный научно-йсследовател)ьский институт маслодельной и сыродельной промышленности

Научно-производственного объединения "Углич" (71) Заявитель.. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ:КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Таблица 1

ПАН

8,90

9,2

8,80

7,1

7,45

6,1

5,6

6,95

6,50

4,9

Изобретение относится к молочной промышленности и представляет собой состав питательной среды; используемой для глубинйого культиви- рования микроорганизмов-продуцентов липолитических ферментов.

Известна питательная среда для. культивирования продуцентов липолитических ферментов, вйлючающая соевую муку, сахарозу, двухэамещенный фосфорнокислый магний, мел, оливковое масло:и воду (1) .

К недостаткам известной питатель.ной среды относится то, что она не является оптймальной как по качественному, так и по количественному составу.

Известна также среда для культивирования плесени G.candidum (среда "A") следующего состава, %: соевая мука 2,0; мочевина 0,2; сахароза 0,2; К НРО4 0,1; КН РО.) ° ЗН О

0,4; М9504, 0,1; СаСО> 0,5; оливковое.масло 0 5.Однако ее исходный рН равен 9,2, в то время как опти.мальный — 7, 0 (21 .

Доведение кислотности среды цо 7,0 сопряжено со значительными грудностями, так как буферноЧть среды очень низка, что приводит к эначительному изменению величины рН после стерилизации (табл.1).

Целью изобретения является повышение выхода фермента и унификации качественного состава среды.

Поставленная цель достигается тем, что в нее дополнительно вводят сульфат аммония при следующем соотношении компонентов,вес.%:

Соевая мука 2,55-5,2

Сахароза 0,03-0,28

745945

Роза 0,13;мел 0,52; К НРО4 0,2; MgSO4 01; 0 5 вода — остальное .

При использовании указанной среды активность культуральной жидкости

Geotrichum candidum Link BKMF-2017 повышается в 1,5 раза.

Пример 1. Среда (100 мл) готовится на водопроводной воде и имеет следующий состав,%: соевая

f0 мука 2,6; (NH4)2 S04 1,38; сахароза

0 13; мел 0 52; К НР04 0 2; MgSO<0 1; оливковое масло 0,1; вода — остальное. Кислотность среды перед стерилизацией доводится до 7,1-7,3. Стери-.

15 лизация при 1 атм в течение 15 мин

Среда инокулируется суспензией, полученной смывом биомассы 3-4-х суточной культуры гриба с поверхности сусло-агара 10 мл стерильной

2» воды из расчета 4 мл суспензии на 100 мл среды. Культивирование проводится при 26-28 С на круговых качалках со 170-190 об/мин в колбах на 1 л. Продолжительность культивирования 80-90 ч. Активность экзолипазы гриба к этому времени достигает 1000-1050 ммолей олеиновой кислбгы йа 1 мл отцентрифугированной культуральной жидкости (субстрат — 40%-ная эмульсия оливково30 го масла в водном 2%-ном растворе поливинилового спирта; буфер фосфатный, 1,15 N, pH 5,5; продолжительность реакции 1 ч при 37 С).

Для культур КЫ zopus nigricans

35 Ehrenb BKNF-2018 и Penici80ium

roqueforti Thorn BKMF-2019 указана питательная среда следующего состава (среда "В"),Ъ: соевая мука

2,5; дрожжевой экстракт 0,5; 40 (НН4)» S04 0<1< К»НРО4 0 5 °

Сднако проверка показала, что среда "Б" обеспечивает биосинтез липаз обеими культурами с более высокой удельной активностью, чем

45 среда "В" (табл.3).

5,90

5, 85

6,06

6,13

6,10

6,32

6,46

6,46

7,05

6,87

Таблица 3

7,10

Удельная активность липаз, полученных. на различных сре50 ах (мл 0,05 н. КОН) мг белка

7,03

Далее осуществлялась оптимизация среды "Б" С по»М»ощ» ью методов""планирования экспериментов применительно к G..candidum. Оптимизация проводиласЬ по 4-м компонентам среды, в наибольщей степени влиявшим на биосинтез фермента (соевая мука, сульфат ассония, сахароза,мел) .Остальные вещества сре -ды йрисутствовали в неизменных коли" -чествах.

В результате установлено, что 40 оптимальной для биосинтеза экзоли-,,. пазы культурой Geotrichum candidum

Link BKMF-2017 является питательная среда следующего состава,%: соевая мука 2,6; (НН4)» S04 1,32; са."а- 65

Rh.n1gr1cans

1,90

Р. roquefort1

1,35

1,70

Двухзамещенный фосфорнокислый калий 0,18-0,20

Сернокислый магний 0,08-0,10

Мел .. 0,19-0,72

Оливковое масло 0 5-0,7

Сульфат аммония 0,05-3 38

Вода Остальное

Предложенная питательная среда получается следующим образом.

С целью повышения исходной кислотности среды для Geotrichum cand!dum мочевина, придававшая щелочную реакцию, заменена на эквивалентное по содержанию дзота количество ! сульфата аммония. Это обеспечивает с одной стороны, более стабильное поддержание рН до и пбсле "стерили-" зации (табл.2), с другой — позволяет несколько упростить состав среды за счет удаления кислой фосфорно" кислой соли (КН»РО). Кроме того, такое изменение состава среды не отразилось на уровне биосинтеза экзофермента. Модифицированная таким образом среда (среда ."Б") имеет следующий состав,%: соевая мука 2,555,2, (Nk4)» SOy 0,44, К НРО4 0,2, сахароза 0,2, MgS04 0,1, СаСО 0,5, оливковое масло 0,5.

Таблица 2

Кислотность среды "Б" » »» =»

П р и м е ч а н и e,Активность ферментов определяют по гидролизу эмульсии молочного жира при рН 5,5.

745945

ЦНИИПИ Заказ 4076/10 Тираж 522 Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Поэтому для культур Rh. пi аri cans и P. roque for t i также оптимизировалась среда "Б" .

Оптимизация проводилась с использованием методов планирования экспериментов по тем же компонентам питательной среды, что и для G. cand i dum BKMF-2017.

Установлено, что оптимальной для биосинтеза экзолипазы культурой

Rhizopus nigricans Ehrenb BKMF-2019 является питательная среда следую= щего состава,%: соевая мука 5,2; (НН4) S04 3,38; сахароза 0,28; мел

0,21;К НРО4 0,2; HgS04 0,1, оливковое масло 0,5; вода — остальное.

При использовании указанной среды липолитическая активность культу- ральной жидкости Rh. nigricans

Ehrenb BKMF-2018 повышается в 2 раза. Пример 2. Среда (100 мл) готовится на водопроводной воде и имеет следующий состав,%: соевая мука 5,2; (NH4)< S04 3,38; сахароза

0,28; мел 0,21; К .НРО4 0,2; HgS04

0,1 ; оливковое масло 0,5; вода— остальное. Кислотность среды перед стерилизацией доводится до 7,0 . Стерилизация при 1 атм в течение

15 мин. Среда инокулируется суспензией, полученной смывом биомассы 30

2-х суточной культуры гриба с поверхности сусло-агара 10 мл стерильной воды из расчета 4 мл на 100 мл среды. Культивирование проводится при 26-28 С на круговых качалках 35 со 170-190 об/мин в колбах на 1 л.

Продолжительность культивирования 22-26 ч. Активность экзолипазы гриба к этому времени достигает

250-300 ммолей олеиновой кислоты íà 40

1 мл отцентрифугированной культуральной жидкости (субстрат — 40%-ная эмульсия оливкового масла в водном ,2%-ном растворе поливинилового спирта, буфер фосфатный, 1/15 М, рН 5 5; 45 продолжительность реакциии 1 ч при 37 С) .

Оптимальной для биосинтеза экзолипазы культурой PeniciIIium roqueforti .BKMF-2019 является питательная среда следующего состава,В: соевая мука

2,7; (NH4)z S04 0,055; сахароза 0,05; мел 1,72; К НРО4 0,2; М9504 0,1; оливковое масло 0,5; вода — остальное. При использовании указанной среды липолитическая активность культуральной жидкости Penici88ium

roqueforti Thorn,, BKMF-2019 повышается в 1,7 раза.

Пример 3. Среда (100 мл) готовится яа водопроводной воде и имеет следующий состав,Ъ: соевая мука 2.,7; (NH4)

MgS04 0,1; оливковое масло 0,5; вода — остальное. Кислбтность среды перед стерилизацией доводится до

5,0. Стерилизация при 1 атм в течение 15 мин. Среда инокулируется суспензией, полученной смывом биомассы 8-10 суточной культуры гриба с поверхности сусло-агара 10 мл стерильной воды из расчета 4 мл на

100 мл среды.

Культивирование проводится при

26-28 на круговых качалках со о

170-190 об/мин в колбах на 1 л. Продолжительность культивирования

40-50 ч. AKTHBHocTb экзолипаэы к этому времени достигает 900-950 ммолей олеиновой кислоты за 1 мп отцентрифугированной культуральной жидкости (субстрат — 40%-ная эмульсия оливкового масла в водном 2%-ном растворе поливинилового спирта, буФер фосфатный, 1/15 М, рН 5,5, продолжительность реакции 1 ч при

37 ).

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования продуцентов липолитических ферментов, включающая соевую муку, сахарозу, двухзамещенный фосфорнокислый калий, сернокнслый магний, мел, оливковое масЛб И воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения выхода фермента и унификации качественного состава среды, в нее дополнительно вводят сульфат аммония при следующем соотношении компонентов, вес.Ъ|

Соевая мука 2,55-5,2

Сахароза 0,03-0,28

Двухзамещенный фосфорнокислый к алий 0,18-0,20

Сернокислый магний 0,08-0,10

Мел 0,19-0,72

Оливковое масло 0,5-0,7

Сульфат аммония 0,05-3,38

Вода Остальное

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Коновалов С.A. Биосинтез Ферментов микроорганизмами М., Пищепром, 1972, с. 245-267.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке 9 2431504/13,кл.С 12 К 1/06, 1977 (прототип).