Состав для элюирования липидов,разде-ленных тонкослойной хроматографией

Состав для элюирования липидов,разде-ленных тонкослойной хроматографией

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

)1 1) SI 8602

Со)оа Советских

Социалистических

Респу6лик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 13.07.78 (21) 2644736/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.04.81. Бюллетень № 13 (45) Дата опубликования описания 07.04.81 (51) М. Кл.

А 61 В 10/00

G 01 N 31/08

Государственный комитет

sa делам изобретений и открытий (53) УДК 543.544 (088.8) с

".. ; - ".ОИРУ;,й

А. В. Богатский, Ю. Л. Жеребин и А. А. Колесник

ПАTE:: 1,ффизико-химический институт Ан украинской ммзи урчи, ейскай 1 (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СОСТАВ ДЛЯ ЭЛЮИРОВАНИЯ ЛИПИДОВ, РАЗДЕЛЕННЫХ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Изобретение относится к анализу веществ с использованием тонкослойной хроматографии, а именно к составам, применяемым для элюирования липидов, разделенных тонкослой ной хроматографией 5 (ТСХ) .

Из описанных в литературе составов для элюирования липидов с пластин для ТСХ по составу ингредиентов и по свойствам наиболее близок к предлагаемому составу )о кислотный растворитель Блайя — Дайера, имеющий состав хлороформ — метанол

0,2 НС1= 1; 2: 0,8 (11.

Недостатком этого состава является то, )5 что после элюирования липидов необходимо проводить нейтрализацию небольшим избытком раствора аммиака во избежание кислотного гидролиза и расщепления анализируемых липидов. Использование этого 2)) состава, даже с проведением последующей нейтрализации, не гарантирует сохранности липидов в неизменном виде.

Кроме того, существенным недостатком кислотного растворителя Блайя-Дайера является и то, что он полностью способен элюировать лишь полярные липиды.

Цель изобретения — создание состава, позволяющего одновременное полное элюирование всех основных классов липидов и 3)) сохранение их нативности.

Указанная цель достигается тем, что известный состав, содержащий хлороформ, метанол и кислоту, дополнительно содержит гептан, а в качестве кислоты — ледяную уксусную кислоту при следующем соотношении ингредиентов, 4.:

Хлороформ 20 — 25

Метанол 10 — 15

Гептан 10 — 15

Ледяная уксусная кислота 1 — 1,2

Указанная смесь растворителей позволяет практически полностью (не менее

99%) элюировать все основные классы липидов с пластин для тонкослойной хроматографии, приготовленных на основе силикагеля, в которых в качестве связующего агента используются гипс или крахмал, а для детектирования пятен липидов может быть добавлен люминесцентный индикатор.

Настоящий состав элюанта не вызывает каких-либо деструктивных изменений в элюируемых липидах, что подтверждается анализом этих липидов методом тонкослойной хроматографии.

На фиг. 1 и 2 представлены соответственно хроматограмма липидов, предварительно элюированных с адсорбента данным составом, и хроматограмма липидов, предварительно элюированных кислотным растворителем Блайя-Дайера (прототип).

818602

I — холестериловый эфир олеиновой кислоты, предварительно элюированный настоящим составом;

П вЂ” химически чистый холестериловый эфир олеиновой кислоты (свидетель);

Ш вЂ” триолеин, предварительно элюированный настоящим составом;

IV — химически чистый триолеин (свидетель);

I — холестериловый эфир олеиновой кислоты, предварительно элюированный кислотным растворителем Блайя-Дайера, Ш вЂ” триолеин, предварительно элюированный кислотным растворителем БлайяДайера. аа — линия старта, на старт в точки I, IIÄ Ш, IV, Г и III нанесено одинаковое количество соответствующих липидов, Разгонка липидов проводилась на пластине, содержащей люминесцентный индикатор, в малополярной системе растворителей: гептан-метилэтилкетон-ледяная уксусная кислота=42,5: 7,5: 0,5 (по объему).

Локализация пятен проводилась в УФсвете.

Как следует из фиг. 1, настоящий состав практически не меняет нативности элюируемых липидов (I и Ш) при сравнении их со взятыми в качестве контроля чистыми липидами — свидетелями (I I и IV) .

В то же время при исследовании липидов (Г и III ), элюированных кислотным растворителем Блайя — Дайера (прототип), наблюдаются деструктивные изменения при сравнении с контрольными чистыми липидами (II и IV). Пятна элюированных липидов (Г и III ) получаются менее четкими, размытыми. За ними тянутся шлейфы. Возможно появление дополнительных пятен, не свойственных данному соединению, что наблюдается на фиг. 2.

Подобные исследования были проведены с представителями всех основных классов липидов. Результаты были аналогичные.

Полученные данные свидетельствуют о том, что кислотный растворитель Блайя-Дайера (прототип), в отличие от предлагаемого состава, не обеспечивает сохранность нативных свойств липидов.

Ввиду отсутствия деструктивного влияния на липиды настоящего состава отпадает необходимость в нейтрализации получаемого элюата.

Пример. На пластину для ТСХ, приготовленную по общепринятым правилам, либо стандартную пластину «Silufol», или какую-нибудь другую наносят на старт смесь липидов (общий липидный экстракт изучаемой ткани) до 50 мг.

После разделения смеси в подходящей системе на индивидуальные классы (фосфолипиды, гликолипиды, м оно глицериды, стерины, диглицериды, жирные кислоты, триглицериды, эфиры жирных кислот, эфи5

65 ры стеринов, углеводарбды и др,) локализуют пятна известными в липидологии способами (в УФ-свете, парами йода и др.).

Затем сорбент с отмеченных участков соскребают отдельно и переносят без потерь в пробирки с пришлифованными пробками и заливают в каждую по 25 мл смеси: хлороформ — метанол — гептан — ледяная уксусная кислота (20: 10: 10: 1). Состав готовится предварительно простым смешиванием ингредиентов в указанной по объему пропорции. Все операции проводятся при комнатной температуре.

Встряхивают пробирки в течение 15 мин на механической качалке для элюирования с сорбента. Затем пропускают элюаты под небольшим разряжением через фильтр

Шотта пористостью 40 в сухие бюксы.

Остаток сорбента на фильтре промывают

25 мл вышеуказанной смеси. Фильтраты объединяют.

Общий выход липидов по каждому классу, определенный колориметрически, спектрофотометрически, денситометрически или гравиметрически, составляет в среднем не менее 99 / .

Предлагаемый состав апробирован на различных представителях следующих классов лип идов: фосфолипиды, гликолипиды, моноглицериды, диглицериды, стерины, жирные кислоты, триглицериды, эфиры стеринов, углеводороды. Включение высших углеводородов, стеринов и их производных в число липидов объясняется тем, что они обычно связаны с мембранами и содержатся вместе с фосфолипидами и нейтральными липидами в экстрактах, получаемых с помощью растворителей, используемых для извлечения жиров.

Данные испытания состава на химически чистых индивидуальных липидах — свидетелях и их смесях — приведены в таблице.

Полученные описанным способом элюаты прозрачны, бесцветны и не требуют дополнительной обработки нейтрализующими агентами.

В случае необходимости разделения на пластине (пластинах) одновременно более

50 мг липидов количество состава должно быть пропорционально увеличено.

Липиды, находясь в элюате, могут сохраняться в холодильнике при — 10 С 2 — 3 месяца. Элюат необходимо заливать в колбу под пробкой и держать в закрытом состоянии. В таких условиях в течение указанного срока не наблюдается деградация липидов.

Использование предлагаемого состава для элюирования липидов с пластин для

ТСХ позволяет полностью элюировать одновременно все основные классы липидов, получать липиды в неизменном состоянии, а также исключает необходимость в дополнительной нейтрализации элюата.

8л 8602

Степень элюирования лнпидных фракций

Количества, нанесенные на пластинку, мг

Количества, элюироваииые предлагаемым составом,* мг

Степень элюироваиия, %

Я п/п

Фракция липидов

Среднее

2 3

Фосфатидилэтаиоламии

То. же..

1-моноолеии

1,3-дипальмитин

Стеариновая кислота

Стеариновая кислота

Стеариновая кислота

Триолин ++- фосфатидиолхолии +--+-моногалактозилдиглицерид

-+- тетракозаи

Метилолеат

11

12

Олеииовая кислота

То же

Холестериловый эфир пальмитииовой кислоты

99,76 0,19

4,468

4,500

4,488 4,493

4,497

4,499

Фитостерии

4,489

* Определено колориметрически иа фотоэлектроколориметре ФЭК вЂ” 56М.

Формула изобретения уксусную кислоту при следующем соотношении ингредиентов, ч:

Хлороформ 20 — 25

Метанол 10 — 15

5 Гептан 10 — 15

Ледяная уксусная кислота 1 — 1,2

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Кейтс М. Техника липидологии. М., 10 «Мир», 1975, с. 165 (прототип).

Состав для элюирования липидов, разделенных тонкослойной хроматографией, содержащий хлороформ, метанол и кислоту, отличающийся тем, что, с целью одновременного полного элюирования всех основных классов липидов и сохранения их нативности, он дополнительно содержит гептан, а в качестве кислоты — ледяную

2

4

6

8

3,000

--5,500

1,000

5,500

5,000

5,500

3,000

1,000

4,500

5,500

5,100

2,500

3,000

1,500

4,500

3,000

2,970

5,450

0,996

5,458

4,986

5,488

2,976

0,992

4,555

5,480

5,056

2,487

2,981

1,482

4,515

2,978

2,981

5,480

0,990

5,447

4,991

5,482

2,998

0,992

4,512

5,477

5.083

2,493

2,977

1,487

4,505

2,982

2,976

5,469

0,993

5,488

4,972

5,483

3,003

0,998

4,498

5,493

5,105

2,503

2,990

1,492

4,498

3,002

2,991

5,477

1,008

5,510

4,974

5,485

3,013

;996

4,493

5,493

5,106

2,500

2,992

1,479

4,497

2,996

2,985

5,493

1,001

5,515

4,990

5,497

2,977

0,997

4,501

5,485

5,110

2,497

2,998

1,495

4,492

3,001

2,981

5,474

0,998

5,490

4,983

5,487

2,993

0,995

4,512

5,486

5,092

2,496

2,988

1,487

4,501

2,992

99,35 0,20

99,52 0,15

99,76 0,55

99,81 0,33

99,65+0,15

99,76 0,08

99,78 0,45

99,50 0,24

100,26 0,39

99,74 0,11

99 84 0 35

99,84+ 19

99,59+0,23

99,13 0,34

100,03 0,15

99,73 0,31 а а

1 Z

Фиг. 2

Фиг.!

Составитель О. Ленчицкая

Техред А. Камышникова Корректор Р. Беркович

Редактор С. Титова

Типография, пр. Сапунова, 2

Заказ 628/5 Изд. № 256 Тираж 694 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

П3035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5