Способ получения производных тетрапептидов или их солей

Способ получения производных тетрапептидов или их солей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е < 9 824

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (6I ) Дополнительный н патенту (22) Заявлено 021078 (21) 2669396/23-04 (51) М. Кл.

С 07 С 103/52

A 61 К 37/02 (23) Прйоритет — (32) 03. 10. 77 (3I ) 838516 (33) США

Государсткенный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДХ 547. 964. .4.07 (088.8) Опубликовано 230282.Бюллетень 34 7

Дата опубликования описания 23.0282

И ностранцы (72) А вторы

ИЗОб тЕНИя Эдвард Ли Смитвик -младшии,Роберт Теодор и Роберт Куртис Артур Фредериксон (Ка уман (СЙА) ада)- .

Иностранная фирма Зли Лилли знд Компани (США) (71) Заявитель.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

ТЕТРАПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙ

l0!

Изобретение относится к способу получения тетрапептидов или их солей — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Известен способ деблокирования соответственно защищенных пептидов в кислой среде. Использование известного способа позволяет получить новые соединения, обладающие интересными фармакологическими свойствами (1).

Цель изобретения — получение новых производных тетрапептидов или их солей, расщиряющих арсенал средств воздействия на живой организм.

Поставленная цель достигается способом получения производных тетрапептидов формулы (") 0 (),()R, Н,, и

tI и 1 И-CH-С вЂ” ИН-С//-С-NH- СН; С-И вЂ” С- 8

Н/1 1 l

2 1

R R СН

l где / и 0 означают хиральность;

R e H H H C — C3,.

/ I

R — водород или первичный алкнл C С ;

R — водород или первичный

3 алкил С/

Z — - СОХИ (при условии, когда один из радикалов R> и

R3- первичный алкил, второй — водород), или их солей, заключающийся в том, что защищенные соединения, соответствующие производным тетрапег.— тидов Формулы I, деблокируют обработкой в кислой среде.

Причем деблокирование осуществляют в трифторуксусной кислоте или в ледяной уксусной кислоте, насыщенной газообразным HC0 .

Фармацевтически приемлемые нетоксичные кислые соли присоединения включают соли брганических и неорганических кисзтот, например хлористоводородной, серной, сульфокислоты, винной, фумаровой, бромистоводородной, гликолевой, лимонной, малеиновой, фосфорной, янтарной, уксусной, азотной, бенэойной, аскорбиновой кислот, паратолуолсульфокислоты, бензолсуль. Фокислоты, нафталинсульфокислоты и пропионовой кислоты. Предпочтительно для образования кислых солей выбирать хлористоводородную, уксусную или янтарную кислоту. 31юбую из указанных солей получают известными методами.

Соединения формулы 1 являются первичнымй амидами, первичными спиртами или производными нитрилов специально определенных тетрапептидов.

Хиральность остатков аминокислот, при рассмотрении от положения 1 до

4 — .), D, отсутствует. Остаток в положении 3 — глициновая группа, следовательно он не может обладать

I хиральностью. Остаток в положении 4 может быть первичным амидом, первичным спиртом или нитрилом, его хиральность согласуется с соответствующим предполагаемым остатком

А. аминокислоты.

Соецинения формулы 1 получают с помощью известных способов синтеза пептидов. Возможно, что в процессе синтеза и некоторых соединений формулы 1 происходит частичная рацемизация. Однако степень рацемизации, если таковая происходит, недостаточна, чтобы существенно изменить анестезирующую активность соединений формулы I.

Способы получения оединений формулы 1 включают соче з.ние аминокислот или фрагментов пептида посредством взаимодействия функциональной группой с другой молекулой с образованием амидного связывания.

Для обеспечения эффективного сочетания желательно, чтобы все реакционноспособные функциональные группы, непосредственно не участвующие в реакции, были дезактивированы посредством использования соответствующих блокирующих групп и карбоксильная функциональная группа, которая подлежит сочетанию, была соответствующим образом активирована для обеспечения протекания сочетания.

Все это требует тщательного выбора как последовательности превращений, так и условий реакции, а также использования специальных блокирующих групп. Каждую из аминокислот, которые используют для получения соединений формулы 1 и которые имеют специально подобранные защитные группы и/или активированные функциональные группы, получают при использовании известных методик.

На каждой стадии общего синтеза соединений формулы I применяют выбранные комбинации блокирующих групп. В синтезе соединений формулы

I могут работать и другие комбинации, хотя, возможно, с меньшей степенью эффективности, Так, например, бензилоксикарбонил, трет.-бутилоксикарбонил, трет.-амилоксикарбонил, .,-матоксибензилоксикарбонил, адэман5

t0

65 тилоксикарбонил и изоборнилоксикарбонил могут в различных случаях использоваться в качестве групп блокирующих аминогруппы в синтезе соединений формулы. Более того, в качестве защищающего оксигруппу для остатка тирозила обычно используют радикал бензил. (Взл), даже если могут быть использованы другие агенты, например п-нитробензил, и-метоксибензил.

Применяемые при синтезе соединений формулы 1 группы, блокирующие карбоксил, могут представлять собой любые из типичных эфирообразующих групп, например, включающие метил,. этил,бензил, п-нитробензил,п-метоксибензил и 2,2,2-трихлорэтил. .Сочетание соответствующим образом защищенных N-блокированных аминокислот или пептидных фрагментов с соответственно защищенными карбоксиблокированными аминокислотами или фрагментами пептида при получении соединений формулы 1 заключается в превращении свободных функциональных карбоксильных групп аминокислот или пептидных фрагментов, активных в соотношении реакции сочетания. Это может быть осуществлено посредством использования любой из известных методик, одна из которых заключается в превращении функциональной группы карбоксила в смешанный ангидрид.

Свободные функциональные карбоксильные группы активируют посредством взаимодействия с другой кислотой, обычно производной карбоновой кислоты, например хлорангидрид кислот.

Примерами хлорангидридов кислот, применяемых для образования смешанных ангидридов, являются этилхлороформиат

/ фенилхлороформиат, втор.-бутилхлороформиат, изобутилхлороформиэт и пивалоилхлорид. Предпочтительно использовать изобутилхлороформиат.

Другим способом активирования карбоксильных групп для целей проведения реакции сочетания является превращение их в соответствующие активные эфирные производные. Такие активные эфиры включают, например, эфир 2,4,5-трихлорфенила, эфир пентахлорфенила и эфир п-нитрофенила.

Другим способом сочетания является метод азидного сочетания.

Предпочтительный способ сочетания при получении соединений формулы

1 включает использование N,N-дициклогексилкарбодиимида (ДСС) для активирования свободной карбоксильной группы и тем самым способствует протеканию реакции сочетания. Этот способ проводится при использовании эквимолярного количества ДСС относительно аминокислоты или пептидного фрагмента и осуществляется в присутствии эквимолярного количества 1-оксибензотриаэола (ОБТ). Нали908246

35 чие ОБТ подавляет нежелательные побочные реакции, включая вероятную рацемизацию.

Отщепление выбранных блокирующих групп необходимо на определенных стадиях в последовательности синтеза при получении соединений формулы I ..

Отщепление карбоксилэащищающих групп может быть достигнуто посредством щелочного омыления. Обычно для деэтерификации защищенного карбоксила применяют относительно сильные щелочи, типичным является использование гидроокисей щелочных металлов (гидроокись натрия,гидроокись калия и гидроокись лития) .Блокирующие кар- 15 боксил группы, кроме того, могут быть удалены каталитическим гидрогенолиэом, например, включающим гидрогенолиз в присутствии катализатора — палладий на угле. 20

Более того, в тех случаях, когда блокирующая карбоксилгруппа является н-нитробензилом или 2,2,2трихлорэтилом, деблокирование может осуществляться посредством восста- 25 новления в присутствии цинка и соляной кислоты.

Группы, блокирующие аминную функцию, отщепляются посредством обработки защищенной аминокислоты или — 30 пептида кислотой, например, муравьиной кислотой, трифторуксусной кислотой (ТФУ), и-толуолсульфокислотой (TCK) бензолсульфокислотой (БСК) и нафталинсульфокислотой с образованием в качестве продукта соли присоединения соответствующей кислоты. Отщепление аминоблокирующей группы также может осуществляться посредством обработки блокированной аминокислоты или пептида смесью HBr или 40

НСь и уксусной кислоты, для того чтобы получить соответствующую кислую соль присоединения, гидробромид или гидрохлорид.

Конкретный способ или используе- 45 мые реагенты зависят от химических или физических характеристик применяемых материалов в специальной реакции деблокирования. В тех случаях когда Группа Rn отличается от 50 водорода и пептид содержит, по крайней мере, три остатка аминокислоты, которые следует деблокировать, наиболее предпочтительно деблокировать пептид ТФУ или муравьиной кислотой, получая соответствующую кислую соль присоединения. Эту соль можно превратить в более приемлемую фармацевтически нейтральную фор.лу посредством обработки соответствующей ионообменной смолой, например DEAE, Се- 60 фадект А25 и Амберлит й27, Присутствующая в тирозильном остатке оксиэащищающая группа может быть сохранена в пептиде на протяжении последовательных стадий его 5 получения, причем ее удаляют на последней стадии синтеза в сочетании с отщеплением аминоблокирующих групп.

Однако, в. зависимости от применяемых условий для удаления кърбоксилблокирующих групп, она может быть удалена ранее, в процессе получения, Когда карбоксильную группу отщепляют посредством. щелочного омыления, оксизащищающая группа остается, однако при использовании каталитического гидрогенолиза для удаления карбоксилзащищающей группы оксизащищающая группа также отщепляется. Но получение соединений формулы I может осуществляться в присутствии- тирозильного остатка, имеющего свободную гидроксильную группу.

Пример 1. Получение 1-тирозил-D-аналин-глицил-N MeTH -L-фенилаланинамида (уксуснокислой.соли).

А. Бенэил-D-алинат-и-толуолсульфонат.

K смеси 100 мл бенэилового спирта и 200 мл бензола, содержащей 55,1.г (0,29 моль) моногидрата и-толуолсульфокислоты, добавляют 25 г (0,281 моль) D-аланина. Смесь доводят до кипения, причем воду удаляют в виде азеотропа с помощью ловушки

Дина-Старка. Эту смесь нагревают в течение 15 ч и затем охлаждают до комнатной температуры и разбавляют эфиром. Полученный осадок отделяют и перекристаллиэовывают иэ смеси метанола и эфира, получая 55,3 г (56 Ъ) соединения, т. пл. 112-115 С. молекулярный вес 351,42.

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 58,10;Н 6,02;N 3,99.

C,„Í2„ND

Найдено,Ъ: С 58,19;Н 6,06;N 3,82.

Б. Бенэил-М -трет.-бутилоксикарбонил-0-бензил-L тироэил-D-алинат.

К 200 мл сухого диметилформамида (ДМФ) добавляют 35,1 г (0,1 моль) диаэабициклооктана (ДАБЦО). Смесь перемешивают в течение 10 мин при

0 С и добавляют 37,1 .г (0,1 моль) 4 -трет.-бутилоксикарбонил-о-бензил1.-тирозина и затем 13,5 r (0,1 моль)

1-оксибензотриазола (НВТ) и 20,6 r (0,1 моль) N И-дициклогексилкарбодиимида (ДСС). Образовавшуюся смесь перемешивают при 0 С в течение 3 ч и затем при комнатной температуре в течение 1 сут. Затем эту смесь охлаждают до 0 С, полученную суспензию фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Полученный осадок снова растворяют в этилацетате и последовательно промывают 1 н. раствором

NaHCO3 водой, холодным 0,75 н.

З и раствором лимонной кислоты и водо

Органический слой сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Полученный остаток р астворяют в горячем этаноле. При охлаждении происходит кристалли908246

25 зания. После первой кристаллизации из этанола получают 41,5 г (80 Ъ) чистого вещества, т. пл. 121-123 С.

Молекулярный åñ 520,63 °

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 69,21;Н 6,97;N 5,38.

Cgg H96 +O6

Найдено, Ъ :С 68,99;Н 6,75:И 5,17.

В. N -трет.-бутилоксикарбонил-Обензил-L- zpoaza-D-аланин.

К смеси 200 мл тетрагидрофурана (ТГФ) и 20 мл воды добавляют 31,2 г (0,06 моль) полученного продукта, Полученный раствор охлаждают до О С и медленно добавляют к нему 13 2 мл (1,1.эквивалента) 5 н. раствора гидроокиси натрия. Полученную смесь перемешивают и оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры.

Через 5 ч смесь распределяют между эфирным и водным слоями. Водный слой отделяют и охлаждают, поддерживая рН посредством добавления лимонной кислоты, и смесь экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный экстракт промывают водой, сушат над сульфатом магния, фильтруют и разбавляют эфиром. Полученный осадок собирают, получая 17,7 г (67 Ъ) соединения, т. пл. 160-162ОC. Молекулярный вес

442,51.

Элементный анализ:

Вычислено,%:С 65,14;Н 6,83;N 6,63.

С24 НЭО М ОЬ

Найдено, Ъ :C 64,73;Н 6,70;N 6,20

Г. Бензил-М-трет.-бутилоксикарбонил-О-бензил-L тирозил-D-.àëàíèëглицинат.

К 70 мл сухого ДМФ добавляют

6,74 r (0,02 моль) кислой и-толуолсульфокислотной соли бензилглицината.

Полученную смесь охлаждают до ООС и добавляют 2,24 г (0,020 моль)

DABCG. Смесь перемешивают в течение нескольких минут и добавляют 8,84 r (0,020 моль) полученного продукта и затем 2, i г (0,020 моль! HBT u

4,12 г (0,020 моль) ДСС. Реакционную смесь перемешивают в течение

2 ч при О С и затем в течение 1 сут при комнатной температуре. ПолученО ную суспензию охлаждают до 0 С, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Полученный осадок растворяют в этилацетате и последовательно промывают 1 н. раствором бикарбоната натрия, водой, холодным 0,75 н. раствором лимонной кислоты и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, фильтру. ют и концентрируют в вакууме. Полученный остаток кристаллизуют из этанола, получая 10,8 r (92,8 Ъ) чистого соединения, т.пл. 145

147 С. Молекулярный вес 589,69.

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 67,22;Н 6,67;N 7,13

СЭЭ НЭ9 1Я 5O7

Найдено, Ъ :С 67,32;Н 6,83:N 6,91

55 бО

11. И -трет.-бутилоксикарбонил-0бензил-L-тирозил-D-аланилглицин.

К 150 мл смеси тетрагидрофурана и воды (9:1) добавляют 15,95 г (27 моль) полученного продукта, Смесь о охлаждают до О С при перемешивании и к полученной смеси-по каплям добавляют 30 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия. Смесь перемешивают в течение 2 ч до завершения прикапывания и затем ее дважды экстрагируют эфиром. Выделенный водный слой подкисляют до рН 2,5 добавлением

30 мл 1 н. раствора соляной кислоты.

Вещество кристаллизуют, отделяют фильтрацией и перекристаллизовывают один раз из смеси метанола и воды и дважды из этилацетата, получая 11,43г (85Ъ от теории), т. пл. 104-107 С. (о()p)+ 31,4 (C=O 5; метанол). Молекулярный вес 499,54.

Элементный анализ:

Вычислено,::C 62,51;Н 6,66;N 8,41

26 HH33NN3 OOV

Найдено, Ъ :С 62,31;Н 6,83;N 8 12

Е. N òðåò.-бутилоксикарбонил-N метил-1-фенил-аланин, соль d(+) -метилбензиламина.

К 75 мл тетрагидрофурана добавляют 13,26 г (0,05 моль) 1Фтрет.— бутилоксикарбонил-А-фенилаланина и полученную смесь по каплям в течение 30 мин прибавляют при перемешивании к суспензии 0,15 моль гидрида калия и 0,5 г 18-крау-6 эфира при

О C в атмосфере азота. 11еремешивание продолжают при 0 С еще 1 ч. По каплям добавляют раствор 6,23 мл (0,1 моль) иодистого метила в 15 мл тетрагидроуурана в течение 15 мин.

Смесь выдерживают в течение 2 ч и по каплям добавляют смесь 10 мл уксусной кислоты и 10 мл тетрагидрофурана и затем добавляют 20 мл этанола. Затеял смесь вливают в 400 лл льда. рН полученной водной фазы доводят до 12-13 путем добавления

2 н.раствора гидроокиси натрия.

Водную смесь дважды экстрагируют эфиром и затем подкисляют до рН

3,0, добавляя твердую лимонную кислоту. Затем водную смесь экстрагируют эфиром (3 х 200 мл). Эфирные экстракты объединяют, экстрагируют водой, высушивают над сульфатом магния и упаривают в вакууме до сиропообразного состояния. Этот сироп растворяют в 50 мл .эфира и добавляют 6,44мл (0,05 моль) d(+)-о(--метинбензиламина. Продукт осаждают добавлением

350 мл гексана, отфильтровывают, получают 15,83 r (79Ъ от теории) соединения. При перекристаллизации из этилацетата получают 13,70 r. (68 Ъ от теории) соединения, т. пл. 136 ,139 С; (d. ) — 28,2 (C=-1, зтанол) .

Молекулярный вес 400Ä50, 908246

Элементный анализ:

Вычислено,% С 68,97;Н 8,05;N 6,99 с2Ъ НЭЯ.N204

Найдено, % :С 68,75;Н 7,81;N 6,74.

Ж. И -трет.-бутилоксикарбонил-N" oL метил-б-фенилаланиламид.

N -трет.-бутилоксикарбонил-Б -метил-L-фенилаланин (4 г, 0,01 моль), полученный посредством подкисления

d(+)-aC метилбензиламинной соли и последующей экстракцией эфиром, растворяют в 20 мл ДМФ. Смесь охлаждают до -5 C и добавляют 1,56 мл (0,012 моль) изобутилхлороформиата и затем 1,32 мл (0,012 моль) Н-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин при -15 С

0 и барботируют в нее безводный аммиак в течение 1,5 ч. Полученную смесь пео ремешивают в течение 1 ч при -15 С и затем вливают в сосуд, содержащий

200 мл льда. Водный раствор экстрагируют этилацетатом. Органический слой отделяют и промывают последовательно 1,5 н. раствором лимонной кислоты, водой, 1 н. раствором бикарбоната натрия и водой. Затем этил" ацетатный раствор высушивают над сульфатом магния и упаривают в вакууме до сиропообразного состояния, Сироп кристаллизуется из смеси эфира и петролейного эфира, получают

2,12 г (76 % от теории) соединения, т. пл. 91 — 92 С, Ы7 — 111,2 (С = О, 5; СНСВ ) . Молекулярный вес 278,33.

Элементный анализ:

Вычислено,%:С 64,73;Н .7,97;N 10,06

C„ H«N Oq

Найдено, % :С 64,95;Н 7,81;N 9,79

3. N Tðåò.-бутилоксикарбонил-0бенэил-L-тирозил-D-аланилглицил-N метил-L-фенилаланиламид.

К 20 мл свежеприготовленной ледяной. уксусной кислоты, содержащей безводный хлористый водород (1н.раствор) и 2 мл анизола, добавляют 1,95г (0,007 моль) Нс -трет.-бутилоксикарбонил-И -метил-Ь-фенилаланиламида.

ПОлученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

30 мин. Затем вливают в эфир, выпавший осадок отделяют, высушивают и получают 1,5 г хлористоводородной соли, которую растворяют в 30 мл

ДМФ. Раствор охлаждают до 00С и добавляют к нему 1,4 мл (0,007 моль) дициклогексиламина. Смесь перемешивают в течение нескольких минут и добавляют 3,5 г (0,007 моль) утрет. -бутилоксикарбонил-О-бензилL-тирозил-D-аланилглицина, 950 мг (0,007 моль) HBT и 1,4 г (0,007моль)

ДСС. Затем реакционную смесь перемешивают при 0 С в течение 2 ч и затем при 4 С.в течение 1 сут, вновь охлаждают до О С и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме до мас-. лообразного состояния; масло повторно растворяют в этилацетате.

Этилацетатный раствор последовательно экстрагируют 1 н. раствором бикарбонатЕ натрия, водой, холодным раствором 0,75 н. лимонной кислоты и водой ° Органическую фазу высушивают над сульфатом магния и концентрируют в вакууме до масла. Масло подвергают хроматографической очистке на колонке 40 см х 3 см с силикагелем марки Грейс и Дэвисон

62 в хлороформе. Продукт элюируют, используя ступенчатый градиент концентрации хлороформа в смеси 10 % метанола в хлороформе. Контроль. за ходом очистки ведут с помощью тон 5 кослойной хроматографии отбираемых фракций. Получают 3,55 г (77 % от теории) соединения,(о(.) - 9,2 (С

= 0,5;метанол). Молекулярный вес

659,8.

Щ Элементный анализ:

Вычислено,%:С 65,54;Н 6,57;Л 10,61

С Н N О

Найдено, % :С 65,46;Н 6,58;N 10,36

И. И (-трет ° -бутилоксикарбонил25 L-тирозил-D-аланил-глицил- N -метилL-фенилаланиламид.

3,2 r полученного продукта (0,0485 моль) растворяют в 60 мл этанола и добавляют к смеси в виде водной суспензия 1,5 г палладия (5%) на угле. Через реакционную смесь барботируют азот с помощью газораспределительной трубки в течение 5 мин и затем пропускают водород в течение . 6 ч. Затем реакционную смесь продувают азотом и палладиевый катализатор отделяют фильтрованием.

Смесь концетрнруют в вакууме до сиропообразного состояния. Сироп растворяют в хлороформе и пропускают

40 через хломатографическую колонку

40 х 3 см, содержащую силикагель марки Грейс и Дэвисон 62. Продукт элюируют, и "пользуя ступенчатый градиент концентрации хлороформа в сме45 си 10 % метанола в хлороформе, и выделяют в соответствия с тонкослойным профилем отобранных фракций, получая 2,0 г соединения (74% от теории), (3.j - 9,9 (C=0,5 ме50 танол) .

Аминокислотный состав-.G(!y 1,01, AFa 0,99; Tyr 0,99, NH 1,14, (k

К; .4i-тирозил-3-аланил-глицилИ -метил-А-фенилаланиламид, ацетатная соль °

1,6 г полученного продукта (0,00281 моль) растворяют в 10 мл

ТФУ, содержащей 0,5 мл анизола.

Смесь перемешивают при 0 C в течение 30 мин, затем выливают в эфир и полученный осадок собирают и высушивают (1,1 г) . Твердое вещество растворяют в соответствующем количестве водного буферного раствора (1 % пиридина и 0 05 % уксусной

65 кислоты) до объема 15 мл и раствор

908246

12 пропускают через колонку DEAEСефацекс A-25 (ацетат) размером

2,5 х 99 см,уравновешенную тем же буфером. Элюат просматривают при

280 нм и соответствующие фракции объединяют и лиофилизуют.При повторной лиофилизации из 10 Ъ-ной уксусной кислоты, с последующей лиофилиэацией из смеси воды и ацетонитрила (3:1), получают 0,84 г соединения.

bL) + 27,8 (С = 1,1 н. раствор НС(.)

Аминокислотный состав: Tyr 0,98, ЛРа 1,03, GCy 1,00, NH g 1,05.

Пример 2. Получение БL-тирозил-D-аланил-глицил-L -метилфенилаланиламида, ацетатная соль.

А.Ь-J. — ìåòèëôåíèëàëàíèí, бензиловый эфир, тозилатная соль.

К 100 мл бензола добавляют 3,0 г (0,0168 моль) Ь-ь1.-метилфенилаланина.

К полученной суспензии затем добавляют 3,5 г (1,1 эквивалента) гидрата Я(() п-толуолсульфокислоты и 10 мл бензилового спирта. Смесь кипятят с обратным холодильником и ловушкой

Дина-Старка для воды в течение 4 сут.

Затем смесь охлаждают до комнатной 2 температуры и добавляют к ней эфир, чтобы осадить соль тозилата. Полученный осадок собирают и высушивают, получая 7,0 г (94 Ъ) соединения, т. пл. 129 — 131 C. (с() — 10,7 (С = 0,5; 1 н. раствор У метиловом спирте). Молекулярный вес 44),5.

Элементный анализ:

Вычислено, -oo: N 3,17

С 4Н ., И ОНайдено, -o : N 2,87.

В. И -трет.-бутилоксикарбонил-Обензил-L-тирозил-D-аланил-глицил-1.— д=метилфенилаланин, бензиловый эфир.

К 80 мл ДМФ добавляют 5,74 r 40 (0,013 моль) полученного продукта.

Полученную смесь охлаждают до О С в течение 5 мин и добавляют 6,5 г (13 моль). 1Ф-трет-бутилоксикарбонилО-бензил-L-тирозил-D-аланил-глицина (полученного как в примере 1), 1,8 г (13 моль) НВТ и 2,7 r (13 моль)

ДСС. Смесь перемешивают при 0 С в течение 2 ч и затем при комнатной темпеРатуре в течение 1 сут. Затем смесь охлаждают до 0 С и полученный осадок отделяют фильтрацией. Фильтрат упаривают в вакууме. Полученный остаток растворяют в этилацетате и этилацетатный раствор последовательно экстрагируют 1 н. раствором бикарбоната натрия, водой, 0,75 н. раствором лимонной кислоты и водой.

Органический слой затем высушивают над сульфатом магния и упаривают в вакууме до маслообразного состояния. Щ

Масло кристаллизуют из эфира и перекристаллизуют из смеси этилацет та и эфира. Получают 7,0 г (72 Ъ) соединения.(с1:) > +7,9 (С = 0,5 метанол>. Молекулярный вес 750,86. Я

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 68,78; l 6,71;И 7,46

С43 Н5О ИЛОВ

Найдено, Ъ :С 68,75;Н 6,46;N 7,21.

d. N -трет.-бутилоксикарбонилL-тирозил-D-аланил-глицил-Ь-oL-метилфенилаланин, соль дициклогексиламина.

К 50 мл этанола добавляют 4,0 г (0,053 моль) полученного продукта.

Затем добавляют суспензию 2,0 г палладия (5%) на угле в ДМФ. Через смесь пропускают азот, подаваемый через газораспределительную трубку в течение 5 мин, и затем подают газообразный водород в течение 4., Затем смесь обильно продувают азотом и отделяют палладиевый катализатор фильтрацией. Фильтрат концетрируют в вакууме до сиропообразного состояния. Сироп в растворе хлороформа ! подают на колонку размером 10 х 2см

I содержащую силикагель марки Грейс и Дэвисон 62. Колонку элюируют при ступенчатом градиенте концентрации хлороформа в смеси хлороформ метанол (9,5:0,5). Основные фракции объединяют и растворитзль упаривают. Полученное масло растворяют в этилацетате и добавляют к раствору 1 мл дициклогексиламина. Выпавший в осадок продукт отфильтровывают, высушивают, получая 2,6 г (65 Ъ) соединения,т. пл. 142 — 146 С (о()п + 46,3 (С = 0,5, метанол).

Г. N -трет.-бутилоксикарбонилL-тирозил-D-аланил-глицил-L-Х-метилфенилаланиламид.

2,0 г полученного продукта (0,0227 моль) нейтрализуют смесью этилацетата и 0,75 н. раствора лимонной кислоты. Выделившийся органический слой отделяют, экстрагируют водой, высушивают над сульфатом магния и упаривают в вакууме до масла (1,5 r). Полученную свободную кислоту растворяют в 30 мл ДМФ и раствор охлаждают до О С в бутыли, выдерживающей давление. Добавляют 560 мг

ДСС (0,0027 моль) и смесь перемешивают 4 ч при О С и затем в течение

3 ч при комнатной температуре. Затем бутыль охлаждают до -78 С и добавляют 30 мл безводного аммиака.

Бутыль снова закупоривают и смесь оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 48 ч.

Смесь охлаждают до -78 С, бутыль открывают и непрореагировавший аммиак дегазируют в процессе нагревания бутыли до комнатной температуры. Затем растворитель выпаривают в вакууме.

Полученный остаток растворяют в этилацетате и этилацетатный раствор экстрагируют сначала 0,75 н. раствором лимонной кислоты и затем водой. Раствор высушивают над сульфатом магния, и растворитель выпаривают в вакууме.

Остаток растворяют в хлороформе и

90В246

45 подают на колонку размером 3 х 45 см

<с силика елем. Колонку элюируют при постепенном градиенте, включающем добавление хлороформа к смеси хлороформ — метанол (9:1). Контроль за ходом очистки ведут с помощью хромотографии в тонком слое. Фракции, содержащие продукт, объединяют, упаривают и получают 1,1 г (72Ъ) *соединения, (с(.) — 26 (С = 4, метанол).

Анализ аминокислот: 08у 0,99;

АСа 1,00; Tyr 0,99; ИН3 1,12.

Д. Ь-тирозил-D-аланил-глицилLM-метилфенилаланиламид, ацетатная соль.

К 20 мл смеси 1 н. раствора хлористого водорода в ледяной уксусной t5 кислоте, содержащей 0,3 мл анизола, добавляют 0,9 r (0,0016 моль) полученного продукта. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

30 мин и затем вливают в эфир. Полу- Щ ченный осадок собирают и высушивают (720 мг). Твердое вещество растворяют в таком количестве буферного раствора (1 Ъ пиридина и 0,05 Ъ уксусной кислоты), чтобы конечный 25 объем был 5 мл, и раствор подают на колонку размером 2,5 см х 99 см с

ОЕАЕ-Сефадекс A-25 (ацетата), предварительно доведенным до равновесия с тем же самым буфером. Элюат просматривают при 280 нм и соответствую- З щие фракции объединяют и лиофилизируют. Повторную лиофилизацию проводят из 10 Ъ-ной уксусной кислоты и затем из смеси воды и ацетонитрила (3:1) . Получают 400 мг соединения (с(3 + 23,9 (C 0,5; 1 н. раствор HC3) . Молекулярный вес

529,60.

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ: С 58,97; Н 6,66; 40

N 13,22; О 21,15.

С26 H35 N3 07

Найдено, Ъ : С 59,02, Н 6,36;

N 12,99; О 21,41.

Анализ аминокислот: Туг 0,96;

Аг а 1,01; (г,у 1,00; NH3 1,03.

Пример 3. Получение Ь-тирозил-D-аланил-глицил-N4 -н-пропил-Lфенилаланиламида, ацетата.

А. N -трет.-бутилоксикарбонилN — н-пропил-L-фенилаланин. дК 70 мл тетрагидрофурана добавляют 10,6 г (0,04 моль) N -трет.-буd тилоксикарбонил-L-фенилаланина и полученную смесь по каплям в течение

30 мин прибавляют при сильном перемешивании к суспензии 0,12 моль гидрида калия в 220 мл тетрагидрофурана и 0,5 г 18-краун-б эфира при

О С. Процесс ведут в атмосфере азота. Смесь перемешивают еще 10 мин при d0

0 С. По каплям добавляют раствор

23,3 мл (0,24 моль) 1-иодопропана в

40 мл тетрагидрофурана в течение

20 мин. Смесь выдерживают .в течение

2,5 ч при О С и вводят в нее по, 65 каплям 11,5 мл (0,12 моль) 1-иодопропана. Перемешивание продолжают о еще 2 ч при 0 С, затем вносят 10мл ледяной 1.ксусной кислоты и вновь перемешивают в течение- 10 мин. Затем смесь выливают на раздробленный лед. рН полученной водной фазы доводят до 8,0, добавляя 2 н.раствор гидроокиси натрия. Водную фазу дважды экстрагируют эфиром и затем подкисляют до рН 2,5 добавлением холодного 2 н. раствора HCC . Затем водную фазу экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный экстракт промывают один раз водой, высушивают над сульфатом магния и упаривают в вакууме до сиропообразного состояния. Сироп растворяют в 200 мл эфира и добавляют 8 мл ,(0,04 моль) DCHA. Осадок отфильтровывают и фильтрат промывают 1,5 н. раствором лимонной кислоты и воды.

Эфирный слой высушивают над сульфатом магния и упаривают в вакууме до маслообразного состояния. Масло очищают хроматографически на колонке размером 3 х 40 см с силикагелем в хлороформе. Продукт элюируют, используя ступенчатый градиент хлороформа в смеси 5 Ъ метанола в хлороформе. 3а ходом очистки следят с помощью хроматографии в тонком слое. Фракции, содержащие продукт, собирают, упаривают и получают З,бг (31 Ъ от теории) соединения, )о()

153,3 (C = 1 метанол).

ЯМР-спектр: сГ (-COg Н) = 10, 47;

d(Ne3C †)= 1,50. Молекулярный вес

295,4.

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 65,06;Н 8,53; 4,74 с.„н 2„г) О4

Найдено, Ъ :C 65,26;Н 8,29; г)4,69

Б.N òðåò.-бутилоксикарбоксилN -н-пропил-L-фенилаланиламид.

oL

К раствору N-трет.-бутилоксикарбонил-N H- пропил-L-фенилаланина в ДМФ, охлажденному до -15 С, добавляют один эквивалент изобутилхлороформиата и затем один эквивалент

N-метилморфолина. Смесь перемешивают о в течение 10 мин при -15 С и затем пропускают через нее в течение

30 мин безводный аммиак. Полученную о смесь перемешивают 1 ч при -15 С и затем смеь вливают в сосуд, соцержащий 200 мл льда. Водный раствор зкстрагируют этилацетатом. Органический слой отделяют и промывают последовательно 1,5 н. раствором лимонной кислоты, водой, 1 н. раствором бикарбоната натрия и водой.

Слой этилацетата отделяют и высушивают над сульфатом магния, упаривают в вакууме, получая укаэанное соединение.

В. И 1-трет.-бутилоксикарбонилQC

L-тирозил-D-аланил-глицил-Л -н-пропил-Ь-фенилаланилаглид.

908246

К 20 мл свежеприготовленного 1 н. раствора безводного HCf в ледяной уксусной кислоте, содержащего 2 мл анизола, добагляют один эквивалент

И (трет.-бутилоксикарбонил-N -н-про0(. пил-L-фенилаланиламида. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин, затем вливают в эфир и образовавшийся осадок собирают и высушивают. Затем хлористоводородную соль растворяют,в 30 мл

ДМФ. Раствор охлаждают до 0 С и добавляют один эквивалент N -трет.—

С(, бутилоксикарбонил-0-бензил-L-тирозил-0-аланил-глицина (полученного как в примере 1 Д),один эквивалент

HAT 1 эквивалент ДСС.Затем реакционную смесь перемешивают при О С в течение 2 ч и при 4 С в течение 1 сут.Смесь охлаждают до 0 С и фильтруют.Фильтрат концентрируют в вакууме до масла, которое снова растворяют в этилацетате ° Этилаце татный раствор промывают посЛедовательно 1 н. раствором бикарбоната натрия, водой, холодным 0,75, н ° раствором лимонной кислоты и; водой. Органическую фазу высушивают над сульфатом магния и концен- трируют в вакууме до масла. Масло хроматографируют на колонке размером 3 х 40 см с силикагелем в хлороформе. Продукт элюируют, используя ступенчатый градиент хлороформа в смеси 10 % метанола в хлороформе. За ходом хроматографии следят с помощью хроматографии в тонком слое отобранных фракций, получают N<-трет.-бутилоксикарбонил-0бензил-L-тирозил-L-аланил-глицил Ф-н-пропил-L-фенилаланиламид.

Полученный продукт растворяют в

60 мл этанола и к смеси добавляют

1,5 r палладия (5%) на угле в виде водной суспензии. В реакционную смесь через газораспределительную трубку пропускают азот в течение

5 мин и затем водород в течение

6 ч. Затем реакционную смесь продувают чзотом и палладиевый катализатор удаляют фильтрованием. Смесь концентрируют в вакууме до сиропообразного состояния. Сироп растворяют .в хлороформе и чистят хроматографией на колонке 40 х 3 см, содержащей силикагель. Продукт элюируют, используя ступенчатый градиент хлороформа а смеси 10 Ъ метанола в хлороформе, и выделяют в соответствии с тонкослойным профилем отобранных фракций, получая соединение, молекулярный вес 597,7, (о/.) - 34,8 (С = 0,5 метанол) .

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 62,29;Н 7,25;N 11,72

СУ Н43 И 07

Найдено, Ъ :С 62,13;Н 7,24;Н 11,70

Г. L-тирозил-Р-аланил-глицил-NФ.» -пропил-L-фенилаланипамид, ацетат.

2О

50 бО б5

800 мг полученного продукта (1,34 ммоль) растворяют в 10 мл трифторуксусной кислоты, содержащей 0,5 мл анизола. Смесь перемешивают при 0 C в течение 30 мин. Реакционную смесь сушат лиофилизацией. Твердое вещество растворяют в достаточном количестве водного буферного раствора .(1% пиридина и 0,5 Ъ уксусной кислоты), объем доводят до 10 мл; раствор падают на колонку размером 2,5 х 99 см с DEAE-Сефадексом A-25 (ацетат), который уравновешен тем же самым буфером. Элюат просматривают при длине волны 280 нм и соответствующие фракции объединяют и лиофилизуют. Повторная лиофилизация из 1 М раствора уксусной кислоты дает 655 мг соединения, (oL) — 11 0 (С = 0 5, 1 н. раствор ЙСР). Молекулярный вес 557,6.

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 60,31;Н 7,05: М 12,56

С S НР9 И Оу

Найдено, Ъ :С 60,23;Н 6,98;И 12,49

Анализ аминокислот, Tyr 0,99, АЕа 1,00; ЬРУ 1,01, NH 0,96.

Пример 4. Получение L-тирозил-D-аланил-глицил-N -этил-L-Фенилаланиламида, ацетатная соль.

А. N -бутилоксикарбонил-N -этил-!

L-фенилаланин.

К 70 мл тетрагидрофурана добавляют 10,6 F (0,04 моль) И"-бутилоксикарбонил-Ь-фенилаланина. Полученную смесь добавляют по каплям в течение 30 мин к механически перемешиваемой суспензии 0,12 моль гидрида калия в 220 мл тетрагидрофурана и 0,5 г 18-храуи-6 эфира при 0 С в атмосфере азота. Смесь перемешивают дополнительно в течение 10 мин при 0 С. Затем по каплям в течение

20 мин добавляют раствор 19,4 мл (0,24 моль) иодистого этила в 40 мл тетрагидрофурана. Смесь выдерживают в течение 4 ч при 0 С. Добавляют еще

19,4 мл (0,24 моль) иодистого этила к смеси двумя равными порциями. Смесь перемешивают дополнительно 2 ч при

0 С и затем добавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты.

После перемешивания в течение

10 мин смесь вливают на 400 мл измельченного льда. рН полученной водной фазы увеличивают до 8,0 добавлением 2 н. раствора гидроокиси натрия. Водную смесь дважды экстрагируют эфиром и затем подкисляют до рН 2,5 добавлением холодного 2 н. раствора соляной кислоты. Затем вод-. ную смесь экстрагируют этилацетатом, экстракт промывают водой, высушивают над сульфатом магния и выпаривают в вакууме до сиропообразного состояния. Сироп растворяют в

200 мл эфира и добавляют 8 мл (0,04 моль) DCHA. Осадок отфильтровывают и фильтрат экстрагируют 1,5 н. раствором лимонной кислоты и водой.

17

908246

Эфирный слой высушивают .над сульфатом магния и упаривают в вакууме, получают 4, 6 r ((339 9Ъ от теории) соединения.

Спект HNP: d (фенил)= 7,2;

/(Ме СОС-) =1,4.

Б. N -трет.-бутилоксикарбонилN -этил-L-фенилаланиламид. с

4,3 г полученного N -трет.-бутилоксикарбонил-N -этил-L-фенилаланила (О 0416 моль) растворяют в

l о

60 мл ДМФ. Смесь охлаждают до 0 С и добавляют к ней 3,0 г (0,0146 моль)

ДСС. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0 С и затем 72 ч при комнатной температуре. Затем смесь охлаждают до 0 С и фильтруют.

Фильтрат концентрируют в вакууме до масла, которое повторно растворяют в этилацетате. Раствор экстрагируют

1 н. раствором бикарбоната натрия, водой, холодным 1,5 н. раствором лимонной кислоты и водой. Органическую фазу высушивают над сульфатом магния и концентрируют, получая

3,33 г (91 Ъ от теории) соединения, (с .) - 101, 51 о (С = 1, метанол) .

Молекулярный вес 292,4.

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 65,73;Н 8,27;N 9,58

С„6 Н24 и О

Найдено, Ъ: С 66, 03; Н 8, 13; N 9, 85.

В. N этил-L-фенилаланиламид, хлористоводородная соль.

3,5 r полученного соединения (11,95 моль) растворяют в 40 мл свежепригбтовленной уксусной кислоты, содержащей безводный хлористый водород (1 н. раствор) и 1,5 мл анизола и (С Н-) Я1Н. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин и затем вливают в эфир. Выпавший в осадок продукт отфильтровывают и высушивают, получают 2,6 г (96 Ъ от теории) соединения, т. пл. 276 — 277"C. Молекулярный вес 227,7.

Элементный анализ:

Вычислено,Ъ:С 58,02;Н 7,08;N 12,30

С..., Н„ И ОСЕ

Найдено, Ъ :С 57,97;Н 7,26;N 12,54

Г. N òðåò.-бутилоксикарбонилL-тирозил-D-аланил-глицил-N этилd

L-фенилаланинамид.

К 50 мл ДИФ добавляют 1,14 г (0,005 моль) Б< -зтил-L-фенилаланиламида в виде хлористоводородной соо ли. Смесь охлаждают до 0 С и затем

:добавляют 2,95 г (0,005 моль) соли

DCHA N TðåT.-бутилоксикарбонилL-тирозил-D-аланил-глицина. Реакционную м ссу перемешивают при 0 С

5 мин и затем добавляют к ней 675 мг (0,005 моль) НВТ и 1,03 r (0,005моль, ДСС. Перемешивание продолжают при

0 С 6 5 ч и затем при комнатной температуре в течение 20 ч. Смесь ох.лаждают до 0 C и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме