Способ определения протеолитической активности ферментов

Способ определения протеолитической активности ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

В. К. Швяаас. И. Ю, Галаев, Р. Ю. Савииене З,Ю; "Иаф»не;.-;

Ю. Ю..Сжпонавичюс и Г. И. Денис "-",;".:", -...

Всесоюзный научнр-исследовательский институ прикладной: .:, энзимопогии и Московский ордена Ленина, ор на СЫЩрьской

Революции и ордена Трудового Красного Знамен У Жуцарсхцрнный

; университет им. М, В. Ломоносова

) изобретения (71) Заявители (5Ф) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения активнос ти ферментов, Известен способ определения протеонитической активности (ПА) ферментов пу . тем изменения количества прогидролизой .:: ванных пептидных связей, включающий подготовку пробы, инкубацию субстрата с ферментом пробы, обработку анализируе- . мой пробы еагентом и спектрофотометри 40 рованиеми:(1.

Недостатком этого способа является низкая скорость образования окрашенно-, ro продукта- взаимодействия триныробен золсульфОкислОты с аминогруппами гю» ролизата. Вследствие этого, продолжительность определения протеолитической активности составляет. 1-2 ч.

Цель .изобретения - сокращение продолжительности определения.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения протеопитической активности ферментов путам измерения количества прогидролизованных

2 яептидных связей, включающий подготов-, ку пробы, обработку .анализируемой пробы реагентом и спектрофотометрирование, в качестве реагента используют 0 -фтале-, вый реагент и анализируемую пробу обрабатывают реагентом при рН 7,5-10.

В качестве 0-фталевого реагента используют раствор О-фталев ого aahдегида в концентрации 0,04-0,.12 мгlмл и меркаптоэтанопа в концентрации 0,2

0,2 мгlмл в боражом буфере.

Пример . Приготовление о-фталевого реагента.

В мерную колбу емкостью 200 мл приливают 2 мл этанольного раствора о-фталевого альдегида концентрации

1О мг/мл и 1 мл этанольного раствора меркаптоэтанола концентрации 5 мл/100 мл и доводят до метки 0,1 М боратным буфером рН 9,3, Определение активности нейтральной протеазы из протосубтилина ГЗХ.

В 50 мл 0,1 М универсального буфера рН 7,2 растворяют 1 г протосубl МВВ

Средняя оптичес- ПА, кая плот- ед/г

Число определений.Писперси

Серия, М ициент ии

0,382

0,389

0,435

0,399

0,406

552 90,7

1,7

561 105 8

628 113,8

576 75

1,8

1,7

1,5

586 64

1 3

0,464

0,444

0,444

0,411

663

91,2

1,2

108,6

104,5

1,6

1,6

634

587.lO

50;1.

1,2

3 9183 тилина F3X и готовят разведение 5 мл/

59 мл. Концентрация ферментного раствора 2 мгlмл. 1,5 г белкового субстрата растворяют в 200 мл 0,1 М универсального буфера рН 7,2. Белковый S субстрат готовят по способу Г. И. Дениса и др. $2). В 2 пробирки наливают по 1 мл полученного 0,75%-ного раствора субстрата, термостатируют при 30 С Ю

5 мин. В одну пробирку приливают 1 мл фермен»ного раствора, а в другую - 1 м(п инактивированного кипячением ферментно-.

rо раствора . (контроль) и инкубируют при 30 С 10 мин„"после чего выдерживаР ют обе пробирки в кипящей водяной бане

Д мин. В пробирки приливают по 10 мл о-фталевого реагента, взбалтывают и вьдерживают при 30 С,15 мин„после чего определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 340 нм Ф против контрольной пробы (с инактивированным ферментом).

Нротеопитическую активность в ед/г вычисляют по формуле: эю

qp щ ®© » где 3 - оптическая плотность раствора;

12 - разведение ферь3ен»ного раствора в ходе сйтределения;Г3 - глициновый эквивалент, определенный no калибровочной кривой (оптическая плотность, со

05 4 ответствующая 1 мм глицина), в данном случае ГЭ 2,8;

Wl — количество ферментного препарата, взятого на протеопиз в мгj

4000- переводной коэффициент полученных единиц на 1 г ферменчного препарата.

Оптическая плотность 0,440. Протеолитическая активность 94 ед/г.

За единицу активности принимается такое количество фермента, которое за 1 мин о при ЗО -С образует 1 .ммоль свободных аминогрупп.

При использовании предлагаемого способа определения протеолитической активности продолжительность определения сокращается от 1-2 ч до 35 мин. Это создает экономию рабочего времени.

Линейный характер зависимости оптической плотности от концентрации фермента сохраняется.в широком интервале (О, 1-0,8).

Получается высокая точность опреде- ления.

Результаты испытаний методики определения ПА протосубтилина ГЗХ при помощи

2,4,6-тринйтробензопсульфокислоты (1) и о-фталевого .альдегида (2) приведены в таблице.

1. Способ опредвления протеолитичвокой активности ферментов путем измере- ния количества прогидропизованных пеп- 1З тидных связей, включающий подготовку пробы; инкубацию субстрата с ферментом пробы, обработку анализируемой пробы реагентом и спектрофотометрирование, Источники информации, принятья во внимание при экспертизе

1.s.rHoe.ÑÈÅà., 244(41, 1969, 789793.

2. Авторское свидвтельство СССР по заявке No. 2653395, от 15.08.7S.

Составитель Л. Рубинова

Реаектор Н. Кпжтупвнек Техрра М.Тапер Корректор Е. Рожке

Заказ 2055/1 Тираж 505. Поппкокое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская набок д. 4/5

»

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 918305 э

Таким образом, разброс результатов о т л и ч а ю щ и я с я тем, что, с в параллельных определениях ПА соответ- целью сокращения продолжительности оп ствует среднему значению коэффициента ределения, в качестве реагента использу вариации 1,4% для метода, основанного . ют о-фталевый реагент и анализируемую на применении 6-фталевого альдвгида I 5,пробу обрабатывают реагентом при рн .1,6% дпя метода основанйого на приме- 7,5-10. некии 2,4,6- тринитробензопсульфокислоты 2. Способ по п. 1, о т л и ч а юТочность первого метода несколько выше. шийся тем, что в качестве ьфталеве- го реагента используют раствор офтале вого альдвгида в концентрации 0,04Формула изобретения 0,12 мгlмл и меркаитоэтанола в концен.трации 0,2 мгlмл в биратном буфере.