Способ получения молокосвертывающей протеиназы @ @ @ 1-8

Способ получения молокосвертывающей протеиназы @ @ @ 1-8

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ ПРОТЕИНАЗЫ RHIZOFUS PYGMAUES ff-s , предусматрившощий экстракцию культуры продуцента водой и осаждеS я 3 Щ JiJ ние фермента, отличающийс я тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта , осуществляют фракционированное осаждение фермента из экстракта с помощью сульфата аммония, взятого в количестве сначала 0,2-0,3, а затем 0,60-0,85 от степени насыщения, получег ный ферментньй осадок растворяют в воде и подвергают термообработке при 55-60с и рН 3,5-4,0 в присутствии ионов в количестве 0,20-0,25 г.-а./л с последующим диализом, фракционированием на сефадексе G-100 и концентрированием ацетоном в соотношении 1:2. с б

„„SU„„1110801 А

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

auD С 12 Р 9/58 С 12 P 1/845

0ПИСдНИК ИЗ0БРЕТЕНИя1

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛВСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3555437/28-13 (22) 01.12.82 (46) 30.08.84. Бюл. № - 32 (72) Л.В.Антипова и Н.А.Жеребцов (71) Воронежский технологический институт (53) 577. 15 (088. 8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

¹ 732382, кл. С 12 N 9/54, 1980.

2. Авторское свидетельство С СР

¹- 691488, кл. С 12 N 15/00, 1978 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ MOJIOKOCBEPТЬВАЮЩЕЙ ПРОТЕИНАЗЫ RHIZOPUS PYGMAUES

Р -g, предусматривающий экстракцию культуры продуцента водой и осаждение фермента, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта, осуществляют фракционированное осаждение фермента иэ экстракта с помощью сульфата аммония, взятого в количестве сначала 0,2-0,3, а затем 0,60-0,85 от степени насыщения, полученный ферментный осадок растворяют в воде и подвергают термоооработке при 55-60 С и рН 3,5-4,0 в присутствии ионов Са+ в количестве 0,20-0,25 r. — à./ë с последующим диализом, фракционированием на сефадексе С-100 и концентрированием ацетоном в соотношении 1:2.

1110801

Изобретение относится к ферментной промьппленности и предназначено для получения монофермента кислой термоустойчивой протеиназы, обладающей молокосвертывающей активностью.

Известен способ получения протеиназы Bacillus thuringiensis var finitinuis, включающий осаждение протеиназ сульфатом аммония при 0,8-0,9 наеьпцения с последующим диализом и очисткой целевого продукта на сефадексах (1 J.

Однако этот способ характеризуется недостаточной чистотой фермента, большими примесями пигментов, большой длительностью цикла из-за применения нескольких хроматографических методов.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения молокосвертывающей протеиназы Юпзориз pygmaues p„ » предусматривающий экстракцню культуры продуцента водой и осаждение фермента органическими растворителями. В результате получают молокосвертывающую протеиназу с активностью .500000 ед/г (21.. Однако способ характеризуется не—

«30 достаточно высокой удельной активностью получаемого фермента.

Целью изобретения является повьппение удельной активности целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения молокосвертывающей протеиназы Rhizopus

pygmaues р„, предусматривающему -8

40 экстракцию культуры продуцента водой и осаждение фермента, осуществляют фракционированное осаждение фермента из экстракта с помощью сульфата аммония, взятого в количестве сначала

0,2-0,3, а затем 0,60-0,85 от сте45 пени насыщения, полученный ферментный осадок растворяют в воде и подо вергают термообработке при 55-60 С

+Х и рН 3,5-4,0 в присутствии ионов.Са в количестве 0,20-0,25 г-а./л с пос- 50 ледующим диализом, фракционированием на сефадексе G-100 и концентрированием ацетоном в соотношении 1:2.

Выход молокосвертывающего фермента по белку составляет 1,98-2,00Х, удельная активность на единицу белка, в пределах 760-800 ед/мг, степень очистки 65-90 раз.

Способ получения молокосвертывающей протеиназы заключается в следующем.

Воздушно-сухую поверхностную культуру микромицета Rhizopus pygmaues р, известного как активный проду1+и цент кислых протеиназ с молокосвертывающим эффектом, настаивают с дистиллированной водой в соотношении

1:10 при 30 С в течение 1,0-1,5 ч для экстракции ферментов ° Ферментативную вытяжку с содержанием белка

54-56,мг/мл отделяют от нерастворившегося осадка путем фильтрования через складчатый фильтр. Полученную о вытяжку ферментов охлаждают до 4-5 С и вносят сульфат аммония в количество 0,2-0,3 насыщения, вьдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин и отделяют неактивный осадок балластных белков центрифугированием при 4,0-4,5 тыс. об/мин.

Указанные пределы концентрации добавления сульфата аммония установ,лены экспериментально и обеспечивают максимальное удаление неактивных бел, ков. При снижении концентрации менее

0,2 насьпцения не наблюдается эффекта полного удаления балласта. При увеличении концентраций свьнпе 0,3 наблюдаются значительные потери продукта. В центрифугат снова вносят сульфат аммония в количестве 0,60-0,65 насыщения (до конечной концентрации

0,80-0,85 насыщения). Такие пределы

1концентрирующего агента установлены

5 для данного ферментного комплекса экспериментально.При снижении концент-рации ниже этих пределов значительно уменьшается выход молокосвертывающей протеиназы. При повышении концентрации вьппе этих пределов выход целевого продукта не увеличивается, а степень очистки уменьшается, видимо, за счет присутствия большого количества осадителя в активном осадке ° Смесь снова вьдерживают в течение 20 мин для формирования осадка активных ферментов и отделяют его центрифугированием при 4,0-5,0 тыс. об/мин.

Как показали результаты фракционирования полученного препарата методом дискового электрофореза и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, в его состав входят 6 белковых фракций, одна из которых обладает молокосвертывающей активностью и интенсивно гидролизует белки в кислой зоне рН.

Для быстрой инактивации и удаления

1110801

55 сопутствующих ферментов»»олучен»»ьп» препарат растворяют в небольшом количестве д»»стиллнрова»»»»ой воды, доводят рН раствора до 3,5-4,0 с помоо щью НС1, нагревают смесь до 55-60 С и вносят ионы Са в виде соли СаС12

+2 в количестве 0,20-0,25 r. — à,/ë. При этом степень очистки возрастает в

2-3 раза. Экспериментально установлено, что для эффекта полной инактива- 10 ции всех ферментов, за исключением протеиназ, необходимо обязательное сочетание всех трех факторов физикохимического воздействия. Снижение концентрации ионов Са 2ниже указан- !5 ных пределов приводит к снижению степени очистки и уровня инактивации.

Увеличение ее не влияет на выход протеолитического комплекса, а степень очистки снижается из-за загряз- 20 .нения раствора дополнительно вводимой солью СаС12 .

Анализ активности ферментов по-. казал, что после внесения ионов Са и повышениЯ темпеРатУРы до 50 C . про†25 теолитическая активность сохранялась на 100 при полной инактивации липазы и других ферментов. Однако в комплексе сохранялась активная глюкоами-, лаза. Для ее инактивации необходимо З0 поддерживать низкий уровень рН в пределах 3,5-4,0. При этом наблюдается полная инактивация глюкоамилазы при сохранении 90-93Х активности протеолитических ферментов. При увеличении температуры выше указанного предела происходит интенсивная денатурация интересующего фермента, при температуре ниже указанного предела не наблюдается эффекта полной инактивации глюкоамилазы. Аналогичное явление наблюдается и при изменении интервала рН.

Неактивный осадок ферментов отде»ляют центрифугированием при 6,7 тыс. 45 об/мин. Анализ активности центрифугата методом дискового электрофореза показал, что в нем сохраняются две белковые фракции, которые обе активно гидролизуют субстраты в кислой зоне рН, одна из них обладает молокосвертываюшей активностью.

Разделение протеолитических фракций производят следующим образом.

Центрифугат обессоливают проточ— ным диализом в течение суток при

5-4 С..Для фракционирования протеиназ используют метод разделения по признаку молекулярного веса на сефадексе С-100. Элюнрование ведут на колонке размером 1 35 см дистиллированной водой. В результате получают две кислые монопротеиназы, одна из которых (по количественному содержанию в 9 раз большая) обладает молокосвертыванием, а также высокими термо- и кислотдустойчивостью. На последнем этапе очистки проводят концентрирование целевого фермента ацетоном в соотношении 1:2 ° Необходимость разделения протеолитических фракций вызвана тем, что примеси сопутствующих ферментов и, особенно протеолитических, вызывают неспецифический протеолиз субстрата, кроме того, для глубокого исследования, физико-химических свойств и проведения индентификации с эталоном сравнения необходимо получение монофермента.

Пример 1. 10 r воздушносухой культуры Rh.pygmaues р„ настаивают в 100 мл дистиллировайной воды в течение 1,5 ч при 30 С. Смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр.Фильтрат охлаждают до 4 G и вносят 0,2 нась»щения сульфата аммония. Неактивный осадок балластных белков удалют центрифугированием при 4,5 тыс. об/мин. В центрифугат добавляют 0,6 насыщения сульфата аммония (конечное содержание 0,8 насыщения). Активный осадок ферментов отделяют центрифугированием при.

4,5 тыс. об/мин и растворяют в 5мл дистиллированной воды. Затем вносят ионы Са 2 в количестве 0,20 г.-а./л (в виде соли СаС12) доводят рН смеси до 4,0 с помощью ЙС1, нагревают go о

60 С и выдерживают в течение 15 мин.

Неактивный осадок отделяют центрифугированием при 6 тыс. об/мин. Центрифугат обессоливают по известному методу диализа в течение суток при

5 С. Обессоленный раствор собирают количественно и фракционируют объемно по 5 мл на сефалексе С-100. Фракции, обладающие молокосвертывающей активностью, объединяют и концентрируют ацетоном при соотношении 1:2.

Общие данные по результатам получе1ния молокосвертывающей протеиназы представлены в табл. 1.

Пример 2. Ферментную вытяжку воздушно-сухой культуры Rh. pyg

maues р„ s готовят аналогично примеру 1. В фильтрат вносят 0,3 насыщения сульфата аммония, отделяют неак1110801 начало образования сгустка через

40 мин после его внесения в молоко.

Расчет ведут по формуле где 50—

2400—

Технико-экономическая эффективность изобретения состоит в том, что препарат молокосвертывающей протеиназы обладает активностью 710000—

20 750000 ед/г, что более, чем в 7 раз активнее эталона сычужного фермента, применяемого в сыроделии, молокосвер-!

-тывающая активность которого

100 000 ед/г.

Таблица 1

Стадии получения фермента

Выход, 7

Степень очистки молокоБелок, мг/мл

Молокосвертывающая активность ед/мл ферментной вытяжки

По белку По активности удельная ед/мг белка свертывающего фермента

Исходная ферментная вытяжка

54,00 666,6

12,34 0,00

100

100

Фракционирование сульфатом аммония

44,40 2666,6 60,06 4,88

14,8

70,0

Инактивация и удаление сопутствующих ферментов

125,03 10,13

20,00 2500,6

25,8

63,0

9,80 1500,0 153,06 12,40

20,23

Диализ

59,8

Фракционирование на сефадексе

С-100

1,60 400,0

250,0 20,25

9,89

47,8

Концентрирование ацетоном

65,84

0,96 750,0 781,? 5

1,98

29)64

S тивный осадок центрифугированием при 4,5 тыс. об/мин. В центрифугат добавляют 0,55 насыщения сульфата аммония и отделяют активный осадок аналогично пргмеру 1. Затем его растворяют в 5 мл дистиллированной воды, вносят 0,05 м Са+2 (в виде соли СаС1 ), доводят рН среды до

3, 5 с помощью соляной кислоты, нао гревают смесь до 55 С и выдерживают

20 мин. Отделение неактивного осадка, обессоливание, фракционирование и концентрирование молокосвертывающей протеиназы производят так же, как и в примере 1. Данные показаны в табл. 2.

Ферментативную активность определяют на натуральном обезжиренном о молоке при рН 6,5 и 35 С. При внесении фермента регистрируют время начала образования молочного сгустка визуально.

За единицу активности принимают количество фермента, обеспечивающее

2400 50

Ч с объем молока, взятый для анализа, мл; концентрацщг раствора фермента, г/100 мл, объем исследуемого раствора фермента, мл сравнительное время образования сгустка, с.

1110801

Та блица 2

Выход, X

Молокосвертывающая активность

Белок, мг/мл

Стадии получения фермента

По белку По активности ед/мл удельная, ед/мл белка

Исходная ферментная вытяжка

0,00 100 00 100 00

54,00 666,6

12, 34

Фракциониров ание сульфатом аммония 44,50 2700,0 61,00

72,00

15 5

5,0

122,6

150,6

64,0

10э05 26э8

12,52 21,23

59,9

10 3 1500 0 фракциониров ание на сефадексе

-100

1,65 45010

21 ° 3 9,90

47,5

250,0

Концентрирование ацетоном

30,02

1,04 800,0

80,0

2,00

800,3

Составитель О.Скородумова

Техред О.Неце Корректор И.Эрдейи г

Редактор Т.Колб

Заказ 6263/21 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óàãîðîä, ул.Проектная, 4

Инактивация и . удаление сопутствующих ферментов 20,5 2502,5

Степень очистки молокосвертывеющего фермента