Способ получения сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу

Способ получения сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к технологии получения глюкозно-фруктозных сиропов. Цель изобретения - уменьшение образования продуктов распада Сахаров в гидролизате и повышение стабильности фермента в процессе изомеризации . Способ получения сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу, предусматривает пригбтовление крахмаль ной суспензии, ожижение последней при рН 5,2-5,4, последующее ферментативное осахаривание при рН 4-75 и температуре 54-62°С для получения гидролизата, содержащего не более 100 ч./млн. ионов кальция в расчете на массу сухого крахмала и с молярным отношением неферментативно образуемых кетозных Сахаров 0-2 моль на 100 моль гексозных единиц. Для ожижения используют глюкоамилазу, имеющую пониженную зависимость от ионов кальция. Содержание ионов кальция не более 100 ч./млн обеспечивают путем хелатирования избытка кальция перед изомеризацией, Осахаренный раствор подвергают изомеризации при необходимой теьшера туре контактированием его с глюкозоизомеразой, адсорбиг рованной или связанной с ДЕАЕ целлюлозой или анионообменной смолой. 4 з.п. ф-лы., 10 табл. СО t

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3432691/28-13 (22) 26.04.82 (31) 258183 (32) 27.04 ° 81 (33) US (46) 30.12.88. Бюл. Р 48 (71) Набиско Брэндз Инкорпорейтед (US) (72) Луис Херст и Норман Эдвард

JIJI0Ap, (Us) (53) 664.165 (088.8) (56) Патент США У 4025389, кл. 195-31, 1977.

Патент США У 4230802, кл. 435-94, 1980.

Die stirke, том 31 1979, с. 64. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИРОПА, СоДЕРЖАЩЕГО ГЛЮКОЗУ И ФРУКТОЗУ (57) Изобретение относится к технологии получения глюкозно-фруктозных сиропов. Цель изобретения — уменьшение образования продуктов распада сахаров в гидролизате и повышение стабильности фермента в процессе изо„.SU „„14490) 4 A 3 (5Р 4 С 13 К 11/00 С 12 P 19/24 меризации. Способ получения сиропа, содержащего глюкозу и фруктоэу, предусматривает приготовление крахмаль". ной суспензии, ожижение последней при рН 5,2-5,4, последующее ферментативное осахаривание при рН 4-,5 и температуре 54-620С для получения гидролизата, содержащего не более

100 ч./млн. ионов кальция в расчете на массу сухого крахмала и с молярным отношением неферментативно образуемых кетозных сахаров 0-2 моль на

100 моль гексозных единиц. Для ожижения используют глюкоамилаэу, имевщую пониженную зависимость от ионов кальция. Содержание ионов кальция не более 100 ч./млн обеспечивают путем хелатирования избытка кальция перед изомеризацией. Осахаренный раствор подвергают изомеризации при необходимой температуре контактировани,ем его с глюкоэоизомеразой, адсорби» рованной или связанной с ДЕАЕ целлюлозой или анионообменной смолой.

4 з.п. ф-лы., 10 табл.

1449014

Изобретение относится к технологии получения глюкозно-фруктозных сиропов.

Цель изобретения — уменьшение

5 образования продуктов распада сахаров в гидролиэате и повышение стабильности фермента в процессе изомеризации.

Способ получения сиропа, содержа- 1р щего глюкозу и фруктозу, заключается в следующем.

Крахмал, полученный из обычного источника, например влажным измельчением зерна, промывают и Готовят из него водную пульпу — суспензию, содержащую 30-35 сухого крахмального веществл. Предпочтительнее, чтобы суспензия обладала низким ионным содержлllием, т.p He более О,."А сухогo 2О остатка в ниде сульфатированной золы.

В качестве источников крахмала используются клубни или злаковые> включая картофель, тапиоку, пшеницу, сорro и кукурузу. 25

Глюк О зо содержлщий кр лхмлль11ь13! гидролизат может быть получен с помощью кислотно-ферментного г!ро!!со с л или фермент-ферментного процесса. В кислотно-ферментном процессе крл. !лл

ОжнжЛЮт СПЕрВа МЯГКОЙ КИСЛОтиой обработкой, после чего применяют ферме11т для превращения ожиженного крахмлла в глюкозу. В обычном фермент.-ферментном процессе крахмал ожижают обрыботкой 0(-амилазой, после чего применяют глюкоамилазу для превращения ожиженного крахмала в глюкозу ° Предпочтительно использовать фермент-ферментный способ получения крахмального 4О гидролиэата, содержащего глюкозу.

Производство крахмального Гидролизлта, содержащего глюкозу, который не будет подвергаться очистке перед последующей обработкой иммобилизи- 45 ровлнной глюкозной I! so!!epl!.>ой, требу-. ет тщательного контроля услоний реакции во время Ожижения и Ос:. .Hðèâànèÿ, Должгн! применят-„ся такие тгмперлтуры, время реакции и величины рН, чтобы ингибировать образование значительных количеств таких веществ, которые пагубно влияют на стабильность ГлюкозНой ИЗОМЕРЛЗЫ.

Также необходимым является сведение к минимуму содержание ионов кальция при изомеризации субстрата, Некоторые составы g-амилазы требу: т присутствия высокого содержания ионов кальция для достижения активности во время стадии ожижения. В том случае, когда во время ожижения имеется высокая концентрация ионов кальция, то перед изомеризацией следует его удалить из гидролизата. Могут применяться любые известные для этой цели способы, такие как обработка глюкозосодержащей суспензии щавелевой кислотой с последующим фильтрованием ок" салатов кальция.

Поэтому предпочтительнее использовать вид V -амилазы, который не требует высокой концентрации ионов кальция для поддержания активности и термостабильности фермента. Удовлетворительные результаты получаются при использовании Ы-амилазы, производимой Влс111ыэ licheniformis (Ter-, mamyl-60L о(-амилаза, Novo Enzyme

Corp.). >тот фермент отличается высокой термостабильностью и активностью в широком интервале рН, одновре1IeH«o оН имеет пониженную зависимость

Оf 11рн.:утстния ионов кальция. Другим типом подходящей О(-амилаэы, который может быть использован для данной це;1и, являются Tako-Therm (Miles laЬ, Г; 1..ory, Elkhart, indiana) и HiT!!ml ase (Biocon I no., Lexington, Е ". I.IIc ky)

Время, в течение которого Осу11!Ос твляется Ожижение крлхмллл > злВисит От применяемой те!!пер лту;1ь . Если крахмальная суспензия llлгревае f ся при низких температурах н те>leние очень короткого време !ill > т 1. кет

Остаться знл-IHTpль11ОГ ко 11! " 1 so более термоустойчивых чл .Т1111 1.,1;Ixìaлл, которые не будут подне1.1.1 « ся воздействию -лмилазы, клк О требуется для с11ижеиия Глз.: с. 11 суспензии. Приме!!ение низ!;11х з мпс;;:, l yp ожижения, а именно ниже 8013,: 1лл зерНОВОГО Kpn) мл/lл > 11ри330ДИТ Ь 11 у,.1Ов летворител. ным результатам ll 3 >л oc— тлвшегося 1!еж!.3л1ини 3HpoI3B!11111 .! больШОГО КОЛИ !Еотза КРЛХМЛЛЛ И тЛКИМ образом практически неприспособленного к воздействию фермента, В том случае, когда ожижение осуществляется в присутст33ии 0(-амилазы, то применяемые темпе!-.лтуры HP должны быть столь высоки, чтобы пагубно сказаться на активности применяемогo фермента.

Особенно важнь1м Оказывается поддержание таких условий реакции, чтобы

144901

30 во время ожижения и осахаривания не осуществлять химического или неферментативного образования кетосахаров. В частности, условия реакции должны

5 поддерживаться такими, чтобы обеспечить получение гидролизата с концентрацией ионов кальция не более !

00 ч./млн. в основе на массу сухого крахмального вещества и молярным от- ip ношением неферментативно образуемых кетозных сахаров по отношению к гексозам менее 2, Предпочтительно также, чтобы гидролиэат содержал ионы кальция в кон- 15 центрации не более 30 ч./млн и молярное отношение неферментативно образуемых кетосахаров было менее 1.

Молярное отношение выражает количество молей неферментативно производимых 2р кетосахаров на 100 моль гексоз. Поскольку влияние температур, времени и величины рН во время ожижения взаимозависимы, то зти параметры должны контролироваться внутри сравнительно 25 узкого интервала.

Полимерная структура гранулированного крахмала не подвержена сильному воздействию oL,-амилазы до тех пор, пока гранулы не подвергнутся желатинизации. Желатипизация осуществляется при нагревании крахмзла в воде до температурного интервала, при котором гранулы набухают, и силы, связывающие молекулы крахмала

35 вместе, достаточно ослабевают, что вызывает желатинизацию. Поскольку ос -амилаза термочувствительна и имеет тенденцию денатурироваться при температурах вьш е 100 С, то для про- 4р лонгирования эффективного действия фермента для ожижения применяются температуры ниже 100 С. Поскольку о силы, связывающие молекулы крахмала в гранулы, различны по величине, то некоторые гранулы желатинизируются при температурах ниже 100 С и становятся восприимчивыми к действию

М -амилазы, в то время как другие остаются нежелатинизированными и поэтому достаточно устойчивыми к воздействию этого фермента, В результате этого предпочтительно ожижать крахмал M-амилазой в две стадии с очень короткой промежуточной обработкой в автоклаве. Во время первой стадии крахмал частично желатинизируется и ожижается в ограниченной степени с получением частичного гид4 4 ролизата. Целью стадии автоклавирования является дальнейшая желатиниэация гранул крахмала, устойчивых к воздействию обработки на первой стадии ожижения. Крахмальный гидролизат затем разжижают на второй стадии до требуемого уровня.

Ожижение проводят в две стадии при рН в интервале от 5,2 до 5,4 и при температурах желатинизации крахмала, подходящих для ферментативного ожижения крахмала. B случае влажно-измельченного зернового крахмала обычно необходимо доводить величийу рН до требуемого диапазона ожижения. Соединения кальция, как например гашеная известь или карбонат кальция, обычно используют для доведения величины рН на стадии ожижения с(-амилазой, особенно в реакциях, где применяются 0(-амилазные составы, зависящие от кальция. Поскольку кальций отрицательно влияет на активн сть глюкозной иэомеразы, то предпочтительно избегать избыточного добавления источника ионов кальция к гипролизату. Однако если ионы кальция ксе-же добавлены, то их следует удалить до стадии изомеризации.

Хотя существует целый ряд веществ, которые могут устанавливать необходимую величину рН во время стадии ожижения, однако предпочтительнее использовать для этой цели растворимые соединения магния, поскольку глюкозные изомеразы, выделенные из многих микроорганизмов, требуют магний для оптимизации их активности.

Количество эС-амилазы, введенной в пульпу, зависит от набора факторов, однако обычно определяется по активности ферментативного состава, концентрации крахмала в пульпе и степени требуемой амилолитической конверсии. Обычно в системе двухстадийного ожижения BBAд т на вторую стадию такое же количеств или несколько меньшееМ-амилазы, чем на первую стадию. Когда между стадиями осуществляют автаклазирование, то остаточная активность M-амилаэы на первой стадии практически разрушается. Обычно на первой стадии добавляется Ь-10 ед. Сс -эмплазной активности на 1 r сухого крахмала и 510 ед. íà i г сухого крахмала на второй стадии ожижения.

5 14

Применяемые температуры ожижения на обоих стадиях предпочтительно ниже 100 С, более предпочтительными являются температуры в интервале о

82-95 С и наиболее предпочтительным оказывается диапазон между 84 и

88 С. При ожижении при температурах о внутри вьппеуказанных интервалов удовлетворительные результаты достигаются при нагревании в течение

1-3 ч.

Первая стадия ожижения обеспечивает получение частичного гидролизата со степенью упругости от около

6 до около 12. После первой стадии ожижения пульпу можно подвергнуть автоклавиой обработке для получения частичного гидролизата, который практически свободен от нсжелатинизированного крахмала. Более продолжительное воздействие на частично ожиженный крахмал в автоклаве приводит к образованию веществ, которые

- нежелательны для глюкоэной изомеразы и которые необходимо удалять перед стадией изомеризации для удлинения срока действия фермента. Таким образом, время автоклавирования и температура не должны превышать 2 мин и 160 С соответственно. Предпочтительнее проводить автокланирование прн температуре около 125 С и продолжио тельности 1 мин.

Поскольку 0 -амилаза, присутствующая на первой стадии ожижения, практически инактивируется за время автоклавной обработки, то необходимо ввести дополнительное количество фермента на вторую стадию ожижения.

Обычно вводимое количество о(-амилазы на второй стадии приблизительно равно тому, которое применялось на первой стадии. Во время второй стадии практически все желатинизированные гранулы крахмала готовы взаимодействовать с ферментом в тех же условиях с образованием уточненного гидролиэата, имеющего степень упругости от 14 до 20, и который практически свободен от исходного непрореагировавшего крахмала. Обычный гидролизат имеет степень упругости около 16.

Ожиженный крахмальный состав затем обрабатывают глюкогенным ферментом при подходящих условиях для ферментативного превращения частично гидролизованного крахмала в глюкозу. Обычно фермент, применяемый для этой це49014 6 ли, представляет собой глюкоамилаэу

55 (также обозначаемый как амилоглюкози" даза, глюкоамилаза, глюкогенный фермент и т.д.). Глюкоамилаза, вырабатываемая рядом микроорганизмов, представляет собой экзо-амилолитический фермент, который катализирует последовательный гидролиз глюкозных частей из невосстановленных концов крахмала или амилодекстриновых молекул.

Среди микроорганизмов, производящих глюкоамилазу, имеются определенные штаммы грибков, относящихся к роду

Aspergillus, штаммы рода Rhizopus u штаммы рода Endomyces.

Осахаривание ожиженного крахмального состава осуществляют в условиях, которые приводят к высокой степени превращения крахмала в глюкозу.

Предпочтительно, чтобы гидролизат содержал более 92Х глюкозы и более предпочтительно, чтобы содержание глюкозы было более 947. Условия также должны быть такими, чтобы не промотировать повторный синтез олигосахаридов из молекул освобожденной глюкозы, как это известно случается при реакциях осахаривания с использованием глюкоамилазы.

Обработку глюкоамилазой осуществя пот при разбавлении ожиженной крахмальной суспенэии, если это необходимо, до содержания твердых веществ около ЗОБ и достижений рН реакционной среды от 4,0 до около 5,0, предпочтительно рН 4,6. Затем добавляют достаточное количество глюкоамилазног0 состава для обеспечения от

0,12 до 0,30 глюкоамилазных единиц на 1 r сухого крахмального субстрата, после чего суспензию нагревают до температуры 54-62 С в течение времени, достаточного для получения необходимой степени конверсии, Предпочтительным является период от около 58 до около 60 ч для обработки суспензии гидролизованного крахмала.

Для получения субстрата, пригодногс для изомеризации, гидролиэат затем фильтруют для удаления некрахмального остатка и фильтрат предпочтительнее упаривают до около 50Х сухого вещества. Может быть добавлена растворимая соль или соли, являющиеся активаторами глюкозной изомеразы„ к концентрированному гидролизату, после чего уровень рН

7 14 доводят от 7 О до 8,5 добавлением раствора гид1.оокиси натрия. Обычно гидролизат нагревают до температуры 50-70 С и выдерживают н течение о

20-60 мин, после чего осадок отфильтровывают и удаляют сусгендированные твердые вещества, которые могли образоваться при более высоких уровнях рН. Предпочтительными условиями является нагреняние при температуре около 60 С и выдержка н течение около 30 мин перед стадией повторного фильтрования. Следует избегать более продолжительного нагревания осахаренного раствора или нагревание при температурах выше

70< С до стадии изомерчзации и особенно не следует доводить значение рН в щелочную область. В щелочных условиях такое нагревание гидролизата перед его изомеризацией может привести к разложению вещества и образованию продуктов, которые подавляют активность глюкозной изомеразы.

Изомеризацил неочищенного субстрата преимущественно проводится в непрерывном режиме путем пропускания субстрата прн подходящих условиях через колонну или колонны, содержащие слои иммобилиэованной глюкозной изомеразы.

Таким образом, при поддержании условий ожиження н осахяривяния для минимального производства неферментативно получаемых кетосахярон происходит максимальное превращение крахмала в глюкозу. Также в результате поддержания низкого содержания золы в исходной крах <яльной пульпе и an время последователь ных стадий процесса потребуется меньшая емкость ион-обменной смолы для деминерализацип коне«ногn гпюкозно-фруктозного продукта °

Декстрозный эквивалент.

Декстрозпый эквивалент (ДЕ) обозначает концентрацию присутствующих редуцирующих сахаров таких, как декстроза, н рассчитанных кяк процент от сухого вещества. Определяется с помощью методики Е-26, описанной в

"Standard Analytical Methods of the

Member Companies of Corn Industry

Research Foundation, Хпс. "1001, Connecticut Ave, N.W. Washington, D.С. 20036.

49014 8

Активность бактериологической

0(- а мила з ы.

Активность составов бактериологической О<-амилазы определяют с помощью модифициронанной стандартной методики испытаний ААТСС 103-1965 "Bacterial Alpha Amylase Enzyme Used in Desizing, Assay, of" опубликованной в

10 1967 году издательством Технической

Документации Американской Ассоциации

Текстильных Химиков и Химиков-красителей, т. 43, с. В-174,и В-175.

Модификации этого опубликованного

15 теста заключаются в следующем.

Буфферный раствор крахмального субстрата приготовляют растворением

25,3 г сухого едкого натра и 340 r сухого гранулированного калийдигидро20 фосфата н воде и рязбавлением раствора до 2 л.

К охлажденному и растертому в пасту крахмальному субстрату добавляют

1?5 мл буферного раствора, после чего субстрат доводят до 500 мл обьема, Определяют величину рН крахмального суб< трата и при необходимости величину рН доводят до 6,20 0,05.

30 0,025 Г1 раствор хлорида кальция используют для разбавления образца фермента. Его готовят растворением

<1,1 г безводного гранулировачного хлоридя кальция в воде и доведением

35 жидкости до объема в 4 л. формула перевода единиц - ВЛИ в пик>.<офо«ь<:

ВАИк2,65 = пикнофоны, 40 Активность глюкоамилазы, Единицы активности глюкоямилазы (СИ) обозначают количество фермента, .

15 нижеописанной методике.

10 мл 10K-!

1 мл глюкоамилязногп раствора, содержащего 0,03-0,15 СИ, добавляют в реактор и перемешивают содержимое, после чего смесь ncòaâ.-<ÿ!?ò стоять в течение 1 ч при 60ОС. В конце первого часа периода инкубации воздействие фермента прекращают добавлением пред9 14 варительно определенного объема 1 М раствора едкого натра так, чтобы довести величину рН до 8,5-10,5.

После этого смесь охлаждают до комнатной температуры.

Полученный таким образом образец гидролиэата объемом в 2,5 мл переносят в 25 мл раствора Фелинга, приготовленного как описано в случае определения ДЕ. Смесь затем нагревают до кипения и оттитровывают стандартным декстрозным раствором, содержащим 5 г декстрозы на 1 л, приготовленным в соответствии с методикой определения ДЕ. Контрольную смесь готовят и оттитровывают аналогичным образом как и для образца вьппеуказанного гидролиэата за исключением того, что к субстрату добавляют 1 мл раствора глюкоамилаэы после одночасовой инкубации и после добавления раствора едкого натра. Активность глюкоамилаэы рассчитывают следующим образом

GH С-А

0 002 Ч вЂ” ——

r W где Ч вЂ” общий объем образца гидролиэата (обычно 11,2 мл),мл, С вЂ” объем стандартного декстрозного раствора, применяемого для титрования контрольной смеси, мл, А — объем стандартного декстроэного раствора, применяемого для титрования образца гидролиэата, мл, W — масса фермента на 1 мл разбавленного ферментного раствора.

49014

5

65оС этот раствор имеет рН около 7,0, Колбу помещают на водяную баню при

65 С и встряхивают в течение 1 ч.

Смесь затем отфильтровывают в вакууме через 45-миллиметровую грубую керамическую воронку, набитую стекловолокном, предварительно покрытым

1 г ускорителя фильтрования. Колбу и фермент Промывают небольшой аликвотой по 100 мл 100 мМ буферного раствора THAM (pH 7,6).

Промытый фермент переносят в 250миллиметровую колбу, содержащую

125 мл раствора декстрозы (предварительно нагретого до 65 С). Промытый фермент затем количественно промывают внутри колбы 10 мл 1О мМ раствора THAN буфера (рН 7,8), после чего колбу встряхивают 60 мин. Затем добавляют 12,0 мл ледяной уксусной кислоты и подкисленный раствор встряхивают еще 15 мин. Смесь отфильтровывают под вакуумом через 45-миллиметровый керамический фильтр со стекловолокном, покрытым предварительно

1 r ускорителя фильтрования. Колбу и содержимое воронки промывают деминерализованной водой до тех пор, пока не соберут около 400 мл фильтрата.

Фильтрат охлаждают до 25 С и разбавляют до 500 мл. Оптическое вращение раствора определяют в 2-дециметровой кювете при 25 С и обозначают Rg. Холостой опыт проводят аналогичным образом за исключением того, что не добавляют фермента. Оптическое вращение в холостом опыте определяют также при 25 С и обозначают как К .

Степень изомеризации рассчитывают с помощью следующего соотношения

Активность иммобилизированной иэо" меразы.

Активность иммобилизированной изомеразы определяют согласно следующей методики, Образец иммобилизированной изомеразы, содержащий 1400-2200 ICTH, взвешивают. Этот образец промывают в

250-миллиметровой колбе 125 мл декстроэного раствора (предварительно нагретого до 65 C) и 10 мл О,1 М раствора трис-(гидроксиметил) аминометана (THAM) с рН 7,8, Образец декстрозного раствора содержит 3,33 М декстрозы, 20 мИ сульфата магния, 10 мИ сульфита натрия, 100 мМ ТНАИ и

1 мИ хлорида кобальта (рН 7,8). При

55 где с(— изменение удельного вращения, когда фруктоза полностью превращается в декстрозу, Cp — концентрация сахара в растворе (0,15 г/мл), 1 — длина поляриметрической трубки (2 дм).

Фиксированные единицы активности (ГАИ) изомеразы рассчитывают следующим образом

FAH/г = IC/Кр tW, где К вЂ” константа скорости реакции (1,21 1 ч " ГАИ мг глюкозы), 14490! 4

d 1ОО

К

1.(ы ) -(<

25

-$6934tà

K Et ° е

CR

45 ln(Ее

Ie где I

lo — — -) I

50 где F

ll — время реакции, ч (1 ч), W — масса образца, г, С вЂ” начальная концентрация на

125 мл реакционной смеси

Д Д(й+Д)+Iã(é I)

К К

Е С е где I — степень иэомеризации

1 моля фруктозы при равновесии (0,513), I — степень изомеризации в молярной фракции фруктозы, С„, — начальная молярная концентt рация глюкозы (3,33 M)j

К вЂ” константа Михаэлиса для

5 глюкозы (О, 7 М)

К вЂ” константа Михаэлиса для

Г фруктозы (1,43 M).

Одна ИСТИ равна 15,8 РАИ.

IGIH — зто сокращение Международной Единицы Глюкозной Изомераэы и составляет количество фермента, которое превратит 1 микромоль глюкозы во фруктозу в 1 мин в растворе, предварительно содержащем 2 моль глюкозы в 1 л, 0,02 моль сульфата магния и

0,001 моль хлорида кобальта в 1 л раствора при рН 6,84-6,85 (0,2 M малеат натрия) и при 60 С. Определение глюкозной изомеразы осуществляют с помощью способа, описанного

N.Е.Ллойдом и др. в журнале Cereal

Chem, 49, У 5, стр. 544-553 (1972).

Определение сахаридов.

Анализы гидролизатов глюкозы, фруктозы, мальтозы и других сахаридов осуществляют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Методика описана в Standard

Analytical Methods, Corn Refiner s

Association, Inc, Method Е-61.

Степень иэомеризации (Х фруктозы).

Процент фруктозы, получаемый в результате изомериэации, определяют следующим образом.

Аликвоту в 5 мл субстрата (неочищенного гидролиэата до его изомеризации) переносят пипеткой в 100-миллиметровую мерную колбу и разбавляют деионизированной водой до концентрации около 2,5 r сух. го вещества в 100 мл раствора. Аликвоту в

5 мл жидкости, вытекающей иэ колонны, содержащей иммобилиэованную глюкозную изомераэу, через которую протекает субстрат, также разбавляют деионизированной водой. Для разбав12 (75,000 мг глюкозы), мг, I — выражение, определяемое следующим образом: дп(---- — ) — I I(-- — Д), де К

I,--I sК ленных субстратов и стока из колонны определяют оптическое вращение.

Константу (К) вычисляют следующим образом где d — разбавление = 20, д — длина поляриметрической кюветы 0,2000 дм, 20 Г 1 Г (

169,3 ;

К = 59,08.

Отсюда 7 фруктозы в сухом весе

59,08(oLs-ы )/C, где о — наблюдаемое вращение субстрата, o(i - наблюдаемое вращение стока иэ колонны, С вЂ” количество сухого вещества

35 в 1 мл субстрата, г.

Определение стабильности глюкозной иэомераэы.

Определение скорости реакции (К) и периода полураспада фермента (®).

Стабильность или период полураспада фермента реакций изомериэации определяли соответствующим уравнением степень иэомеризации в поступающем в реактор потоке, F/(F + С); масса фракции фруктозы в расчете на общую массу сухого углеводного субстрата, масса фракции глюкозы в расчете на общую массу сухого углеводного субстрата; степень иэомеризации в выходящем иэ реактора стоке, F/(F/G);

13 1449014

I — величина 1 при равновесии, 0,5 14 при 65 С при 0,505 гри

60 С, К вЂ” константа скорости начальной

1 -!, 5 реакции, г (F+G} ч ° IGIH

Et — активность фермента, IGIH;

С вЂ” концентрация субстрата, глюкоза, г/мл, .

R — скорость !!отока, мл/ч, 10 — период пол;распада фермента, ч; — время работы реактора, ч.

Величины К вЂ” константу скорости начальной реакции и величину ь можно рассчитать, преобразуя вышеуказанное уравнение в следующую форму:

55,1р- In Kl Et

j r я В !! -- ----= ) = 1Оц ----- — О, 301 02 t/о ге

Завис !мость графика логарифма (I„ - IÄ 1

Rln(†-- †"-)g отиосительис времени

Те Е равно -0,30 102/с,, следовательно величина с = О, 10102/наклои, 11нтерполируя ai. и ииу (Х по времени О, из графика можнс- получить

lo

1, n. (--"-------)

1,, — I

"з (и:> : ы l! IIojI c кс111с1ст!! 11еа кц!!У! К

1 а 1 . uop

Гь

Вели чина начал!:,иой скорости реакции (i:. ) и фактор, выражающий период полураспада фермента (с), обеспечивают подходящее указание общей эффективности всего процесса. Чем выше наче !ие, получаемое для К с, тем больше эффективность всего процесса и терминах скорости превращения гг!юкозы во фруктс1зу и воздейств!!е всего п1 оцесса на пер!!од полураспада применяемого фермента.

11 р и м е р 1 ° 11!!лн!стрирует предлагаемый способ в непрерывном режиме, Показана высокая стабильность глюкоизомеразы, которая достигается при осуще.твлении пред-!агаемого способа, Глюкоизомераза, использованная в этом и последующих примерах, иммобилизирована »a EAE целлюлозе.

Зерновой крахмал, выделенный иэ зерна при мокром помоле, промывают деионизированной водой и получают таким образом пульпу с содержанием

50 сухого вещества крахмала 337. р11 пульпы доводят до 5,2 добавлс-нием

Mg0 и достаточного количества амилазы (Termamyl-601.), чтобы создать активностью,-амилазы на 1 г сухого крахмала 7 ед. Пульпу помещают в змеевик из нержавеющей стали о и выдерживают при 86 С в течение

2,5 ч. После этой первой стадии термообработки пульпу перекачивают в другой змеевик при температуре в о интервале 11 5-1 30 С и давле нии 3, 57,0 кг/см в течение приблизительно

1 мии. Затем пульпу охлаждают до темо пературы приблизительно 36 С, добавляют такое же количество ос -амилазы, как и на первой стадии термообработки, и иаправля!от пульпу на третью стадию термообработки. В этом змеевике, характеристики которого совпадают с характеристиками первого змеевика, пульпу выдерживают при о

86 С в течение 2 ч.

Ожижеииый крахмал разбавляют до содс!ржав!!я твердого вещества ЗОХ деиоиизирсваиной водой и подвергают с!сахар!!в;!и!ио в многоступенчатой системе реакторов, представляющих собой ре рвуары с мешалками. Лобавляют уск р! тель фильтрования (Р са11.се

С! -175, GREFCO, INC) в количестве

1.: :а cyõoå вещество, и затеtl,loUoäÿò р1Г цо 4, 5 добавлением 11С1. Ожи;.еииый кр:!хмальиый состав помещают и !. ервый реактор в реакш!оииой системе, добавляют достато !jloe количесTI о глюкоамилазы (AI1G-150, Ва сЬ Sn 3075, Novo Enzyme Corp.) с тем, что .ы концентрация едиш:ц глюкоам!!лазы (GH) составляла 0,27 иа 1 г сухого крахмала. Содержимое реактора нагревают о до 58 С и зате!! порциямн пропускают через семь дополнительных ре;!кторов при той же гемиературе. Сред !ее время пребывания в каж l,îì реакторс составляет 7,5 ч. В конце и!!кла осахаривания проду},т реакции илн раствор пропускают через Аильгр, предвари гельно покрытый ускорителем фильтрования при пониженном давлении, 254 мм рт.ст. для удаления любых присутствующих некрахмальиых ooòaòêoâ.

Для получения вещества, пригодного для изомеризации с глюкозоизомеразой, раствор концентрируют до содержания сухого вещества приблизи- тельно 507. в непрерывном испарителе. о

Сначала раствор нагревают до 86 С

19 14490 фильтровывают и фильтрат доводят до содержания М8(НБО ) 0,0025 М. рН этого субстрата доводят до 6,0 с помощью MgO, а затем до 7,8 с помощью

NaOH. Субстрат С готовят, растворяя

5 достаточное количество кристалличесI кой декстрозы в деионизированной воде, при этом получают раствор, содержащий 50% сухой декстрозы. РасчВор дОвОдят до сОдержания Mg(HSO>)

0,0025 М и рН 6,0 с помощью MgO, a затем до рН 7,8 с помощью NaOH.

Т а б л и 1, а

Влияние условий ожижения и состав сахаризованных субст о ахариваиил . ;(pат0II I! устс :: (! т.. глюкоз оиз омера: ы (убс I p !

11оказ ате!Иь (А) 9r. 8

96 (j

Глюкоза, % сухой массы 96,6

Мальтоза, % сухой массы (О,, Кетоза, молярное отношение

0 (! (0.0

O 15

Константа скорости, К ь

0,022

0,025 д 02 с !

Период полураспада фермента, .

58 .

470

7000

Эффективность фер+4 мента, с. К

10,1 14,7

17,4 г (G+F) IGIH ч г (G+I ) IGIH

<: (II:IIõ тем!!ерату!!Их 3I т;кла»и1(О1»иия т. е, при ус!1(!!иь .-.- . г !!(ч!!(! с!няза»!Иых

5п с испол»зов« (!!(!., x. («. (р п..!учен ной из В.»ubti11:, .-"..: —.: Ть(;-еакции изоысри. -(и, и.- . .Ова! Ис.м кристялли!!есе!(è i!! . РОЛИ! ., еа i! ст— ве субстрата указ!! .-! - а .о,;то этОт матер!(3 Ие бь"1 I;;-ли" стью свободе!. от вещее,(, !(Ода;-: !(!юшин

«1К1 IBHOCTh 1 «IIG!,«> 3 3 И Р.":(. P«131! И таКИМ образОм, по31(0 i ю; ещ«ра - !!ОдчеркЗатем субстраты подвергают изомеризации пропусканием их через стеклянные колонки, оборудованные

Даннь(е табл. 3 свидетельствуют о том, что наивысшая устойчивость ферме»то» и эффективность конверсии достигается в том случае, когда неочищенный! субстрат содержит малое количество мальтулозы. Существенно более низкие значения для устойчивости и эффективности получаются при использовании неочищенного субстрата В, содержащего большее количество мальтулозы и приготовленного при более высоких значениях рН и вы14 20 рубашкой при 65 С. Каждая содержит около 800 10111 иммобилизованной глюкоизомеразы. Субстраты »водят в колонки сверху вниз при скорости потока 0,3 мл/мин. Изомеризацию осуществляют непрерывно а протяжении 17 дней. Ежедневно тбирают образцы субстратов и растворов, выходящих из колонки, с целью определения концентраций фруктозы и глюкозы в суб-. тратах и вычисляют кинетические параметры реах!Пьй изомеризации, Ни субстрат А, ьи! субстрат В не подвергают процессам с«!!стки перед oc) ществУ1е!!ием изомеризац!(и.

Результагь! приведены в таол.3, 1 а.блица 4

Показатель

Вторая стадия

Первая стадия

Количество фермента (ликвофоны eL-амилаэы Г 688) 8 о

Температура, С 86

Время; ч

295

2,0

П р и м е ч а н и е. Время автоклавирования между стадиями 1 мин. енных, образцов Растворы анализируют на содержание использованием глюкозы и мальтозы и молярное отноа (АИО-150 Batch шение кетосахаров. ц а 5

Таб ли

Влияние рН ожнжения и температуры автоклавирования на стабильность глюкозной изомераэы и на эффективность превращения

J ч»

Иэомеризация субстрата

Варьируемые параметры ожижения

Эффективность фермента, К, и

g 6

Период полураспада, с Образец

Мальтулоза, Х сухого в-ва

Температура автоклавирова0 ния, С

Глюкоза, Кетоза, Х сухо- молярное

ro в-sa отношение

125 а0,05 95,8 (0,025 577

160 О, 18 95, 3 0,09 456

13,2

5,2

10,1

5,2

21 14490 нуть важность условий, при которых готовится неочишенный субстрат.

П р н м е р 3. Иллюстрирует влияние рН и температуры автоклави5 рования, используемых во время окикения крахмала, на стабильность изомериэукщих ферментов н на эффективность реакции конверсии.

Пять одинаковых образцов зернового 1р крахмала (ЗЗХ сухого вещества) ymТ

20 Jl каждого Hs OKER крахмала осахаривали с глюкоамилаэного состав

SN 3068, Novo Ensyme Corp.) при концентрации 0,41 СИ г dss. Образцыдово, дят до рН 4,3 и нагревают при 58 С в течение 32 ч. Осахаренвые растворы отфильтровывают и упаривают до содержания сухого вещества 50Х рН доводят до 6,5 с помощью М80, Затем в каждом образце создают концентрацию И8(Н$0 )

0,0025 M и наконец доводят рН до 7,8 (определено при 25 С) с помощью NaOH.

14. 22 кают, используя Termamy 1-60L са -амнлазу по двухстадийному способу прн различных значениях рН и условиях автоклавнрования.

Образцы ожижают при условиях (продолжительности, температуре, содержании фермента), приведенных в табл,4.

Неочищенные растворы изомериэуют пропусканием через стеклянные колоно

«и, находящиеся при 60 С и содержащие иммобилизованную глюкозоизомеразу при скорости потока 0,3 мл/мнн

Общая активность фермента в каждой колонке составляет 800 АСТИ.

Результаты изомериэации приведены в табл.5.

Та блица

Непрерывный процесс ферментативной изомернэацйи гидролиэатов, влияние на стабильность фермента

Реактор (в серии) Ео Время (IGEH) иэомеризации, ч

КонстанПериод полураспада,, ч

Эффективность ферменл+ та, К>с та скок рости, К

2300

720

0,160 810

О, 150 1000

О, 160 1140

0,160 1060

0,159 1030

13,0

1320

2 3075

3 4150

4 5000

5 6000

15 0

1320

18,2

1320

17,0

600

16,4

Средние 0,158 1030 значения

16,3 г (G+F) IGIH ° ч г (G+F) IGIH

«кg

Реактор 1 убрали из начальной позиции в цепи через

720 ч работы и после этого в конец цепи установили реактор 5.

44,3

51,6

Фруктоза, Х

Глюкоза, Х

DP, (включает ди- и полисаха15 14490 и вьщерлсивают при этой температуре в течение 4 мин, затем осуществляют о упаривание при 58 С и давлении

625 мм рт.ст. Добавляют Mg(HSO>)< в таком количестве,.чтобы концентрация его составляла 0,002 моль, затем доводят рН раствора до 7,8 (определено при 255С) раствором NaOH. Затем раствор перекачивают через смеситель- 10 ный змеевик и фильтр с фнльтровальной бумагой при 58 С.

Изомериэацию осуществляют, перекачивая отфильтрованный субстрат через четыре реактора со слоями катализато- 16 ра соединенных сериями, и находящих1 о ся при 60 С. Реакторы представляют собой стеклянные колонки диаметром

2,54 см и длиной 15,24 см, содержащие переменные количества иммобилизованной

Периодический анализ изомеризованного раствора дает следующие значения в расчете на массу сухого вещества:

14 16 глюкозоиэомераэы. Количество глюкоэоизомераэной активности в каждом реактора изменяется в пределах от 2,300 до 5,000 IGIH. Реакторы работают следующим образом. Отработанные реакторы, стоящие в начале цепи, удаляются и заменяются чистыми реакторами, стоящими в конце цепи. Изомеризацию осуществляют при скорости введения потока 2,4 мл вещества в 1 мин, при этом концентрация фруктозы в конечном вытекающем потоке составляет 42-46Х.

После завершения времени пребывания в каждом реакторе отбирают пробу вытекаюЩего потока для получения сравнительных данных.

Результаты изомеризации неочищенного гидролизата представлены в табл.1.

1449014

18 риды), Ж 4,1

Кальций, ч/млн - 30

Оульфатированная зола, Х 0,28

Сухое вещество, Х 48,6

Приведенные данные, а также данные, приведенные в табл.1, указывают, что глюкозно-фруктозный сироп, содержащий большой процент фрук- 10 тозы, можно получить, подвергая неочищенный крахмальный гидролизат, полученный при описанных условиях, изомеризации с иммобилиэованной глюкозоизомеразой. Эти данные ука- 15 зывают также, что при описанных условиях ферменты имеют высокую устойчивость или период полужизни (а} и высокую степень ферментной активности (К .). 20

Пример 2. Иллюстрирует действие различных условий на ожижение и осахаривание крахмала, на образование неферментно полученных кетоэосахаров в глюкозосодержащем субстрате и на устойчивость глюкозоизомеразы, используемой для изомеризации глюкозы в фруктоэу.

Крахмал ожижают в отдельных опытах, в одном иэ которых используют ЗО

at-амилазный состав, полученный из