Способ изомеризации глюкозы во фруктозу

Способ изомеризации глюкозы во фруктозу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к производству фруктозы путем ферментивной изомеризации глюкозы. Цель изобретения заключается в уменьшении образования псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышение содержания фруктозы в растворе. Способ изомеризации глюкозы во фруктозу предусматривает контактирование исходного раствора с содержанием 40-50 мас.% глюкозы, например гидролизата крахмала, с термически стабилизированной глюкозоизомеразой при PH 6,0-7,0. Процесс изомеризации проводят при 90-115°С мин до превращения по крайней мере 54-58% глюкозы во фруктозу. Для изомеризации глюкозы следует использовать химически стабилизированную глюкозоизомеразу. 1 з.п. ф-лы, 11 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (1!) (51) 4. С 13 К 11 00

6ЛИШЩ

Ю.":;1 3; =. ;".ИЩЦ

, л Б:1Л С I Е г А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

> (ф4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3615602/30-13; 3612252/30-13 (22) 30.06.83 (31) 393848; 393845 (32) 30.06.82 (33) US (46) 15.11.89. Бюл. Ф 42 (71) Набиско Брэндэ, Инк. (US) (72) Норман Е.Ллойд и Роберт

О.Хорват (US) (53) 664.165(088.8) (56) Патент США У 23821082, кл. 195-31, 1974.

Патент США У 4308349, кл. 435-94, 1981.

Патент США - 3956066, кл. 195-31, 1976. (54) СПОСОБ ИЗ01ПРИЗАЦИИ ГЛ10КОЗЫ

ВО ФРУКТОЗУ (57) Изобретение относится к проиэИзобретение относится к производству фруктозы путем ферментативной изомериэации глюкозы.

Цель изобретения — уменьшение образования псикозы и других несахаров в процессе иэомеризации и повышение содержания фруктозы в растворе.

Способ иэомериэации глюкозы во, фруктоэу заключается в следующем.

В качестве исходного раствора используют раствор, содержащий 4050 мас.% глюкозы, например гидроли. зат крахмала. Предпочтительными являются ферментативные способы получения гидролизатов, содержащих глюкозу.

Наиболее предпочтительными являются способы, которые используют соводству фруктозы путем ферментативной иэомеризации глюкозы. Цель изобретения заключается в уменьшении образования псикоэы и других несахаров в процессе изомериэации и повышение содержания фруктозы в растворе. Способ иэомериэации глюкоэы.во фруктозу предусматривает контактирование исходного раствора с содержанием

40-50 мас.% глюкозы, например гидролиэата крахмала, с термически стабилизированной .глюкоэоиэомераэой при рН 6,0-7,0. Процесс изомериэации проводят при 90-115 С в течение 1025 мин до превращения по крайней мере 54-58Х глюкозы во фруктозу. Для иэомериэации глюкозы следует использовать химически стабилизированную глюкозоизомеразу. 1 з.п. ф-лы>

11 табл. четание ферментов, например глюкоамилазы и фермента, отщепляюшего боковые цепи. Особенно предпочтительными являются сочетания ферментов, спо собных одновременно превращать ожиженный крахмал в глюкозу плюс фрук тозу, например сочетание глюкоамилазы, пуллуланазы и глюкоизомераэы.

Этот способ дает возможность получить иэомеризованные гидролизаты, . . содержащие 48Х фруктозы и 50Х глюкозы в расчете на сухую массу, ко:торые идеально подходят для дальнейшего превращения до 53-60Х фруктозы по предлагаемому способу. Можно . также использовать мембранный процесс для удаления полисахарида иэ

1523056

55 гидролизата крахмала, получая фракции, содержащие глюкозы более 99Х, что является идеальным исходньм материалом для предлагаемого способа, Растворы глюкозы, полученные кристаллизацией из гидролизатов крахмала, также являются исходным материалом.

Глюкозные и/или глюкоза-фруктоэные растворы, которые используют в качестве исходных материалов, нужно предпочтительно очищать, на какойлибо стадии их получения во избежание вредного воздействия неуглеводных примесей на глюкозоизомеразу .и для минимизации окрашивания во время температурной иэомеризации по предлагаемому способу. Можно использовать неочищенные гидролиэаты крахмала, однако, при условии, что будут выполнены условия их получения, описанные,в патенте CllJA N- 4376824.

В случае использования раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата для предлагаемого способа, можно также использовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризована во фруктозу. Так, например, раствор иэомеризованной глюкозы, содержащий вплоть до 52Х фруктозы, можно обработать предлагаемым способом для повышения концентрации фруктозы до более желательного уровня выше 52Х, и предпочтительно до уровней 55-56Х и выше.

Растворы глюкозы,. содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.X от углеводородов, можно получить известными способами.

В качестве средства для предотвращения избыточного окрашивания во время высокотемпературной изомеризации можно добавить к глюкознофруктоэному сырьевому раствору вещества, образующие бисульфит. Предпочтительно исключить кислород из всех растворов, которые могут контактировать с глюкозоиэомеразой во время высокотемпературной реакции иэомеризации для того, чтобы свести к минимуму любое окисление фермента, которое могло бы привести к инактивации..

Глюкозоизомеразу, которую используют в качестве фермента или как источник фермента для химической стабилизации, можно выделить иэ известных микроорганизмов, вырабатывающих

35 глюкоэоиэомераэу, включая: Streptoшусея flavorires, Streptomycea.

achromogenes, Streptomyces echina»

tus, Streptomycea alЪия, Streptomyсея vedmorensis, Streptomyces.pha-

rochromogenes, Streptomyces, bobiliae, Streptomyces olivochromogenes Streptomycea епеяие1ае, АсгоЪас1ег acrogenea АсгоЪас1ег cloacae, Bacillus

coagulans Вас х11ия megat,er ium Bacillus fructosus, Acetobacter oxydans, Acetobacter яиЪохуйапя, Acetobacter roseus, Acetobacter melanogenus, Lactobacillua fermenti, Lacto bacillus brevis, LactoЪас 11ия 8а оnii, Lactobàñil1us lycopersici, Lactobacillus mannitopoeus, Lactobàñi1lus pentoaceticus, Paeudomonas Ы6rophilia, Brevibacterium pentaaminoac dicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesentегоidea, Paracolobactrum aегоgenoides.

Кроме того, можно использовать глюкоизомеразу, которую вырабатывают род БосагЖа, Micromonospora, MicroЪiярога, Microelloboapora u

Arthrobacter streptomyces вид АТСС

21175. Она является прекрасным источником глюкоэоизомеразы для использования в предлагаемом способе.

Кроме того, можно использовать глю I козоизомераэу,которая обладает стабиль1 ностью при относительно высоких тем-: пературах изомеризации, например глюкозоизомеразу, продуцируемую

Bacillus stearot,hermophilus в частности штамм, выбранный из группы, „ состоящей из Bacillus stearother.—

mophilus АТСС 21365, MBRL В-3680, NRHL В-3681 и ИНВА Б-3682, глюкозоизомеразу, продуцируемую микроорганизмами рода Ampullariella, например Ampullariella digitata, Ашрц11аriella lobata, Ampullariella companulet.à и йври11агiella regularis глюкозоизомеразу,продуцируемую Bacillus licheniformis, глюкозоизомеразу, продуцируемую Thermophilus.

Кроме вышеуказанных микроорганизмов предлагаемый способ предусматривает использование их мутантов и вариантов. Мутанты-гены глюкозоизомеразы, выбранные для такого. применения, являются такими, которые обеспечивают получение глюкозоиэомеразы, которая стабильна при повышенных о температурах, особенно свыше 90 С и предпочтительно вплоть ло около

5 152

1)5 С. Такие гены можно голучить с е помощью обычных методик, которые используют для мутаций микроорганизмов, например облучением или с помощью хиыических мутагенов. В другом варианте выделенные гены глюкозоизомеразы, которые продуцируют глюкозоизомеразу промежуточной термостабильности, так, например продуцируемые некоторыми штаммами Streptomyces, могут быть годвергнуты мутации in

vitro, Выбор соответствующих генов-мутантов либо в родственные, либо в другие микроорганизмы сопровождается реинтродукцией генов-мутантов, с последующим ростом и репликацией микроорганизма и проверкой термостабильности полученноч глюкозоизомеразы.

Предполагается также, что для получения глюкозоизомеразы повышенной термостабильности, подходящей для химической стабилизации и использования в изобретении, можно использовать методику рекомбинантной ДНК.

Если аминокислотная последовательность тримерных (третичных) структур глюкоэоизомераэы известна, то можно развить повышенную стабильность с помощью точечных специфических мутаций в гене изомераэы для получения ферментов, сконструированных для содержания повышенного количества таких аминокислот, которые придают повышенную стабильность структур.

Предполагается, что такие искусственно созданные ферменты должны быть особенно полезны в предлагаемом способе.

Так как глюкоэоиэомераэу продуцируют внутриклеточно с помощью тех или иных микроорганизмов, источником глюкозоизомераэы может быть просто сбор клеток, а затем фермент можно выделить из клеток известными способами, например клеточным аутолиэисом, разрушением ультразвуком, и использовать в ферментаторе обычного известного типа. Предпочтительно, чтобы глюкозоизомераэу или химически стабилизированную глюкоиэомеразу можно было иммобилизовать на инертном носителе в соответствии с обычной и хорошо известной методикой.

Материалы и способь1, которые используют для иммобилизации ферментов1хорошо известны. Также предусмотрено присутствие небольших количеств катионов кобальта, марганца и магния

3056 6 и/нли водорастворимой соли сернистой кислоты, например сульфита натрия, бисульфита натрия, сульфита магния, 5 и/или бисульфита магния для снижения или ингибирования денатурирования глюкозоизомеразы во время осу. ществления процесса.

Необходимо, чтобы концентрация углеводорода в исходном глюкозосодержащем сиропе была в интервале

40 — 50K глюкозы по массе.

Необходимо также вести изомеризацко при рН в интервале от около 6,0 до около 7,0 и наиболее предпочтительно между 5 и 6,5. Проведение изомериэации существенно ниже или выше укаэанных значений рН приводит к образованию избыточных количеств

20 нежелательных побочных продуктов, например псикоэы, органических кислот, окрашенных продуктов, предшественников окрашенных продуктов, диангидридов фруктозы и тому подобное.

25 Было обнаружено, что рН для опти-, мальной активности глюкоэоиэомеразы заметно снижается при высоких температурах. Для глюкоэоиэомераэы из

Streptomyces rubigennsus оптимальная активность наблюдается при рН 8,69,2 при 25 C pi- 6.9-7,5 при 75 С и

5,6-6,2 при 125 С, т.е. с повышением температуры иэомериэации оН иэомеризации можно снижать для поддержания максимальной активности фермента и, 35 кроме того, для предотвращения образования побочных продуктов..

Для предлагаемого способа время контактирования предпочтительно ограничено временем, необходимым для достижения конечной концентрации, по крайней мере от около 53 до около 60 мас.7. фруктозы в расчете на полное содержание углевода, присут45 ствующего в реакционной смеси. Так как глюкозосодержащий сырьевой сН роп может содержать практически одну только глюкозу, т.е. либо мало, либо вовсе Не содержать фруктозы, или может содержать .глюкозу наряду с количествами фруктозы вплоть до около 507., время реакции зависит от природы исходного сиропа. Так эффективным является время контактирования i0-25 мин.

Еще одним необходимым требованием предлагаемого способа в случае использования химически стабилизированного фермента является длитель1523056 ность контактирования глюкоэосодержащего исходного сиропа и химическая стабильность глюкозоизомеразы., Предпочтительное время контактирования глюкозоиэомераэы или хими5 чески стабилизированной глюкозоизомеразы и глюкозосодержащего сиропа зависит в значительной степени от рН, при котором проводят реакцию изомеризации..В нижнем пределе интервала рН время контактирования может быть более длительным без нежелательного разложения глюкозы и фруктозы за счет образования. В верх- )5 нем пределе интервала необходимо более короткое время контактирования во избежание образования псикозы и окрашивания. На практике, полное время пребывания глюкозесодержащего 20 сиропа при или около окончательной температуре реакции оценивается как время эффективного контактирования, так как происходящие реакции разложения сахаров являются нефермента- 25 тивными и происходят независимо от того, контактирует сироп или нет с глюкозоизомераэой; Поэтому, при проведении изомеризации при температуре свыше 90 С важно снизить время, 30 а необходимое для доведения сиропа глюкозы до нужной температуры изомеризации (например, смешивая сироп с паром непосредственно перед контактированием с изомеразой), а после достижения нужного уровня фруктозы быстро отделить сироп от активной изомеразы и затем, как,можно быстрее, охладить сироп до температуры менее

90 С, и предпочтительно до темпера- 0 а туры менее 70 С. Если используют растворимую ферму глюкозоиземеразы или химически стабилизированной глюкозоиэомеразы, необходимо ее инактивировать (например, снижением РН до предела, при котором происходит инактивирование изомеразы) перед стадией. охлаждения во избежание обратного превращения в глюкозу фруктозы, образовавшейся на стадии высокотем" пературной изомеризации, так как реакция изомеризации является, естест-венно, обратимой.

Максимальная степень конверсии глюкозы во фруктозу, которой можно достичь„ определяется термодинами55 ческим равновесием между глюкозой и фруктозой, которое, в сваю очередь, зависит от температуры, при которой проводят изомеризацию. Очень тщательный анализ равновесных смесей глюкозы и фруктозы приводит к следующей взаимосвязи:

F = 100 К (K + I); (i)

Т + 273 + 2,3005, (2)

755 где F — - % фруктозы при равновесии в расчете на полный вес глю" козы и фруктозы;

Т вЂ” температура проведения реакции изомеризации

К вЂ” константа равновесия глюкозы от фруктозы.

Реальное время контактирования между глюкоэосодержащим сиропом и изомеразой в реакторе можно в общем оценить путем сравнения следующей формулы, если используют реактор, содержащий иммобилизованную форму изомеразы, (3)

rpe t — действительное время контактирования;

С вЂ” концентрация глюкозы и фруктозы;

V — свободный объем жидкости . в слое насадки (объем слоя минус объем, занимаемый частицами иммобилиэованного фермента);

F — доля фруктозы в глюкозе е (фруктозной смеси при равновесии при температуре иэомериэации);

F, - доля фруктозы (в расчете на

Г + Ф) при гоступлении в слой насадки;

F - доля фруктозы (в расчете на

Г + Ф) в растворе, находящемся в слое насадки;

К - константа скорости реакции изомеризации в условиях иэомеризации;

А — активность иземераэы в слое насадки.

Значения К для нммобилизованной изомеразы, полученной в соответствии с приведенными далее примерами, находятся в интервале ет около 0,07 до около 5 г ч IGIU при температу-1 -1 1523056 рах от 90. до 150 С соответственно.

Это соотношение показывает необхо- димость минимизапии времени контактирования при высоких температурах

5 при использовании слоев насадки с высокой активностью на единицу объема.

Слои насацки, -полученные по способу, описанному в дальнейших примерах, могут, содержать вплоть до 2000

ХСШ/мл, что может привести к достижению 99,5Х.-ного равновесного содержания фруктозы за менее, чем 1 мин в высокотемпературном реакторе, когда используют постадийные реакторы при различных температурах,. и сырье, подаваемое в первый реактор, изомеризуют при низкой температуре перед изомеризацией при высокой температу-тором pearcTope. Когда испол? зуют систему постадийных реакторов, предпочтительно использовать способ ферментативного превращения глюкозы во фруктозу, который включает контактирование глюкозосодержашего исходного сиропа, содержащего от 40 до

50 мас.Ж глюкозы, с глюкозоизомеразой при температуре от 20 до 80 С, при рН.от 6 0 до 9,0 и времени контактирования от 0,5 до 2 ч для превращения от 40 до 45 мас,K. присутствующей в сиропе глюкозы во фруктозу, повышая температуру изомеризационной

О среды . „от 90 до 115 С, устанавливая нужное значение рН изомеризационной среды в,интервале от 6,0 до

7,0, осуществляя контактирование фруктозосодержащего сиропа с глюкозоизомеразой в течение дополнительного промежутка времени от 10 до

25 мин для повышения степени конверсии от 53 до 60 мас.7 глюкозы, находящейся в исходном сырьевом глюкозосодержащем сиропе, причем практически без образования псикозы или других сахаров, которые не являют45 ся Глюкозои или Йруктозои, Поэтому использование высокоактивных слоев насадок может привести к малым эффективным промежуткам времени контактирования, которое, в свою очередь, минимизирует разложение фруктозы, которое происходит при высоких температурах, необходимых для проведения предлагаемого способа, При выборе методики иммобилизации глюкозоизомеразы предпочтительно, чтобы использовались способы, которые дают возможность получать мел755

2 3 б — Ы 2731 () Я

К =

100 - F

10000(1 + С)

Q(100-P) (6) где Т вЂ” температура изомеризации, о

F — равновесное содержание фруктозы (X в расчете на кие пористые частицы катализатора с тем, чтобы ингибирование эффектов диффузии иэомеризации было минимальным.

В другом варианте изомеразу можно иммобилизовать в порах мембраны, через которую пропускают раствор глюкозы во время высокотемпературной изомеризации, как средство промотирования хорошего контакта между ферментом и субстратом, минимизируя диффузионные ограничения. Носитель, который используют для иммобилиза« ции, является предпочтительно полно" стью нераствор иым и инертным для того, чтобы избежать образования нежелательных примесей. илн разло жения глюкозных (фруктозных) компонентов растворов субстратов, °

Однако, в коммерческой практике, содержащие фруктозу сиропы не изготавливают из чистой глюкозы. Чаще в качестве источника глюкозы используют гидролизаты крахмала. Они постоянно содержат сахариды,.отличные от глюкозы и фруктозы (здесь И далее именуемые полисахаридами), которые получаются в результате неполного гицролиза крахмала и обратного превращения глюкозы. Обычно они составляют от 3 до 8% в расчете на сухую массу в виде сахаридов, полученных гиДролизом крахмала. Поэтому необходимо при оценке температуры, при которой следут проводить изомеризацию, учесть все полисахариды, содержащиеся в глюкозном сиропе, также как и другие факторы. как полный вес фруктозы в сухом виде, который должен быть достигнут, образование псикозы и других продуктов, которые не являются глюкозой или фруктозой, во время эффективного времени контактирования сиропа глюкозы и изомеразы. Уравнения для расчета температуры изомеризации приводятся ниже:

1523056

3

6

95,7

99,1

104, 3

108, 9

113,8

124;3

136,1 поющое содержание глюкозы + фруктозы) при. температуре Т;.

И - Ж фруктозы в расчете на су-: хую массу, требуемый в продукте изомеризации;

С - Х псикозы + других.продук-,, тов разложения, образующихся во время эффективного изомеризационного времени кон тактирования;

Q, - Ж равновесия, достигнутый во время реакции изомериэацииу

Р - Х содержания полисахарида в глюкозном сиропе.

Обычно, менее 1%, предпочтительно менее 0,5Х, псикоэы и других продук-. тов разложения может образовываться, и поэтому может быть достигнуто 99,5%,20 равновесия. Поэтому для получения сиропа, содержащего 55,5Х фруктозы, (.в расчете на сухую массу), необходимы следующие температуры изомеризации для глюкозного сиропа указанной концентрации полисахаридов;

Полисахариды в си- Температура ропе глюкозы, Х в иэомеризации, расчете на сухую С. массу

Приемлемая коммерческая продукция содержит, в среднем, 55,5Х фруктозы в расчете на сухую массу.

Это так, потому что при этом уровне фруктозы получают кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, оди45 иаковой сладости с сахарозой по массе в расчете на сухую массу. Кроме того, сироп с содержанием фруктозы

55,5Х принят как коммерческий продукт, который используют взаимозаменяемо частично илн полностью вместо сахарозы во многих пищевых продуктах и особенно в газированных мягких напитках.

Иэ-за сложностей, сопровождающих поставку, хранение, измерение и включени . сиропа в пищевые продукты, существует общая потребность в установлении стандарта для продуктов, 1

12 полученных от разных изготовителей с тем, чтобы продукты из различных источников можно быпо использовать взаимозаменяемо и одновременно. Поэтому уровень фруктозы 55-56% в расчете на сухую массу приобретает особое значение как целевой уровень в технологии, связанной с изготовлением сиропа.

В соответствии с предлагаемым способом можно получать уровни фруктозы по крайней мере 53Х предпочтительно по крайней мере 54% и более предпочтительно по крайней мере 55Х.

Продукт, полученный по этому способу, характеризуется также приемлемой окраской, которая, естественно, очень желательна, так как это снижает затраты на очистку.

Учитывая указанные требования рН и времени контактирования известный способ изомеризации глюкозы можне соогветствующим образом приспособить к работе при температуре от около 90 до 1 15 С и предпочтительно от около 100 до около 110 С для получения высококонцентрированных

Глюкозо фрук Гоэных сиропов е

При желании с учетом использовачия раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата для предлагаемого способа, можно также использовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризована во фруктозу. Так, например, раствор изомериэованной глюкозы, содержащий вплоть до 50Х фруктозы, можно обработать в соответствии с предлагаемым способом, для повышения концентрации фруктозы до более желательных уровней выше 50% и предпочтительно до уровней 55-56% и выше.

Раство ры глюкозы „содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.% углевода, можно получить известными способами.

Учитывая вышеизложенное требование к концентрации глюкозы, рН и времени контактирования, известные способы изомеризации глюкозы можно соответствующим образом приспособить для работы в интервале температур от о около 90 до около 115 C,nредпочтительно между около 100 и около 110 С, для получения сиропа с высоким содержанием глюкозы-фруктозы.

13!

523056

Термостабильность глюкозоизомеразы может быть существенно повышена за счет одной или более химических обработок фермента с сохранением его приемлемой активности. Обрабо танный таким образом фермент называют химически стабилизированной изомеразой.

Химическую стабилизацию изоме". разы осуществляют рядом различных способов, которые могут привести к повышению термостабильности. Основное достижение состоит во вве-. дении структурных элементов в молекулу фермента таким образом„ чтобы фермент был устойчивым к раскрытию при нагревании выше его обычной точки термоденатурирования. Предпочтительным способом для осуществления этого является модификация фермента химическими замещениями на нем фрагментов, содержащих полимеризуемые вннильные группы, таким образом, чтобы последние были прочно присоединены к поверхности молекулы фермента в .нескольких местах. После этого модифицированный фермент смешивают с одним или более полимеризуемыми,винильными соединениями вводныхх растворах и полученную смесь сополимеризуют до образования. химически стабилизированного фермента, в котором фермент прочно связан . во многих точках с трехмерной полимерной матрицей, которая образовала структуру, соответствующую по форме структуре фермента.

Важно при проведении вышеописанных реакций, чтобы условия, которые приводят к денатурированию изомеров с последующей потерей активности, были обойдены. Так например, следует избежать экстремальных значений рН и температур во время любых манипуляций, необходимых для проведения вышеуказанных реакций.

Примерами реагентов, которые используют для модификации изомеразы для замещения полимеризуемых виниль-. ных групп на ней, являются акрилохлорид, метакрилохлорид, акролеин, кротоновый альдегид, малеиновый ангидрид, 3,4-эпоксибутен, 2,3-эпоксипропил сложный эфир акриловой кислоты, 2,3-тиоглицидилавый сложный эфир акриловай кислоты, 1-аллилокси-3(Nэтиленимин)-2-пропанол, О-сукциними. довый сложный эфир акриловой кислоты, ангидрид хлормалеиновой кислоты, азид малеиновой кислоты, 3-бромпропен и аллилизотиоцианат, Такие сое5 динения могут взаимодействовать со свободными аминогрунпами изомераэы, например эпсилонаминогруппой лизинового фрагмента.

Другие. соединения, которые могут взаимодействовать со свободными группами карбоновых кислот ийомеразы, могут быть использованы для замещения легко полимеризуемых винильных фрагментов на ней, Примерами винильных соединений, которые можно сополимеризовать с модифицированной изомеразой, являются акрилат натрия, метакрилат натрия, акриламид, оксиэтилметакрилат, I

20 акрилоилпиперидин-4-спиро-2 -(1 3 1 диокмакрилопентан), 1-акрилоил-4пиперидин и акрилоилметоксиамин.

Обычно. предпочтительными являются растворимые мономеры или смеси мономеров, которые цают в результате водорастворимые полимеры.

Обычно бифункциональные виниловые соединения включают в смесь мономеров для введения сшивающих центров, .Что приводит к тримерной полимерной сетке, Подходящими соединениями являются Н,N -метокси-бис-акриломид и

I этиленгликольдиметакрилат. Если используют эти соединения, полимеризуемая смесь образует нерастворимый гель, который приводят к иммобилизации изомеразы.

Системы инициаторов, которые обычно используют при палимеризации

40 винильных групп могут быть пер1 сульфатом аммония плюс бис тльфат натрия, перекись водорода плюс сульфат железа, сульфат калия плюс

N,N,N,N.-тетраметилэтилендиамин и

45 рибофлавин.

В другом варианте нековалентное присоединение к трехмерной полимерной матрице может быть достаточным для придания нужной жесткости молекуле изомеразы, и тем самым осуществления заметного повышения термостабильности. Это может произойти; если изомеразу механически включают в сшитый полимерный гель. В этом случае нет необходимости в том, чтос5 бы модифицировать изомеразу присоединением к ней. винильных групп перед .стадией полимеризации. Однако, концентрация геля должна быть выше, 15

16

1523056 чем около 30 мас.X перед тем, как произойдет заметная стабилизация и нредпочтительная концентрация геля около 50%. Требуются мономеры, способные образовывать полимерные ге5 ли, которые могут образовывать электростатические и водородные связи с изомеразой, как, например, акрилат натрия, метакрилат натрия, акрил- 10 амид и оксиэтилметакрилат.

Третьим способом отверждения изомеразы является внутримолекулярная сшивка, которая может повысить термостабильность. 15

Нодходяшие сшивающие агенты для иепользовання в изобретении включа" ют бифункциональные соединения, которые способны взаимодействовать с подвешенными функциональными группами молекулы фермента. Чаще всего такими функциональными группами являются аминогруппы, обычно первичные аминогруппы, которые могут взаимодействовать с широким кругом функцио нальных групп, таких как карбоновые кислоты, сульфонилгалиды, альдегиды, изоцианаты, пропиолаты и тому подобные.

Так, сшивающие агенты включают ангидриды дикарбоновых кислот, как янтарный ангидрид, и адипиновый ангидрид, соответствующие диальдегиды такие, как глиоксаль, сукцинальдегид и глутаральдегид, такие ненасыщенные соединения как акролеин и кротональдегид, такие диолпропиолаты, как зтиленгликольбиспропиолат, пропиленгликольбиспрониолат и гексаметиленгликольбис9

49 пропиолат, и дисульфонилгалиды такие как бензол-1,3"дисульфонилхлорид; нафталин-1,5-дисульфонил" .хлорид и толил-2,4-дисульфонилхлорид.

Кроме того, так как фермент содержит или может быть получен так, что содержит кислотные группы, взаимодействующие с аминами, именно бифункциональные амины можно использовать в качестве сшивающих агентов для целей изобретения. Они включают, например, диамины, содержащие вплоть до 12 атомов углерода например фе9

55 нилендиамин, бутилендиамин, гексилендиамин, октилендиамин, пентилендиамин, зтилендиамин и додецилендиамин.

Количество сшивающего агента может существенно изменяться, причем отношение фермента к сшивающему агенту находится в интервале от около

О, 1 до около 0 0001. Способ осущестМ вления нужного связывания в некоторой степени определяется природой выбранного сшивающего агента и ферментом, Вообще, реагенты нужно растворять в подходящем инертном растворителе и реакцвю следует вести нри достаточно низких температурах, чтобы избежать вредных воздействий на фермент, который .может быть чувствительным к высоким температурам.

Обычна, предпочтительна реакция при комнатной температуре или. около нее, а в качестве реакционной среды используют воду или водные растворителие

Кроме замещения полимеризуемых винильных групп на молекуле фермента и последующей полимеризации в соответствии с описанными ранее спо-. собами дальнейший вариант включает конденсацию предварительно получен" ного полимера с изомеразой путем образования внутримолекулярных ковалентных связей для получения стабилизированной молекулы. Так, например, полипептиды, такие, как встречающиеся в природе протеины и продукты их гидролиза, можно подвергнуть взаимодействию, используя известные методики для создания пентидной связи с глюкоизомеразой до получения стабилизированного фермен- . та. Полученные таким образом продукты могут быть водорастворимыми, но им можно придать свойство не растворяться в воде, используя такие смешивающие агенты, как глутаральдегид, и обычно полученная сшитая фер" ментная система еще более стабильна.

При желании исходный фермент можно преобразовать, включив нужную функциональную группу в молекулу в целях конденсации с ранее полученной молекулой. Так, для введения карбоксильной функциональной группы фермент, содержащии свободную аминоrруппу, следует подвергнуть взаимодействию с дикарбоновой кислотой для превращения в фермент, содержащий карбоксильную группу.

Предварительно полученными полимерами, которые следует использовать в описанном ранее варианте, могут

17, 1523056

18 быть любые, которые содержат нужныи тип и количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп для проведения нуж5 нон реакции. Предпочтительными являются полипептиды, такие как природные протеины, например хитозан, дрожжевой протеин и тому подобные, так.же как и смеси; и полимеры, содержащие аминогруппы, такие как полиэтиленимин. Обычно предпочтительные предварительно полученные полимеры образуют водорастворимые продукты и предпочтительно придать им не- 15 растворимость за счет взаимодействия со сшивающими агентами, например глутаральдегидом и другими описанными ранее соединениями.

Во всех описанных способах модификации ферментов существенным является условие, чтобы достаточное количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп, имелось в наличии для дости- 25 жения заметного уровня искомого результата.

Так, например, при выборе предварительчо полученного полимера, который должен взаимодействовать с ферментом, требуется, чтобы полимер содержал группы, которые реагировать с доступными группами молекулы фермента. Так, протеин с подвешенными карбоксильными группами следует выбирать для взаимодействия с подвешенными аминогруппами фермента. Кроме того, должно существовать разумное количество реакционноспособных групп у выбранного реагента, чтобы обеспечить множество точек присое40 динения реагентов для достижения существенной стабилизации.

Еще один способ,- с помощью которого можно повысить термостабильность фермента, состоит в химическом изме45 кении структуры поверхности без заметных потерь активности. Так, поверхностные аминогруппы можно ами дировать или гуанидировать до получения заместителей, сильно напоминающих аргинин, Лактикдегидрогеназа и некоторые другие протеины были стабилизированы. Один IGIU является количеством изомеразы, которое превращает 1микромоль глюкоэыво фруктозу в течение 1мин в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на ) л, 0,02 моль MgSO на 1 ли 0,001 моль

CoClz íà 1 л при рН 6,85 (0,2 М малеат натрия) и при температуре 60оС при определении вышеуказанным способом.

Пример 1. Демонстрирует прямую изомеризацию глюкозы при высоких температурах до достижения композиции, содержащей 55,5Х фрук" тоэы в расчете на сухую массу, при использовании двухстадийной системы изомеризации.

Растворимую глюкозоизомераэу получают по способу, аналогичному способу, описанному в патенте США

11- 3788945.

Внц Streptomyces гиЬ депоэиэ, полученный из S. rubigenosus АТСС

21175, выращивают подводной аэробной ферментацией íà среде следующего состава, мас.Я:

Декстроза 9,0

Сироп замоченной кукурузы (твердая часть) 1,6

Диаммойийфосфат 0,08

Сульфат марганца 0 06

Противовспенивающий агент (Плуро:ник РЕ-61) 0,003

Указанную среду стерилизуют при

121 С в течение 45 мин, охлаждают и. устанавливают рН 6,8-7,0. Fe инокулируют 14 об.7 инокулюмом, содержащим затравочный ферментер, полученный с помощью S. rubigenosus варианта, указанного выше. Ферментацию проводят в асептичс ских условиях о при 30 С в течение около 60 ч при аэрации. S. rubigenosus ATCC 21175 можно также использовать для инокулирования и получения изомераэы.

В этом случае используют среду следующего состава, мас.й:

Декстроэа 0,24

Сироп замоченной кукурузы (твердая часть) 1,5

Сорбитол 1,6

CoCl 0,02

Диаммонийфосфат 0,56

Ксилоза 1,0

Глюкозоизомеразу экстрагируют из

$. rubigenosus. Затем полученный экстракт фильтруют до получения раствора сырой неочищенной глюкозоизомеразы.

Неочищенную глюкозоизомеразу очищают адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе, 1523056 фильтрованием и промывкой адсорбированного продукта, 9,1 М NaCl раствором для удаления примесей, а затем, десорбируя путем контактнрования с

0,45 М раствором ИаС1 рН всех растворов поддерживают при 7,5 во время стадий очистки. Раствор частично очищенной изомеразы, полученный при этом, смешивают с 3 объемами

95% этанола при О C до осаждения о изомеразы. Добавляют перлитный фильтр, твердую часть выделяют фильтрованием и сушат воздухом до получения растворимого препарата изомеразы, содержащего 2500 IGIU/ã.

Удельная активность препарата изомеразы составляет 40 ХСХц/мг протеина.

Низкотемпературный (70 С) реактор изомерации приготавливают, набивая иМмобилизованную изомеразу,, подготовленную по способу патента

США N- 3788945, встеклянную колонку диаметром до 2,54 см до получения, слоя 5 см по высоте, содержащего

20000 ТСТАВ .активности. Б .верхнем пространстве над слоем насадки устанавливают термометр и располагают стеклянные шарики для сведения к минимуму мертвого обЪема, насколько это возможно. Колонка имеет впускное и выпускное отверстие и окружена рубашкой для циркуляции воды из термостата.

Высокотемпературный реактор (93 С) подготавливают таким:же образом, используя иммобилизованную изомеразу, полученную адсорбцией очищенной изомеразы.на ДЕАК"целлюлозе.

Слой насадки содержит 97000 lGIU и имеет высоту 15 см.

Один 1GIU представляет собой количество изомеразы, которое превращает 1 мкмоль глюкозы во фруктозу за 1 мин в растворе, содержащем

2 моль глюкозы на 1 л, 0,02 ммоль

NgH0 íà 1 л и 0,001 моль ÑîÑ1 на

1 л при рН 6„85 (0,2 М малеата нато рия) и при температуре 60 С.

Раствор, содержащий глюкозу, подготавливают, растворяя кристаллическую глюкозу в деминерализованной воде до получения раствора, содержащего 48% сухого вещества nî ìaññå.

Активирующий и стабилизирующий агенты растворяют в растворе глюкозы до получения 25 мМ натрийметабисульфита, 5 мМ сульфата магния и 0,1 мМ хлористого кобальта. рН раствора устанавливают 6,8 гидроокисью натрия.

Первую стадию низкотемпературной о изомеризации проводят при 70 С, прокачивая вышеуказанный раствор глюкозы через низкотемпературный реактор со скоростью 3,7 мл/мин. Первые

2500 мл раствора, поступающего из реактора, сливают, а поток» поступающий из реактора после этого, собирают для использования на второй высокотемпературной стадии. При высокотемпературной изомеризации раствор, полученный при изомеризации при 70 С, прокачивают через высокотемпературный реактор, подготовленный, как описано вьппе, со скоростью 5 мл/мин, поддерживая темпео ратуру в реакторе 93 С. Время контактирования раствора в высокотемпературном реакторе с иммобилизованным ферментом составляет около 12 мин. о

Полное время„ в течение которого раствор находится при температуре о

93 С внутри реактора, составляет около 18 мин. Полученный раствор охлаждают в ледяной бане немедленно после того, как он поступает из высокотемпературного реактора и рН его усганавливают 4,0. По