Способ получения простагландина f3

Способ получения простагландина f3

Реферат

 

Использование: биотехнология, получение биологически активных веществ. Сущность изобретения: инкубируют тимнодоновую кислоту с препаратом ПГН-синтазы (215 - 540 нмоль на ед. активности фермента) в присутствии этанола, гемина, адреналина в течение 1 - 7 мин с последующим добавлением SnCl₂ в метаноле до концентрации 35 - 50 мМ. Выход ПГF₃ природной конфигурации 0,25 - 0,28 мкмоль/мг ПГН-синтетазы. 1 ил.

Изобретение относится к способам получения биологически активных соединений. Простагландины (ПГ) являются низкомолекулярными биорегуляторами липидной природы, проявляющими специфическое действие при концентрации 10^-6-10^-9 М (или 1-1000 мкг/л). Функциональная роль и механизм их действия (особенно третьей серии) в живых системах изучены недостаточно. Выяснение роли простагландинов третьей серии в функционировании различных системы организма человека и животных может привести к созданию новых лекарственных препаратов. ПГF₃ может быть использован в биохимических, медицинских, фармакологических исследованиях. Таким образом, синтез ПГF₃ является актуальной задачей. Известен способ получения ПГF₃, где описывается двенадцатистадийный химический синтез рацемического по 8 положению ПГF₃ (исходное соединение эндо-би-цикло-[3.1.0] -гекса-2-ен-6-карбоно- вая кислота), из которого восстановлением боргидридом натрия получают рацемический по 8 положению ПГF₃. Основными недостатками этого способа являются: низкий выход целевого продукта, наличие значительных примесей неприродного изомера ПГF₃, а также большая трудоемкость всего процесса получения препарата ПГF₃. Целью изобретения является повышение выхода ПГF₃, увеличение селективности синтеза с целью обеспечения получения только природного биологически активного продукта, а также упрощение всего процесса синтеза. Поставленная цель достигается инкубацией тимнодоновой кислоты (ТК) с препаратом ПГН-синтетазы при соотношении 215-540 нмоль ТК на единицу активности (за единицу активности принимают количество фермента, превращающее 1 мкмоль арахидоновой кислоты за 1 мин при 25^oC в трис-HCl буфере, рН8). ПГН-синтетазы в присутствии этанола, гемина, адреналина в течение 1-7 мин при 25^oC, с последующим добавлением раствора SnCl₂ в метаноле до концентрации 35-50 мМ. Сущность изобретения заключается в применении для синтеза очищенного препарата ПГН-синтетазы и наиболее эффективном его использовании за счет увеличения начальной концентрации исходной ТК и уменьшения концентрации ПГН-синтетазы в инкубационной смеси, и последующем добавлении раствора SnCl₂ в метаноле. Оптимизацию синтеза ПГF₃ проводят относительно выхода ПГF₃ рассчитанного на 1 мг препарата ПГН-синтетазы (или на единицу активности ПГН-синтетазы) в связи с тем, что в качестве источника ПГН-синтетазы используется труднодоступное сырье - везикулярные железы барабана (ВЖБ). Для определения оптимальных условий синтеза ПГF₃ изучают зависимости выхода ПГF₃ от концентрации ферментного препарата (концентрация белка в исходном препарате ПГН-синтетазы 0,89 мг/мл, специфическая активность 8,4 ед активности на 1 мг белка) (чертеж), субстрата соотношения ТК и препарата ПГН-синтетазы. Во всех экспериментах реакцию начинают добавлением препарата ПГН-синтетазы в реакционную смесь содержащую ТК, а останавливают добавлением раствора SnCl₂ в метаноле. Время, за которое концентрация ПГF₃ в инкубационной смеси достигает максимального значения, обозначают _опт. Из зависимости выхода ПГF₃ от концентрации ПГН-синтетазы (см.чертеж) видно, что при постоянной начальной концентрации ТК выход ПГF₃ (увеличивается при уменьшении концентрации фермента. При постоянной концентрации ПГН-синтетазы выход ПГF₃ увеличивается с ростом концентрации ТК, достигает максимального значения при концентрации ТК 200 мкМ и при дальнейшем увеличении концентрации ТК не изменяется. Выход ПГF₃ на 1 мг ПГН-синтетазы увеличивается при увеличении соотношения между концентрациями субстрата и фермента. При варьировании концентраций ТК (от 25 до 500 мкмМ) и ПГН-синтетазы (от 10 до 350 мкг/мл) выход ПГF₃ на 1 мг ПГН-синтетазы определяется только их соотношением. Таким образом, наибольший выход ПГF₃ (0,25-0,28 мкмоль/мг ПГН-синтетазы) достигается при соотношении 1,8-4,5 мкмоль ТК 1 мг ПГН-синтетазы. При увеличении соотношения ТК и ПГН-синтетазы от 1,8 до 4,5 мкмоль/мг ПГН-синтетазы выход ПГF₃ относительно количества исходной ТК снижается, тогда как выход ПГF₃ относительно количества ПГН-синтетазы остается неизменным. Как следует из приведенных результатов, значение _опт. возрастает при снижении концентрации ПГН-синтетазы, увеличении начальной концентрации ТК и соотношения между ТК и ПГН-синтетазой. В диапазоне значений соотношения ТК и ПГН-cинтетазы от 1,8 до 4,5 мкмоль/мг величина _опт. не изменяется и равна 5 мин. При добавлении SnCl₂ в инкубационную смесь (конечная концентрация 10 мг/мл. , или 44 мМ) происходит изменение рН среды с 7,9 до 1,4-1,5, в связи с чем не требуется обычного подкисления инкубационной смеси лимонной кислотой перед экстракцией. Кроме того, при добавлении SnCl₂ обнаруживается заметное увеличение сорбции продуктов реакции и тимнодоновой кислоты на денатурированных белках по сравнению с сорбцией в присутствии лимонной кислоты. В связи с этим требуется тщательная экстракция продуктов из реакционной смеси - не менее 5 экстракций 3-4 объемами этилацетата. Было обнаружено, что тимнодоновая кислота в отличие от арахидоновой и дигомо--линоленовой, значительно более интенсивно сорбируется на белках, присутствующих в препарате фермента. Поэтому при синтезе ПГF₃ очень важно использовать препарат ПГН-синтетазы с высокой специфической активностью. Препарат ПГН-синтетазы из везикулярных желез барана очищают с помощью хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Специфическая ПГН-синтетазная активность увеличивается в 7,5-10 раз по сравнению с активностью микросомальной фракции. Таким образом, при инкубации ТК с концентрацией 25-500 мкМ с очищенным препаратом ПГН-cинтетазы при соотношении их концентраций 1,8-4,5 мкмоль ТК на 1 мг ПГН-синтетазы (или 216-540 нмоль на единицу активности ПГН-синтетазы) при 25^oC в течение 5 мин с последующим добавлением раствора SnCl₂ в метаноле получается ПГF₃природной конфигурации с выходом 0,25-0,28 мкмоль/мг ПГН-синтетазы (47-53 мг/кг ВЖБ). П р и м е р. Получение простагландина F₃. 1. Получение ПГН-синтетазы. 100 г везикулярных желез барана в 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера, рН 8, содержащего 0,5 мМ ЕДТА, 0,1 мМ диэтилдитиокарбамата, 0,1% неионного детергента Lubrol PХ, (буфер А), охлажденного до 4^oC, гомогенизируют в Waring Comm. Blender (8 раз по 0,5 мин) и центрифугируют 15 мин при 12 10³g. Супернатант (200 мл) фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют 90 мин при 100 10³g. Осадок гомогенизируют в 180 мл буфера А и центрифугируют 90 мин при 100x x10³g. Осадок (макросомальная фракция) ресуспендируют в 42 мл буфера А и солюбилизируют мембранные белки добавлением 4,2 мл 10% Тwееn 20. Смесь выдерживают 30 мин при 4^oC, затем центрифугируют 90 мин при 100 10³g. 42 мл солюбилизированного ферментного препарата наносят на колонку (2,5 30 см) с ДЕАЕ-целлюлозной предварительно уравновешенной 20 мМ К-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,5 мМ ЕДТА, 0,1 мМ диэтилдитиокарбамата и 0,05% Lubrol РХ. ПГН-синтетазная активность элюируется этим же буфером. Получают 60 мл ферментного препарата ПГН-синтетазы (концентрация белка 0,89 мг/мл; специфическая активность 8,4 мкмоль арахидоновой кислоты мин^-1 мг^-1 при 25^oC в трис-буфере, рН 8). II. Получение ПГF₃. К раствору 107 мкмоль (32 мг) тимнодоновой кислоты в 10 мл этилового спирта добавляют 364 мл воды, 50 мл 200 мл калийфосфатного буфера, рН 7,9, содержащего 0,5% Lubrol РХ, 10 мл 100 мМ раствора L-адреналина, 10 мл 100 мкМ раствора гемина. Прединкубируют реакционную смесь 5 мин при 25^oC и добавляют 60 мл предварительно проинкубированного при 25^oС в течение 5 мин препарата ПГН-синтетазы. Выдерживают реакционную смесь 5 мин при 25^oC при интенсивном перемешивании, затем добавляют 56 мл раствора SnCl₂ в метаноле (100 мг/мл) и экстрагируют этилацетатом (5х1,5 л). Экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют, упаривают, остаток растворяют в 20 мл метанола. Очистку ПГF₃ осуществляют методом ВЭЖХ следующим образом. Метанольный раствор продуктов синтеза упаривают, остаток растворяют в 2 мл метанола, фильтруют через колонку объемом 1 мл с обращенной фазой Servachrom Si 100-Polyol-RP 18-10 мкм ("Serva"), промывают 2 раза 3 мл метанола, упаривают, растворяют в 2 мл 20%-ного раствора ацетонитрила в воде, содержащего 0,1% уксусной кислоты, и вводят в колонку (Nucleosil 10 C 18, 10 x 250 мм), защищенную предколонкой (Servachrom SI 100-Polуol-RP 18-10 мкм ("Serva"), (4,6 75 мм). Элюцию проводят 33%-ным раствором ацетонитрила в воде, содержащим 0,1% уксусной кислоты, со скоростью 5 мл/мин, детектор - рефрактометр RIDK-102 (ЧССР). Выход ПГF₃ 14,4 мкмоль (5,04 мг).

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНА F₃, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода обеспечения биологической активности продукта и упрощения процесса, осуществляют инкубацию тимнодоновой кислоты с препаратом ПГН-синтетазы при соотношении 215 - 540 нмоль тимнодоновой кислоты на единицу активности ПГН-синтетазы в присутствии этанола, гемина, адреналина в течение 1 - 7 мин, с последующим добавлением SnCl₂ в метаноле до концентрации 35 - 50 мМ.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2000

Извещение опубликовано: 10.11.2000