Способ получения сахара 1,5-d-ангидрофруктозы (варианты), антиоксидант, подслащиватель

Способ получения сахара 1,5-d-ангидрофруктозы (варианты), антиоксидант, подслащиватель

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности и может быть использовано для приготовления сахара 1,5-D-ангидрофруктозы. Сахар получают путем ферментативной обработки альфа-1,4-глюкона ферментом альфа-1,4-глюканлиазой. Фермент выделяют из грибков, водорослей или получают рекомбинантным путем. Изобретение позволяет получить большое количество 1,5-D-ангидрофруктозы для использования в качестве антиоксиданта и послащивателя. 4 с. и 13 з.п.ф-лы, 20 табл., 20 ил.

Изобретение относится к использованию фермента, в частности альфа-1,4-глюканлиазы, для получения 1,5-D-ангидрофруктозы из субстратов на основе альфа-1,4-глюкана.

Настоящее изобретение относится также к использованию сахара, в частности 1,5-D-ангидрофруктозы, в качестве антиоксиданта, в особенности антиоксиданта для пищевых продуктов и напитков.

Изобретение относится к использованию 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве антиоксиданта в качестве подслащивателя, в частности в качестве подслащивателя для пищевых продуктов и напитков, предпочтительно пищевых продуктов и напитков, употребляемых человеком.

В патенте Франции 261750 и публикации Baute et al., Phytochemistry, Vol. 27, N 11, p. 3401-3403 (1988) сообщается о продуцировании 1,5-D-ангидрофруктозы в Morchella vulgaris, по-видимому, за счет ферментативной реакции. Выход полученной 1,5-D-ангидрофруктозы очень низкий. Несмотря на указание на возможную ферментативную реакцию ни в одной из этих публикаций не приведены какие-либо последовательности аминокислотных остатков, не говоря уже о какой-либо информации о последовательности нуклеотидов. В приведенных публикациях сообщается о том, что 1,5-D- ангидрофруктоза может выступать в роли предшественника при получении пирона микротецина.

Yu et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1156, pp. 313-320 (1993) сообщают о получении альфа-1,4-глюканлиазы из красных морских водорослей и о ее применении для расщепления альфа-глюкана с целью получения 1,5-D-ангидрофруктозы. Выход полученной 1,5-D-ангидрофруктозы очень низкий. Несмотря на указание на возможную ферментативную реакцию в приведенной публикации не приведены какие-либо последовательности аминокислотных остатков для указанного фермента, не говоря уже о какой-либо информации о кодирующей его последовательности нуклеотидов. В этой публикации также указывается, что источником альфа-1,4-глюканлиазы являются водоросли.

Типичным субстратом на основе альфа-1,4-глюкана является крахмал. В настоящее время крахмалы находят широкое применение в промышленности, главным образом потому, что они являются дешевым исходным продуктом.

Ферменты, расщепляющие крахмал, можно разделить на две категории. Гидролазы расщепляют крахмал до глюкозы или олигомеров глюкозы. Вторую группу ферментов, расщепляющих крахмал, составляют фосфорилазы, которые в присутствии неорганического фосфата продуцируют из крахмала глюкозо-1-фосфат.

1,5-D-Ангидрофруктозу можно также получить химически - см. работу Zichenthaler, Tetrahedron Letters, Vol. 21, pp. 1429-1432. Однако химический синтез включает большое количество стадий и не приводит к получению больших количеств 1,5-D-ангидрофруктозы.

По указанной причине синтетический путь получения 1,5-D-ангидрофруктозы является очень дорогим.

Таким образом, необходим дешевый и простой способ получения 1,5-D-ангидрофруктозы, который позволял бы получать 1,5-D-ангидрофруктозу в больших количествах.

Далее антиоксиданты обычно используются для защиты от кислорода, который оказывает вредное воздействие на такие вещества, как пищевые продукты. Двумя широко используемыми антиоксидантами являются GRINDOX 142 и GRINDOX. 1029. Указанные антиоксиданты содержат множество компонентов и их производство является дорогим.

Таким образом, необходимо разработать более простые и дешевые формы антиоксидантов.

Далее в процессе приготовления пищевых продуктов и напитков часто используют подслащиватели. Однако многие подслащиватели дороги и их сложно получать.

Таким образом, необходимы более простые и дешевые формы подслащивателей.

В соответствии с настоящим изобретением заявляется способ получения сахара 1,5-D-ангидрофруктозы, включающий обработку альфа-1,4-глюкана ферментом альфа-1,4- глюканлиазой, отличающийся тем, что фермент применяют практически в чистом виде.

В том случае, если глюкан дополнительно содержит связи, отличные от альфа-1,4-связей, альфа-1,4-глюканлиазу предпочтительно используют в сочетании с реагентом, который может расщепить другие связи, таким как гидролаза, преимущественно в сочетании с глюкангидролазой.

Глюканом преимущественно является крахмал или фракция крахмала, полученная химически или ферментативно. Если фракцию крахмала получают ферментативно, то реакцию можно проводить перед добавлением альфа-1,4-глюканлиазы или же реакции можно проводить одновременно. Подходящим реагентом может быть вспомогательный фермент. Предпочтительными вспомогательными ферментами являются альфа- и бета-амилазы. Преимущественно используют ферменты, которые удаляют ответвления от основной цепи. Более предпочтительно в качестве вспомогательного фермента применяют по крайней мере одну из пулланаз или изоамилаз.

Преимущественно альфа-1,4-глюканлиазу либо иммобилизуют на носителе, либо, что более предпочтительно, применяют в растворенной форме.

Фермент преимущественно выделяют либо из грибков, предпочтительно Morchella costata или Morchella vulgaris, либо из инфицированных грибками водорослей, предпочтитель но Gracilariopsis lemaneiformis, либо из самих водорослей, предпочтительно Gracilariopsis lemaneiformis.

Фермент предпочтительно выделяют и/или затем очищают из грибков, или из инфицированных грибками водорослей, или из самих водорослей, используя гель, который не разлагается под действием фермента.

Предпочтительно используют гель на основе декстрина или его производного.

Гель предпочтительно представляет собой циклодекстрин, а более предпочтительно - бета-циклодекстрин.

Фермент предпочтительно включает последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 1, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 2, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 5, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 6, или любую их разновидность.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фермент включает любую последовательность аминокислотных остатков с номерами идентификации 9-11, или любую их разновидность.

Термин "любая их разновидность" означает любую функционализацию, вариацию, модификацию, замещение, удаление или добавление аминокислоты, входящей в последовательность, при условии, что фермент обладает активностью лиазы.

Фермент предпочтительно применяют в сочетании с амилопектином или декстрином.

Фермент преимущественно получают путем экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент.

Нуклеотидная последовательность преимущественно является ДНК последовательностью.

ДНК последовательность предпочтительно включает последовательность, которая совпадает, или комплементарна, или в значительной степени гомологична, или содержит любые подходящие замещения в кодоне любой из следующих последовательностей: последовательность с номером идентификации 3 или последовательность с номером идентификации 4, последовательность с номером идентификации 7, последовательность с номером идентификации 8.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения ДНК последовательность предпочтительно включает любую последовательность, которая совпадает, или комплементарна, или в значительной степени гомологична, или содержит любые подходящие замещения в кодоне любой их следующих последовательностей с номерами идентификации 12-14.

Выражение "в значительной степени гомологична" подразумевает гомологию по отношению к структуре, и/или нуклеотидным компонентам, и/или биологической активности.

Выражение "содержит любые подходящие замещения в кодоне" подразумевает любое замещение или введение заместителя в кодоне, кодирующем ту же аминокислоту, или ее добавление или удаление, при условии, что полученный фермент обладает активностью лиазы.

Другими словами настоящее изобретение охватывает модифицированные ДНК последовательности, в которых по крайней мере один нуклеотид был удален, замещен или модифицирован, или в который введен по крайней мере один дополнительный нуклеотид с тем, чтобы кодировать полипептид, обладающий активностью глюканлиазы, преимущественно полипептид, обладающий повышенной активностью лиазы.

Крахмал предпочтительно применяют в больших концентрациях - приблизительно до 25% в растворе.

Субстрат преимущественно подвергают воздействию фермента в присутствии буферного раствора.

Еще более предпочтительно субстрат подвергают воздействию фермента в присутствии практически чистой воды.

Субстрат преимущественно подвергают воздействию фермента в присутствии кофактора.

В соответствии с настоящим изобретением заявляется также способ получения сахара 1,5-D-ангидрофруктозы, включающий обработку альфа-1,4-глюкана ферментом альфа-1,4-глюканлиазой, отличающийся тем, что фермент содержит последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 1, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 2, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 5, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 6, или любую последовательность аминокислотных остатков с номерами идентификации 9-11, или любые их разновидности.

В соответствии с настоящим изобретением заявляется также сахар 1,5-D-ангидрофруктоза, полученный по способу, который заявляется в настоящем изобретении.

Структура 1,5-D-ангидрофруктозы, полученной по способу настоящего изобретения, была подтверждена и охарактеризована с помощью ¹³C ЯМР спектроскопии.

Одно из ключевых преимуществ способа по настоящему изобретению заключается в том, что сахар 1,5-D-ангидрофруктоза может быть получен в значительно больших количествах, чем ранее, при этом данный способ проще и дешевле, чем известные способы. Например, сахар можно получить в количествах, превышающих 100 г, в частности 500 г, по сравнению с известными из области техники способами, в которых были и могли быть получены значительно меньшие количества сахара, в частности микрограммовые количества.

Типичными реакциями, катализируемыми альфа-1,4-глюканлиазой, являются: 1) Амилопектин ---> 1,5-D-ангидрофруктоза + незначительное количество декстрина 2) Амилоза ---> 1,5-D-ангидрофруктоза + незначительное количество декстрина.

3) Декстрин ---> 1,5-D-ангидрофруктоза + глюкоза В реакции 1) соотношение двух продуктов зависит от структуры амилопектина или распределения альфа-1,6-глюкозидных связей в молекуле амилопектина.

В реакциях 2) и 3) соотношение продуктов зависит от степени полимеризации субстрата. В реакции 3) отношение между 1,5-D-ангидрофруктозой и глюкозой зависит от степени полимеризации. Например, если декстрин содержит 10 единиц глюкозы, то соотношение 1,5-D-ангидрофруктоза:глюкоза составит 9:1.

Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что в значительной степени могут быть расщеплены глюканы, содержащие связи, отличные от альфа-1,4-связей, в то время, как ранее достигалось лишь частичное их расщепление. Значительное расщепление предшественника 1,5-D-ангидрофруктозы является одним из факторов, который приводит к повышению выхода 1,5-D-ангидрофруктозы.

Другое преимущество заключается в том, что 1,5-D-ангидрофруктоза представляет собой природное вещество, а потому она пригодна для употребления в пищу человеком. Например, ее можно превратить в антибиотик микротецин, действуя на 1,5-D-ангидрофруктозу дегидразой. Известно использование антибиотиков для биоконсервации пищевых продуктов, которая является важной сферой технологии приготовления пищи. Однако в настоящее время при получении 1,5- D-ангидрофруктозы и микротецина встречаются с рядом трудностей. Например, могут быть получены лишь небольшие их количества. Процесс является также дорогим.

Настоящее изобретение преодолевает эти проблемы путем продуцирования большого количества дешевой 1,5-D-ангидрофруктозы, а также других продуктов, таких как микротецин. Могут быть получены количества 1,5-D-ангидрофруктозы от одного грамма до одного килограмма.

Еще одно преимущество заключается в том, что лиаза устойчива при температуре 4^oC в течение года и ее можно лиофилизировать без потери активности.

Другим преимуществом является то, что лиаза продуцирует 1,5-D-ангидрофруктозу непосредственно из крахмала и не требует присутствия какого-либо кофактора.

Еще одно преимущество заключается в том, что фермент можно использовать в чистой воде. Этот результат является весьма удивительным.

На основе простых свойств лиазы по настоящему изобретению можно было бы ожидать, что стоимость получения 1,5- D-ангидрофруктозы будет сравнима со стоимостью получения глюкозы. Особое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что лиаза по настоящему изобретению не требует присутствия каких-либо кофакторов, которые обычно очень дороги.

В общем случае субстратами для фермента могут быть альфа-1,4-глюканы.

В качестве субстрата предпочтительно использовать крахмал.

В предпочтительном способе осуществления настоящего изобретения используют растительный или желатинизированный крахмал или гидролизат крахмала. Гидролизат крахмала может быть получен как химически, так и ферментативно.

Если фермент используют для частичного расщепления крахмала, то фермент может добавляться либо до введения лиазы, либо можно применить другой дополнительный расщепляющий крахмал реагент (такой, как фермент глюканогидролаза), который может добавляться одновременно.

Лиаза превращает глюкан в 1,5-D-ангидрофруктозу. Фермент присоединяется к субстрату с невосстанавливающего конца и оставляет без изменения лишь восстанавливающий сахар. Остаточную глюкозу можно удалить известными способами, некоторые из которых приводятся в настоящем описании.

Используя приведенную здесь реакцию, можно получить 1,5-D-ангидрофруктозу в больших количествах.

В одном из способов осуществления настоящего изобретения альфа-1,4-глюканлиазу выделяют из инфицированных грибком водорослей, таких как Gracilariopsis lemaneiformis, и очищают методом аффинной хроматографии на колонке с бета-циклодекстрин-сефарозой, ионообменной хроматографией на колонке с Mono Q HR5/5 и гель- фильтрацией на колонке с Superose 12. Очищенный фермент продуцирует 1,5-D-ангидрофруктозу из альфа-1,4-глюканов.

Для грибковой лиазы, выделенной из инфицированной грибком Gracilariopsis lemaneiformis, оптимальный интервал pH при использовании амилопектина составляет 3,5-7,5, оптимальная температура составляет 50^oC, а величина pI составляет 3,9.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения альфа-1,4-глюканлиазу выделяют из грибков Morchella costata методом аффинной хроматографии на колонке с бета-циклодекстрин-сефарозой, ионообменной хроматографией на колонке с Mono Q HR 5/5 и гель-фильтрацией на колонке с Superose 12. Очищенный фермент продуцирует 1,5-D-ангидрофруктозу из альфа-1,4- глюканов.

Значение pI для выделенной из грибков лиазы по данным изоэлектрического фокусирования на гелях с градиентом pH от 3 до 9 составляет приблизительно 5,4. Молекулярный вес, определяемый методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS - PAGE) в градиенте 8-25% геля, составляет 110 кДа. Оптимальная величина pH для фермента составляет 5-7. Оптимальная температура равна 30-45^oC.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения альфа-1,4-глюканлиазу выделяют из грибков Morchella vulgaris и очищают методом аффинной хроматографии на колонке с бета-циклодекстрин-сефарозой, ионообменной хроматографией на колонке с Mono Q HR 5/5 и гель-фильтрацией на колонке с Superose 12. Очищенный фермент продуцирует 1,5-D-ангидрофруктозу из альфа-1,4-глюканов. Еще в одном из способов осуществления настоящего изобретения альфа-1,4-глюканлиазу выделяют из водорослей, таких как Gracilariopsis lemaneiformis, и очищают методом аффинной хроматографии на колонке с бета-циклодекстрин-сефарозой, ионообменной хроматографией на колонке с Mono Q HR 5/5 и гель-фильтрацией на колонке с Superose 12. Очищенный фермент продуцирует 1,5-D-ангидрофруктозу из альфа-1,4-глюканов.

Типичные оптимальные значения pH и температуры для катализируемых лиазой реакций для ряда ферментов альфа-1,4-глюканлиаз по настоящему изобретению приведены далее (см. табл. 1).

Ферменты по настоящему изобретению превращают амилозу и амилопектин в 1,5-D-ангидрофруктозу.

Проводя испытания с мальтозасахаридами, мы обнаружили, что лиаза обладает низкой активностью по отношению к мальтозе и еще меньшей активностью по отношению к мальтотриозе и мальтогептозе, а наибольшую активность проявляет по отношению к мальтотетрозе и мальтопентозе. Для указанных мальтозасахаридов фермент не ингибирует субстрат вплоть до концентрации 10 мг/мл.

Определяют первичную структуру фермента из одного из предпочтительных источников, а последовательность аминокислотных остатков будет представлена позднее. Также позднее будет представлена ДНК последовательность, кодирующая ферменты.

Таким образом, в настоящем изобретении описывается новый расщепляющий крахмал фермент, а именно новая альфа-1,4-глюканлиаза. Она представляет собой фермент, который был очищен и охарактеризован впервые.

Как указано ранее, настоящее изобретение также относится к специфическим способам использования 1,5-D-ангидрофруктозы.

В частности, настоящее изобретение относится к использованию 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве антиоксиданта, в частности антиоксиданта для пищевых продуктов и напитков.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением заявляется использование 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве антиоксиданта.

Преимущественно 1,5-D-ангидрофруктозу применяют вместе с употребляемыми в пищу веществами.

Преимущественно 1,5-D-ангидрофруктозу употребляют в пищевых продуктах и напитках.

Предпочтительно 1,5-D-ангидрофруктозу применяют в сочетании с другим антиоксидантом.

Предпочтительно 1,5-D-ангидрофруктозу получают в соответствии со способом по настоящему изобретению.

Основное преимущество при использовании 1,5-D-ангидрофруктозы заключается в том, что она является природным продуктом, не участвует в обмене веществ, легко получается, растворима в воде и в целом не является токсичной.

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к ферментативному получению 1,5-D-ангидрофруктозы, которая может применяться в качестве полезного растворимого в воде антиоксиданта для использования в пище и для других целей. Примеры приведены для использования 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве антиоксиданта в пищевых композициях.

Из приведенных примеров следует, что 1,5-D-ангидрофруктоза сравнима по своим свойствам с имеющимися на рынке высококачественными антиоксидантами для пищевых продуктов.

Из не связанных с пищевыми продуктами применений можно назвать использование в полимерах в качестве поглотителя кислорода в процессе синтеза полимеров. Кроме того, 1,5-D-ангидрофруктозу можно использовать при синтезе биоразлагаемых пластических масс.

Эксперименты показывают, что 1,5-D-ангидрофруктоза может быть эффективным восстановителем (антиоксидантом), поскольку она может легко восстанавливать 3,5-динитросалициловую кислоту в 3-амино-5-нитросалициловую кислоту.

1,5-D-Ангидрофруктоза представляет собой вещество природного происхождения, а потому она обладает большим потенциалом при использовании в качестве приемлемого антиоксиданта. 1,5-D-Ангидрофруктозу можно также превратить в антибиотик микротецин действием на 1,5-D-ангидрофруктозу дегидразы. Известно использование антибиотиков для биоконсервации пищевых продуктов, которая является важной сферой биотехнологии пищи.

Другой аспект настоящего изобретения относится к использованию 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве подслащивателя, в частности в качестве подслащивателя для пищевых продуктов и напитков, преимущественно пищевых продуктов и напитков, употребляемых человеком.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением заявляется использование 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве подслащивателя.

1,5-D-Ангидрофруктозу предпочтительно используют в качестве подслащивателя в пищевых продуктах и напитках, употребляемых человеком.

1,5-D-Ангидрофруктоза может использоваться в любом требуемом количестве, таком как 5%-ный раствор, или от 100 мг/кг до 500 мг/кг.

Преимущество использования 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве подслащивателя заключается в том, что она является природным продуктом, в целом не токсична, растворяется в воде, не участвует в обмене веществ и легко получается.

Таким образом, в настоящем изобретении заявляется также новое использование 1,5-D-ангидрофруктозы в качестве подслащивателя.

Предпочтительно 1,5-D-ангидрофруктозу получают в соответствии со способом по настоящему изобретению.

Другие аспекты настоящего изобретения включают: - способ получения фермента альфа-1,4-глюканлиазы, включающий выделение фермента из водорослей, инфицированных грибками, из грибков и из самих водорослей; - фермент, содержащий последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 1, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 2, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 5, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 6, или любую их разновидность; - фермент, содержащий последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 9, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 10, или последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 11, или любая их разновидность; - последовательность нуклеотидов, кодирующую фермент альфа-1,4-глюканлиазу, в которой последовательность преимущественно не находится в своем природном окружении (т.е. она не является частью природного генома клеточного организма, способного экспрессировать фермент) и в которой нуклеотидная последовательность преимущественно является ДНК последовательностью; - последовательность нуклеотидов, в которой ДНК последовательность содержит по крайней мере одну последовательность, которая совпадает, или комплементарна, или в значительной степени гомологична, или содержит любые подходящие замещения в кодоне любой из следующих последовательностей: последовательности с номером идентификации 3, или последовательности с номером идентификации 4, последовательности с номером идентификации 7, последовательности с номером идентификации 8, где последовательность преимущественно находится в изолированной форме; - последовательность нуклеотидов, в которой ДНК последовательность содержит по крайней мере одну последовательность, которая совпадает, или комплементарна, или в значительной степени гомологична, или содержит любые подходящие замещения в кодоне любой из следующих последовательностей: последовательности с номером идентификации 12, или последовательности с номером идентификации 13, последовательности с номером идентификации 14, где последовательность преимущественно находится в изолированной форме; и - использование бета-циклодекстрина для очистки фермента, предпочтительно альфа-1,4-глюканлиазы.

Другие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения включают любые из следующих: трансформированный организм-хозяин, способный продуцировать 1,5-D-ангидрофруктозу в результате введения приведенной в настоящем описании ДНК последовательности; такой трансформированный организм-хозяин, который является микроорганизмом - преимущественно организм-хозяин выбирают из группы, включающей бактерии, плесени, грибки и дрожжи, организм-хозяин преимущественно выбирают из группы, включающей Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Pichia, Bacillus, Streptomyces, Eschericia, таких как Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefascien, Eschericia coli; способ получения 1,5- -ангидрофруктозы, включающий использование трансформированного организма-хозяина, экспрессирующего нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент альфа-1,4-глюканлиазу, где нуклеотидная последовательность является ДНК последовательностью, где ДНК последовательность является одной из приведенных последовательностей; вектор, включающий приведенную в данном описании последовательность нуклеотидов, где вектор преимущественно является вектором репликации, преимущественно вектором экспрессии, содержащим нуклеотидную последовательность в прямом направлении от последовательности промотора, где вектор включает маркер (такой как маркер резистентности); клеточный организм или клеточная линия, трансформированная таким вектором; способ получения продукта альфа-1,4-глюканлиазы или любой последовательности нуклеотидов или ее части, кодирующей альфа-1,4-глюканлиазу, который включает выращивание указанного организма (или клеточной линии), трансформированного указанным вектором, и выделение продукта.

В частности, в системе экспрессии фермент должен преимущественно секретироваться так, чтобы облегчить его очистку. С этой целью ДНК, кодирующую готовый фермент, сливают с сигнальной последовательностью, промотором и терминатором из выбранного хозяина.

Для экспрессии в Aspergillus niger промотор gpd A (из гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из Aspergillus nidulans) и сигнальную последовательность сливают с 5'-концом ДНК, кодирующей готовую лиазу. Последовательность терминации trpC из A.niger помещают 3'-концом к гену (P.J. Punt et al. , J. Biotech., Vol. 17, pp.19-34 [1991]). Полученную генетическую конструкцию помещают в вектор, содержащий сайт инициации репликации для E.coli и маркер селекции для A.niger. Примерами маркеров селекции для A.niger является ген amdS, ген arg B, ген pyr G, ген hyg B, ген BmlP, которые все используются для селекции трансформантов. Эту плазмиду можно трансформировать в A.niger и готовую лиазу можно выделить из среды с культурой, содержащей трансформанты. В конечном счете конструкцию можно трансформировать в лишенную протеазы цепочку, чтобы уменьшить протеолитическое расщепление лиазы в среде с культурой (D.B. Archer et al., Biotechnol. Lett. 1992, Vol. 14, pp. 357-362).

Вместо Aspergillus niger в качестве организма-хозяина могут использоваться другие играющие важную роль в промышленности микроорганизмы, для которых известны хорошие системы экспрессии, такие как Aspergillus oryzae, Aspergillus sp., Thicgoderma sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Hansenula sp. , Pichia sp., Bacillus subtilis, Bacillus Amyloliquefasciens, Bacillus sp., Streptomyces sp., или E. coli.

Следующие образцы 10 июня 1994 г. депонированы в соответствии с Будапештским соглашением в признанный депозитарий The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) по адресу 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom, AB2 1RY: E. coli, содержащая плазмиду pGL1 (NCIMB 40652) - [номер для ссылок DH5alpha-pGL1] и E. coli, содержащая плазмиду pGL2 (NCIMB 40653) - [номер для ссылок DH5alpha-pGL2].

Следующий образец 11 октября 1984 г. был принят на депонирование в соответствии с Будапештским соглашением в признанный депозитарий The Culture Collection of Algae and Prozoa (CCAP) по адресу Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3, Argyll, Sotland, United Kingoton, PA34 4AD: Gracilariopsis lemaneiformis, инфицированный грибком (CCAP 1373/1) - [номер для ссылок (GLC-1 (Хиндао)].

Наиболее предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения включают фермент альфа-1,4-глюканлиазу, которая может быть получена экспрессией кодирующей альфа-1,4-глюканлиазу последовательности, присутствующей в плазмиде, депонированной под номером NCIMB 40652 или NCIMB 40653; или фермент альфа-1,4-глюканлиазу, которая может быть получена из инфицированных грибками водорослей, депонированных под номером CCAP 1373/1.

Следующие образцы 3 октября 1994 г. депонированы в соответствии с Будапештским соглашением в признанный депозитарий The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) по адресу 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom, AB2 1RY: E. coli, содержащая плазмиду pMC (NCIMB 40687) - [номер для ссылок DH5alpha-pMC]; E. coli, содержащая плазмиду pMV1 (NCIMB 40688) - [номер для ссылок DH5alpha-pMV1]; и E. coli, содержащая плазмиду pMV2 (NCIMB 40689) - [номер для ссылок DH5alpha-pMV2].

Плазмида pMC представляет собой pBluescript 11 KS, содержащий фрагмент размером в 4100 оснований, выделенный из геномной библиотеки, полученной из Morchella costata. Фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-1,4-глюканлиазу.

Плазмида pMV1 представляет собой pBluescript 11 KS, содержащий фрагмент размером в 2450 оснований, выделенный из геномной библиотеки, полученной из Morchella vulgaris. Фрагмент содержит 5'-конец гена, кодирующего альфа-1,4-глюканлиазу.

Плазмида pMV2 представляет собой pPU C19, содержащий фрагмент размером в 3100 оснований, выделенный из геномной библиотеки, полученной из Morchella vulgaris. Фрагмент содержит 3'-конец гена, кодирующего альфа-1,4-глюканлиазу.

Как указано ранее, кодирующая альфа-1,4-глюканлиазу последовательность из Morchella vulgaris содержится в двух плазмидах. На фиг. 15 показано, что pMV 1 содержит нуклеотиды от позиции 454 до позиции 2902; а pMV 2 содержит нуклеотиды в прямом направлении от (в том числе) позиции 2897. Как показано на фиг. 12 и 13, для присоединения кодирующей последовательности можно подвергнуть pMV 2 расщеплению действием ферментов рестрикции EcoRI и BamHI, а затем вставить нужный фрагмент в плазмиду pMV 1, подвергнутую ферментации действием ферментов рестрикции EcoRI. и BamHI.

Таким образом, наиболее предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения включают фермент альфа-1,4-глюканлиазу, полученную экспрессией кодирующих альфа-1,4-глюканлиазу последовательностей, входящих в состав плазмид, депонированных под номером NCIMB 40687, или под номером NCIMB 40688, или под номером NCIMB 40689.

Следующий образец 11 октября 1984 г. был принят на депонирование в соответствии с Будапештским соглашением в признанный депозитарий The Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) по адресу Dunstuffnage Marine Laboratory PO Box 3, Oban, Argyll, Scotland, United Kingdom, PA34 4AD: Gracilariopsis lemaneiformis, инфицированный грибком (CCAP 1373/2) - [номер для ссылок GLC-1 (Калифорния)].

Таким образом, наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает фермент альфа-1,4-глюканлиазу, которая может быть получена из инфицированных грибками водорослей, депонированных под номером CCAP 1373/2.

Изобретение далее поясняется на примере возможных вариантов его осуществления.

В приведенных примерах даются ссылки на прилагаемые чертежи, на которых: Фиг. 1 показывает окрашенные водоросли, инфицированные грибком.

Фиг. 2 показывает окрашенные водоросли, инфицированные грибком.

На фиг. 3 приведен разрез грибковой гифы.

На фиг. 4 приведен разрез водорослей, инфицированных грибком.

На фиг. 5 приведен разрез водорослей, инфицированных грибком.

На фиг. 6 приведена карта плазмиды pGL1.

На фиг. 7 приведена карта плазмиды pGL2.

На фиг. 8 приведена последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 3 и показано расположение пептидных фрагментов, первичная структура которых определялась.

Фиг. 9 показывает соотнесение последовательности с номером идентификации 1 и последовательности с номером идентификации 2.

Фиг. 10 представляет собой микрофотографию.

На фиг. 11 приведена карта плазмиды pMC.

На фиг. 12 приведена карта плазмиды рМV1.

На фиг. 13 приведена карта плазмиды рМV2.

На фиг. 14 изображена последовательность, кодирующая альфа-1,4-глюканлиазу, и часть 5'- и 3'-концевых нетранслируемых участков для геномной ДНК, полученной из Morchella costata.

На фиг. 15 изображена последовательность, кодирующая альфа-1,4-глюканлиазу, и часть 5'- и 3'-концевых нетранслируемых участков для геномной ДНК, полученной из Morchella vulgaris.

На фиг. 16 проводится сравнение последовательностей, кодирующих альфа-1,4-глюканлиазу, и нетранслируемых участков из Morchella costata и Morchella vulgaris.

На фиг. 17 представлена последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 5 и показано расположение пептидных фрагментов, первичная структура которых определялась.

На фиг. 18 представлена последовательность аминокислотных остатков с номером идентификации 6 и показано расположение пептидных фрагментов, первичная структура которых определялась.

На фиг. 19 приведены графики поглощения кислорода в присутствии и в отсутствии 1,5-D-ангидрофруктозы.

На фиг. 20 представлена пластинка для тонкослойной хроматографии.

Если более конкретно, то фиг.1 показывает окрашивание с помощью Calcoflour White, выявляющее грибки в верхней части и в нижней части Gracilariopsis lemaneiformis (108х и 294х).

Фиг. 2 показывает окрашивание Gracilariopsis lemaneiformis вместе с грибком с помощью PAS/Anilinblue Black. Грибки содержат значительно большее количество углеводов.

Фиг. 3 представляет собой микрофотографию, на которой показаны продольные и поверхностный срезы двух тонкостенных гиф грибков (f), растущих между толстыми стенками (w) клеток водорослей. Отмечены тилакоидные мембраны в хлоропласте водорослей (стрелки).

Фиг. 4 показывает, что обнаруженные с помощью пробы клона 2 (верхняя стрелка) десенсибилизированные участки ограничены грибками, которые для наглядности окрашены с помощью Calcoflor White на нижнем срезе (нижняя стрелка) (46х и 108х).

Фиг. 5 показывает, что обнаруженные с помощью пробы клона 2 интенсивные десенсибилизированные участки наблюдаются над грибками в Gracilariopsis lemaneiformis (294х).

На фиг.6 приведена карта плазмиды pGL1, которая представляет собой pBluescript 11 KS, содержащую фрагмент размером в 3800 оснований, выделенный из геномной библиотеки, которую получают из Gracilariopsis lemaneiformis, инфицированной грибками. Фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-1,4-глюканлиазу.

На фиг. 7 приведена карта плазмиды pGL2, которая представляет собой pBluescript 11 КS, содержащую фрагмент размером в 3600 оснований, выделенный из геномной библиотеки, которую получают из Gracilariopsis lemaneiformis, инфицированной грибками. Фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-1,4-глюканлиазу.

На фиг. 9 приведено соотнесение последовательности аминокислотных остатков с номером идентификации 1 (GL1) и последовательности аминокислотных остатков с номером идентификации 2 (GL2). Общее количество аминокислотных остатков для GL1 составляет 1088, а общее количество аминокислотных остатков для GL2 составляет 1091. При проведении сравнения используют структурно-генетическую матрицу (значение открытого разрыва: 10; значение единичного разрыва: 2). На фиг. 9 указанием на идентичность двух сравниваемых остатков является значок ":", а значок "." указывает на то, что сравниваемые последовательности похожи. "Похожими" считаются аминокислоты A, S, T; D, E; N, Q; R, K; I, L, М, V; F, Y, W. Всего отмечена идентичность по 845 аминокислотам (т. е. 77,67%); и схожесть по 60 аминокислотам (5,51%). Количество разрывов, вставленных в 1, составляет 3, а количество разрывов, вставленных в GL2, составляет 2.

На фиг. 10 приведена фотография гифы грибка (f), растущей между стенками водорослей (w). Отмечены окрашенные зерна крахмала (s) и тилакоиды (стрелки) в клетках водорослей.

На фиг. 14 общее количество оснований составляет 4726; Состав ДНК последовательности: 1336 A; 1070 C; 1051 G; 1269 T. Стартовый кодон ATG показан жирным шрифтом. Интроны подчеркнуты. Кодон остановки указан курсивом.

На фиг. 15 общее количество оснований составляет 4670; состав ДНК последовательности: 1253 A; 1072 C; 1080 G; 1265 T. Стартовый кодон ATG показан жирным шрифтом. Интроны подчеркнуты. Кодон остановки указан курсивом.

На фиг. 16 двумя сравниваемыми последовательностями являются последовательности, полученные из Morchella costata (общее количество остатков: 1066) и из Morchella vulgaris (общее количество остатков: 1070). При проведении сравнения используют структурно-генетическую матрицу (значение открытого разрыва: 10; значение единичного разрыва: 2). На этом чертеже указанием на идентичность двух сравниваемых остатков является значок ":", а значок "." указывает на то, что сравниваемые последовательности похожи. "Похожими" считаются аминокислоты A, S, T; D, E; N, Q; R, K; I, L, M, V; F, Y, W. Всего отмечено: идентичность - 920 (86,30%); схожесть - 51 (4,78%). Количество разрывов, вставленных в Morchella costata составляет 1, а количество разрывов, вставленных в Morchella vulgaris, составляет 1.

В приведенных распечатках последовательностей: последовательность с номером идентификации 5 представляет собой последовательность аминокислотных остатков для альфа-1,4-глюканлиазы, полученной из Morchella costata; последовательность с но