Способ получения рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека

Способ получения рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Способ осуществляют культивированием рекомбинантного штамма-продуцента Е.соli SG 20050/рТNF311, разрушением клеток ультразвуком и удалением клеточного дебриса. Хроматографическую очистку продукта проводят последовательно на ДЕАE-целлюлозе в линейном градиенте NaCl при рН 7,6 0,1, на гидроксилапатите в линейном градиенте К-фосфата при рН 6,9 0,1 и вновь на ДЕАЕ-целлюлозе. Способ упрощает и повышает степень очистки рекомбинантного ФНО-альфа. 7 ил., 4 табл.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и представляет собой способ выделения и очистки физиологически активного вещества из штамма-продуцента, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую полипептид со свойствами фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) человека, и может быть использовано для производства рекомбинантного ФНО-альфа человека с целью его исследования и применения в медицине.

ФНО-альфа продуцируется в организме главным образом активированными макрофагами и представляет собой полипептид с молекулярной массой около 17000 Da, состоящий из 157 аминокислотных остатков. Первоначально открыт в 1975 году, как вещество, способное вызывать некроз MetA саркомы у мышей. Далее in vitro было показано, что он способен вызывать лизис опухолевых клеток различных линий и не действует на нормальные клетки организма. К настоящему времени показано, что ФНО-альфа обладает различными биологическими активностями, играет ключевую роль в иммунной и воспалительной реакциях организма [1-3].

Глубокие и широкомасштабные исследования ФНО-альфа, как и других эукариотических белков, стали возможны благодаря технике рекомбинантных ДНК, позволившей нарабатывать этот белок в больших количествах путем микробиологического синтеза. Во всем мире широко проводятся клинические испытания препаратов на основе рекомбинантного ФНО-альфа в качестве противоопухолевого средства и для лечения тяжелых вирусных инфекций (псориаз, гепатит B) [4-6].

Известны способы получения рекомбинантного ФНО-альфа человека микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных плазмид [7-22]. Способы [7-17] основаны на использовании штаммов E.coli и рекомбинантных плазмид, содержащих ген ФНО-альфа под регуляцией температур чувствительного промотора или промоторов лактозного и триптофанового оперонов. Для выделения и очистки целевого белка используют разрушение клеток известными способами, центрифугирование клеточного экстракта и далее 3-4 стадии очистки осветленного экстракта клеток с использованием следующих процедур: фракционирование сульфатом аммония, хроматография на ультрагеле АсА34, Моно-Q, ДЕАЕ-целлюлозе, сефарозе с красителем, геле TSK-G200 SWG, на колонке с моноклональными антителами к ФНО-альфа, электрофокусировка, обессоливание известными способами, ультрафильтрация. Получаемый продукт имеет чистоту 95-98% по электрофорезу в денатурирующих условиях, цитолитическая активность по отношению трансформированных клеток мышиных фибробластов L929 или клеток L-M составляет от 110⁶ до 4,510⁷ ед.акт./мг белка. Выход в большинстве работ не указан, в способе [9] был высоким и составлял 63% от содержания ФНО-альфа в исходном экстракте клеток.

Существенным недостатком всех описанных в работах [7-17] способов является сложный способ культивирования рекомбинантного штамма-продуцента, требующий в ходе процесса осуществлять индукцию синтеза целевого белка в строго определенное нормируемое время либо повышением температуры ферментации, либо добавлением дорогостоящих индукторов: 3-индолуксусная кислота, 3-индолакриловая кислота, изопропилтиогалактозид (ИПТГ).

Способы [18-22] основаны на использовании рекомбинантных штаммов E.coli, в которых гены ФНО-альфа экспрессируются в ходе выращивания клеток постоянно, без индукции.

В способе [18] клетки E.coli D1210/pHNtac₄ выращивают в L-бульоне, содержащем ампициллин. Собирают клетки центрифугированием, разрушают пропусканием через пресс, осветленный экстракт хроматографируют на ДЕАЕ-сефарозе, концентрируют, прогревают до 60^oC, снова хроматографируют на ДЕАЕ-сефарозе и проводят гельфильтрацию на Сефакриле S-200. Относительный выход ФНО-альфа по активности составляет 41%, удельная цитолитическая активность препарата низкая - 1,410⁶ ед./мг белка. Абсолютный выход целевого белка также низкий 1,5 мг из 1 г культуры (4 - 6 г клеток).

Способ [19] позволяет получить рекомбинантный ФНО-альфа с высокой удельной активностью (10⁷ ед. акт. /мг белка), но способ очистки сложен, состоит из 3-х хроматографических процедур на различных фирменных сорбентах: ДЕАЕ-целлюлоза CL-68, фенил-сефароза 4B, сефакрил S-20 или Q-сефароза. Выход целевого белка не указан.

Способы [20, 21] используют для эффективной очистки рекомбинантного ФНО-альфа аффинную хроматографию на колонке с моноклональными антителами. Данные о выходе продукта отсутствуют. Недостатки этих способов следующие: сложность и высокая стоимость получения иммунного сорбента, трудность масштабирования процесса, необходимость дополнительного контроля целевого продукта на отсутствие онкогенного материала родительской миеломной клетки, используемой при получении моноклональных антител.

Наиболее близким (прототипом) к заявляемому способу является способ [22] . Способ основан на использовании штамма E.coli SG20050, трансформированного плазмидой pTNF31, несущей ген ФНО-альфа под контролем промоторов ранней области бактериофага 17, обеспечивающих конститутивный синтез целевого белка. Биомассу штамма-продуцента разрушают с помощью ультразвука (4 раза по 5 мин), отделение клеточного дебриса осуществляют ультрафильтрацией через мембрану с размером пор 0,2 мкм на установке Minitan (фирма "Миллипор", США). Полученный осветленный экстракт разбавляют водой до электропроводности 2,0 мкСм/см и наносят на соединенные последовательно колонки с сорбентами H--гель (2,5 х 10 см) и QAE--гель (2,5 х 15 см). После промывки буфером колонку с нейтральным H--гелем отсоединяют и элюцию белков с QAE--геля осуществляют линейным градиентом 0 - 0,4 М NaCl в буфере pH 7,5. Фракции анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [23] . Белковые фракции, содержащие 65% ФНО-альфа, объединяют, разбавляют водой в 2 раза, доводят pH раствора до 5,0 с помощью 1М HCl и наносят на колонку с катионообменником P--гелем (1,5 х 15 см), уравновешенную 30 мМ лимонной кислотой pH 5,0. Элюцию белков осуществляют градиентом 0 - 0,4 М NaCl в растворе лимонной кислоты pH 5,0. Фракции, содержащие не менее 98% ФНО-альфа, объединяют и подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-25 с целью перевода целевого белка в другой буфер: 50 мМ трис-HCl pH 7,5. Конечный продукт стерилизуют ультрафильтрацией и хранят при 4^oC. Выход ФНО-альфа составляет 47% от содержания его в клеточном экстракте. При содержании ФНО-альфа в продуценте в количестве 24% от суммы клеточных белков это составляет 127 мг из 14 г биомассы (9 мг ФНО-альфа из 1 г биомассы). Чистота препарата составляет 98% по данным электрофореза (нагрузка на гель 10 мкг) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), удельная активность, определенная в цитотоксическом тесте на линии клеток WEHI, составляет 210⁷ ед./мг белка.

Метод по способу-прототипу эффективен, обеспечивает высокий выход целевого белка, но сложный. Требует наличия специального, нетрадиционного для осветления клеточного экстракта оборудования - импортной ультрафильтрационный установки. В способе используют четыре различных сорбента: нейтральный H--гель, анионообменник - QAE--гель, катионообменник - P--гель и сефадекс G-25. В качестве буферной системы при хроматографии на P--геле используют дорогой реактив - лимонную кислоту (ос.ч.).

Разрушение клеток ультразвуком проводят в жестком режиме, 4 цикла озвучивания по 5 мин, допуская нагрев обрабатываемой смеси до 50^oC. Такой режим способствует глубокому разрушению клеток и клеточных структур и выходу в раствор всех компонентов клетки: в том числе нуклеиновых кислот, липополисахаридов (ЛПС), от которых необходимо очистить целевой белок тщательно. Содержание ДНК, ЛПС и бактериальных белков в рекомбинантных белках, используемых в медицине, крайне нежелательно и строго нормируется: содержание ДНК должно быть не более 100 пг/мг белка, а содержание ЛПС и белков штамма-продуцента не более 200 нг/мг белка [24-26]. В способе-прототипе характеристика целевого белка по этим показателям не приводится.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа очистки рекомбинантного ФНО-альфа и получение высокоочищенного препарата, пригодного для использования в медицине.

Поставленная цель достигается использованием в способе штамма E.coli SG20050, трансформированного плазмидой pTNF311, кодирующей полипептид ФНО-альфа человека с 5-ой по 157 аминокислоту под контролем двух промоторов ранней области фага T7 [27] в совокупности с очисткой полипептида путем дезинтеграции клеток ультразвуком, отделением клеточного дебриса центрифугированием и 3-х последующих хроматографий клеточного экстракта на 2-х сорбентах: ДЕАЕ-целлюлозе ДE-52 при значениях pH 7,5 - 7,7, на гидроксилапатите при значениях pH 6,8 - 7,0 и снова на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52. Конечный продукт наиболее полно характеризуется по показателям качества с целью использования его в медицине.

Сущность способа заключается в следующем.

Биомассу клеток E.coli SG20050/pTNF311, выращенную стандартным способом в L-бульоне и собранную центрифугированием, суспендируют в буфере (20 мМ трис-HCl pH 7,66, 0,5 мМ ЭДТА, 20 мМ NaCl, 0,5 мМ PMSF) в соотношении 6-7 мл буфера на 1 г клеток. Суспензию подвергают обработке ультразвуком 5-6 раз по 1 мин с интервалом между обработками, равным 1 мин (до прекращения падения оптической плотности взвеси при длине волны 550 нм). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием и супернатант наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52 (из расчета 1 г клеток, 45-60 мг белка на 6-7 мл сорбента). Колонку промывают буфером A (20 мМ трис-HCl, 0,5 мМ ЭДТА pH 7,5 - 7,7) и белки элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,15 М в буфере A. Элюированный с колонки раствор ФНО-альфа при концентрации NaCl 0,07 - 0,08 М разбавляют двумя объемами буфера A и наносят на колонку с гидроксилапатитом (из расчета около 12 мг белка на 1 мл сорбента). Колонку промывают буфером B (0,05 М K-фосфат pH 6,8 - 7,0) и белки элюируют линейным градиентом концентраций K-фосфата от 0,05 до 0,33 М. Раствор ФНО-альфа, элюированный с колонки при концентрации 0,28 - 0,30 М K-фосфата, имеет чистоту около 87%. Продукт диализуют против буфера A и подвергают повторной хроматогграфии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52 (из расчета 6-7 мг белка на 1 мл сорбента), как описано выше. Препарат ФНО-альфа, элюированный с сорбента при концентрации NaCl 0,07 - 0,08 М, имеет чистоту более 95%. Выход электрофоретически гомогенного препарата ФНО-альфа составляет 50 - 60% от содержания в исходном клеточном экстракте (табл. 1 и 2).

При содержании ФНО-альфа в продуценте в количестве 24% от суммы клеточных белков это составляет 258 мг ФНО-альфа из 30 г клеток (8,6 мг из 1 г клеток). Удельная специфическая активность получаемого препарата, определенная в цитотоксическом тесте на линии мышиных фибробластов L929 [28], составляет не менее 310⁷ ед./мг белка. Содержание примесных белков штамма-продуцента в конечном продукте, определенное методом иммуноферментного анализа [29], составляет не более 200 нг/мг ФНО-альфа; содержание примесей ДНК [29], определенное методом молекулярной гибридизации, не более 100 пг/мг ФНО-альфа; содержание ЛПС, определенное химико-ферментативным методом [30], не более 200 нг/мг ФНО-альфа.

Высокая чистота получаемого рчФНО-альфа показана также методом ВЭЖХ. При анализе на хроматографе PU410 на колонке Nucleosil SC18 в градиенте ацетонитрила от 0 до 80% в 0,1% трифторуксусной кислоте препарат элюируется одним симметричным пиком (фиг. 2).

Иммуноблот препарата с моноклональными антителами не обнаруживает на электрофоретической дорожке полос, не реагирующих с антителами. Основная полоса с молекулярной массой (16,70,3) кДа составляет при иммуноблоте не менее 95% (фиг. 3).

Спектр кругового дихроизма препарата рчФНО-альфа, снятый на спекрополяриметре J-600 в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,2, полностью совпадает со спектром КД для природного ФНО-альфа [31, 32] (фиг. 4).

Определение общего аминокислотного состава после кислотного гидролиза белка на аминокислотном анализаторе "Biotronic LC5001" показывает, что он в пределах ошибки метода соответствует составу природного ФНО-альфа с 5-ой по 157-ю аминокислоту (табл. 3).

N-концевой анализ препарата показал следующую последовательность: S-R-T-P-S-D-K. . . , что соответствует структуре природного ФНО-альфа с 5-ой по 11-ю аминокислоту. С-концевая аминокислота рчФНО-альфа - лейцин, что соответствует C-концу природного ФНО-альфа.

Биологические свойства препарата ФНО-альфа испытаны в различных культурах клеток: L929 (трансформированные фибробласты мыши), NiH 3T3 (слабоопухолевая линия фибробластов мыши), FCB A2 V40 (высокозлокачественная саркома мыши), M19 (диплоидные фибробласты человека), СПЭВ (клетки почки свиньи) и Таурус (клетки почки теленка). Показано, что препарат рчФНО-альфа оказывает выраженное лизирующее действие на различные злокачественные клетки (табл. 4).

Таким образом, все вышеперечисленные физико-химические и биологические характеристики конечного продукта, полученного предлагаемым способом, указывают на то, что это высокоочищенный белок со свойствами ФНО-альфа человека, пригодный как для научных исследований, так и для исследования в медицине.

Новым по сравнению со способом-прототипом признаком является использование штамма E.coli SG20050/pTNF311 в совокупности с разрушением клеток ультразвуком в более мягких условиях, удалением клеточного дебриса центрифугированием и хроматографической очисткой целевого продукта на двух доступных коммерческих сорбентах: ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52 при pH 7,5 - 7,7 и гидроксилапатите при pH 6,8 - 7,0. Именно эта совокупность признаков позволяет получить высокоочищенный препарат рекомбинантного ФНО-альфа, пригодного для применения в медицине.

Разрушение клеток ультразвуком в течение 5 мин при температуре (82)^oC вместо 20 мин и допустимой в ходе обработки температуры 50^oC, как предлагается способом-прототипом, позволяет практически полностью извлечь в раствор целевой белок (21-24% от суммы всех белков), но при этом меньше разрушить клеточные структуры - нуклеопротеиды, клеточные мембраны, и тем самым сократить выход в раствор нежелательных ДНК и липополисахаридов. Для удаления крупных клеточных обломков применен традиционный способ - центрифугирование при 18000 об/мин на центрифуге типа J-21, используемой при получении ФНО-альфа на стадии сбора биомассы штамма-продуцента. Отпадает необходимость в использовании для осветления клеточного экстракта дополнительного импортного оборудования для ультрафильтрации. Использование в предлагаемом способе анионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в две стадии (общий выход сорбента 8,3 мл на 1 г биомассы), вместо QAE--геля (10 мл сорбента на 1 г клеток) и сорбционной хроматографии на гидроксилапатите (1,7 мл на 1 г клеток), вместо хроматографии на катионообменнике P--геле (1,7 мл на 1 г клеток) позволяет исключить для очистки клеточного экстракта третий сорбент - нейтральный H--гель, а также дефицитный дорогой реактив - лимонную кислоту в качестве буферной системы на катионообменнике. Использование диализа на стадии перевода конечного продукта в буфер для хранения вместо гельфильтрации также упрощает предлагаемый способ и избавляет от использования еще одного сорбента - сефадекса G-25.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенный целевой продукт с высоким выходом из клеток, в которых содержание ФНО-альфа колеблется от 10 до 20% (табл. 1, 2), что указывает на его эффективность. Метод легко масштабируется.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений.

Фиг. 1. Электрофоретический анализ белков в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS [23] в процессе очистки ФНО-альфа, дорожки: 1 - клеточный экстракт, 2 - целевая фракция с ДЕАЕ-целлюлозы I, 3 - целевая фракция с гидроксилапатита, 4 - целевая фракция с ДЕАЕ-целлюлозы II (нагрузка 10 мкг белка), 5 - то же (нагрузка 40 мкг белка).

Фиг. 2 Обращенно-фазовая хроматография рекомбинантного ФНО-альфа.

Фиг. 3. Взаимодействие препарата рчФНО-альфа с моноклональными антителами к ФНО-альфа (иммуноблот).

Фиг. 4. Спектр КД рчФНО-альфа в 0,01 М фосфатном буфере pH 7,2.

Фиг. 5. Электрофоретический анализ цитоплазматических белков в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS в ходе разрушения ультразвуком, дорожки: 1-9 - белки клеточных экстрактов после разрушения клеток в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 мин соответственно, 10 - белки из осадка после разрушения клеток в течение 9 мин.

Фиг. 6. Электрофоретический анализ белков в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS в процессе очистки ФНО-альфа с использованием стадии фракционирования белков сульфатом аммония, дорожки: 1 - клеточный экстракт, 2 - целевая фракция белков с ДЕАЕ-целлюлозы, 3 - белки, осажденные 40% сульфатом аммония, 4 - белки, осажденные 80% сульфатом аммония (ФНО-), 5 - белки маркеры, 6-14 - элюция ФНО-альфа с гидроксилапатита, 15 - готовый продукт по способу с применением сульфата аммония, 16 - готовый продукт по заявляемому способу (пример 1).

Фиг. 7. Электрофоретический анализ белков в 15%-ном геле в присутствии SDS после хроматографии грубого экстракта клеток на ДЕАЕ-целлюлозе при pH 7,0, дорожки: 1 - клеточный экстракт, 2 - целевая фракция с ДЕАЕ-целлюлозы.

Примеры конкретного выполнения способа приведены ниже.

Пример 1. Получение высокоочищенного препарата рекомбинантного ФНО-альфа 30 г клеток (E.coli SG20050/pTNF311) суспендируют в 200 мл буфера для разрушения (20 мМ трис-HCl pH 7,60,1, 20 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ PMSF) до гомогенного состояния. Затем суспензию помещают в ледяную баню и подвергают обработке ультразвуком (установка УЗДН-2Т) при частоте 22 кГц и амплитуде (172) мкм 5 раз по 1 мин с интервалом по 1 мин для охлаждения смеси (температура не должна превышать (82)^oC). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 18000 об/мин в течение 60 мин (JA-21, ротор JA-14 t = 42^oC), и супернатант наносят на колонку (V = 200 см³) с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52, уравновешенную буфером A (20 мМ трис-HCl, 0,5 мМ ЭДТА pH 7,60,1). Колонку промывают буфером A до снижения оптической плотности в вытекающем растворе при длине волны 280 нм до исходного значения, и белки элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,15 М в буфере A (объем градиента 1000 мл). Собирают фракции объемом 10 мл и анализируют электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, по Леммли [23]. ФНО-альфа обычно элюируется с колонки при концентрациях NaCl 0,07 - 0,085 М. Фракции, содержащие ФНО-альфа, объединяют (V = 235 мл), добавляют два объема буфера A. После этого наносят на колонку (V = 50 см³) с гидроксилапатитом, уравновешенную буфером Б (0,05 М калий-фосфат pH 6,90,1). Колонку промывают буфером Б до снижения оптической плотности в вытекающем растворе при длине волны 280 нм до исходной и белки элюируют линейным градиентом концентрации калий-фосфата от 0,05 до 0,33 М, pH 6,90,1. Собирают фракции объемом 5 мл и анализируют электрофорезом, как указано выше. ФНО-альфа обычно элюируется при концентрации калий-фосфата 0,28 - 0,30 М. Фракции с содержанием ФНО-альфа 70% и более объединяют (10922 мл) и диализуют против 2 л буфера А в течение 17 ч при температуре 4^oC. Затем раствор ФНО-альфа наносят на колонку (V = 50 см³) с ДЕАЕ-целлюлозой ДE-52, уравновешенную буфером А. Хроматографию проводят, как описано на 1-ой стадии очистки. Объем градиента 200 мл, собирают фракции объемом 3 мл. Фракции, содержащие при анализе одну белковую фракцию с молекулярным весом 16,70,3 кДа, объединяют, диализом переводят в буфер Б и стерилизуют ультрафильтрацией, используя мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Относительный выход ФНО-альфа составляет 56% от содержания его в грубом экстракте клеток, 252 мг из 30 г биомассы (8,4 мг из 1 г биомассы). Препарат электрофоретически гомогенен при нагрузке на лунку 40 мкг белка (фиг. 1, дорожка 5). Удельная цитотоксическая активность на клетках L929 составляет 3,510⁷ ед.акт./мг белка. Содержание примесных белков E.coli составляет 127 нг/мг ФНО-альфа, содержание примесей ДНК - 80 пг/мг препарата и содержание ЛПС 160 нг/мг препарата.

Пример 2. Исследование зависимости полноты извлечения рекомбинантного ФНО-альфа от времени обработки клеток ультразвуком Биомассу штамма-продуцента суспендируют в буфере, затем помещают в ледяную баню и подвергают обработке ультразвуком, как описано в примере 1. Отбирают пробы после каждого одноминутного цикла озвучивания. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием, а супернатанты подвергают электрофоретическому анализу в денатурирующих условиях. Полученные результаты представлены на фиг. 5. Из данных фиг. 5 следует, что после 5-6 мин обработки клеток ультразвуком целевой белок практически полностью переходит в раствор, и дальнейшая обработка клеток ультразвуком нецелесообразна, т.к. может привести к более глубокой деградации клеточных структур и выходу в раствор нежелательных компонентов клетки: белков, ДНК, ЛПС.

Пример 3. Получение высокоочищенного ФНО-альфа с использованием стадии фракционирования белков сульфатом аммония 2,7 г клеток суспендируют в 19 мл буфера, подвергают обработке ультразвуком, клеточный дебрис удаляют центрифугированием, супернатант хроматографируют на колонке (20 см³) с ДЕАЕ-целлюлозой (см. пример 1). Фракции, содержащие ФНО-альфа, объединяют (V = 56 см³). Далее к раствору медленно при помешивании добавляют сульфат аммония до 40% насыщения (136 г). Образовавшийся осадок белков удаляют центрифугированием, к супернатанту медленно при помешивании добавляют сульфат аммония до 80% насыщения и дают осадку сформироваться, выдерживая на холоду 3-4 ч. Затем осадок собирают центрифугированием, растворяют в буфере Б и диализуют против этого же буфера в течение 12 ч. Отдиализованный раствор белков подвергают хроматографической очистке на колонке с гидроксилапатитом, как описано в примере 1. Относительный выход конечного препарата составляет около 35% от содержания ФНО-альфа в клеточном экстракте. Препарат при электрофорезе кроме основной полосы с молекулярной массой 16,70,3 кДа содержит продукт деградации ФНО-альфа (фиг. 6, дорожка 15). Замечено, что продукт деградации появляется на стадии фракционирования белков сульфатом аммония (фиг. 6, дорожка 6), и в ходе последующей хроматографии на гидроксилапатите он не удаляется (фиг. 6, в дорожках 7-15).

Пример 4. Использование натрий-фосфатного белка pH 7,0 при разрушении клеток и хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе 6,35 г клеток суспендируют в 25 мМ натрий-фосфатном буфере pH 7,0, содержащем 20 мМ NaCl и 0,5 мМ PMSF, помещают суспензию в ледяную баню, разрушают клетки и центрифугируют, как описано в примере 1. Супернатант диализуют в течение 6 ч против 1 л 25 мМ натрий-фосфатного буфера pH 7,0, содержащего 0,5 мМ PMSF (буфер меняют через 3 ч). Отдиализованный раствор белков ( 300 мг) наносят на колонку (40 см³) с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52, уравновешенную 25 мМ натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,5 мМ PMSF, промывают тем же буфером до снижения оптической плотности раствора при 280 нм до исходного значения, а сорбированные белки элюируют градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,3 М. Анализируют фракции электрофорезом. Обнаружено, что ФНО-альфа не сорбируется на колонку и элюируется при нанесении и промывке сорбента буфером. При этом не достигнуто хорошей очистки от примесных белков (фиг. 7).

Пример 5. Определение биологической активности препарата рекомбинантного ФНО-альфа человека Для определения биологических свойств препарата рекомбинантного ФНО-альфа человека использовали культуры злокачественных клеток: L929 (трансформированные фибробласты мыши) NiH3T3 (низкозлокачественная линия фибробластов мыши), FCBA2V40 (высокозлокачественная саркома мыши) и культуры нормальных клеток: M19 (диплоидные фибробласты человека), СПЭВ (клетки почки свиньи) и Таурус (клетки почки теленка). Для культивирования клеток использованы общепринятые методы. Клетки (3-410³) в объеме 100 мкл среды вносят в ячейки планшет для культур клеток ("Диматек", США), инкубируют при 37^oC от 24 до 48 ч до образования монослоя. Затем среду сливают, вносят в лунки по 100 мкл двухкратных разведений препарата рчФНО-альфа в случае нормальных клеток и десятикратных разведений в случае злокачественных клеток, и используя на каждое разведение не менее 4-х лунок. Планшет с культурой клеток инкубируют при 37^oC в течение 22-72 ч в атмосфере с (5,00,5)% углекислого газа. За дегенерацией клеток в культуре монослоя следят под микроскопом (окуляр 10х, объектив 10х) и путем окраски их кристаллвиолетом. Для окраски клеток из лунок планшет удаляют среду и вносят в лунки 50 мкл 0,5% раствора кристаллвиолета в 20%-ном этиловом спирте. Через 30 мин краситель удаляют. Лунки промывают 4-5 раз дистиллированной водой. Подсушивают перевернутыми на фильтровальную бумагу при 37^oC в течение 30 мин. Затем добавляют в лунки элюирующий раствор и измеряют оптическую плотность в вертикальном спектрофотометре при длине волны 540 нм. За титр специфической активности рчФНО-альфа принимают величину, обратную максимальному его разведению, которая вызывает 50% гибель клеток (понижение поглощения в 2 раза по сравнению с контролем). Полученные результаты представлены в таблице 4. Эти результаты четко указывают на то, что препарат рекомбинантного ФНО-альфа проявляет свойства природного ФНО-альфа человека, т. е. оказывает выраженное литическое действие (гибель) на злокачественные клетки. Нормальные клетки практически не чувствительны к действию ФНО.

Таким образом, в ходе экспериментов показано, что высокоочищенный рчФНО-альфа можно получить из штамма E.coli SG 20050/pTNF311, сочетая разрушение клеток ультразвуком в подобранных условиях и очистку целевого белка из осветленного экстракта путем 3-х последовательных хроматографий на ДЕАЕ-целлюлозе при pH 7,5 - 7,7, на гидроксилапатите при pH 6,8 - 7,0 и повторно на ДЕАЕ-целлюлозе. Предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет: - исключить из процесса импортную ультрафильтрационную установку и дефицитный дорогостоящий реактив - лимонную кислоту; - использовать два сорбента (ДЕАЕ-целлюлозу и ГАП) вместо четырех (H--гель, QAE--гель, P--гель и сефадекс G-25).

При этом сохраняются высокий выход продукта, высокая удельная цитолитическая активность и препарат охарактеризован на чистоту и достоверность по всем показателям, требуемым для медицинских генно-инженерных препаратов.

Литература 1. Недоспасов С.А., Турецкая Р.Л., Шахов А.Н. //Итоги науки и техники. Иммунология. 1988. N 22. С. 91.

2. Кетлинский С. А. , Белова А.А. и др. //Успехи современной биологии. 1989. N 107. вып. 1. С. 79-91.

3. Tracty K.J. // The Cytokine Handbook ed. A. Thomson. 1994. Academic. Press. P. 289-304.

4. Kemeny N., Childs. B., Larchian N. et. al. //Cancer. 1990. V. 66. N. 4. P. 659-663.

5. Takematsu H., Ozawa H., Yoshimura t. et. al. //British. J. Dermatology. 1991. V. 124., N. 2. P. 209-210.

6. Sheron N., Lau J.Y.N., Daniels H.M. et. al. //Lancet. 1990. V. 336. P. 321-322.

7. Заявка WO 86/03751, кл. A 61 K 37/02, 45/02, опублик. 03.10.86.

8. Патент SU 1614765, кл. C 12 N 15/28, опублик. 15.12.90. Б.N 46.

9. Патент SU 1630602, кл. A 61 K 37/02, опублик. 23.02.91. Б.N 7.

10. Заявка ЕПВ 0158286, кл. C 12 N 15/00, опублик. 16.10.85. Б.N 42.

11. Заявка ЕПВ 0251037, кл. C 12 P 21/02, опублик. 07.01.88. Б.N 1.

12. Tkehara Morio, Fujimoto Kazuko et. al. //Chem. and Pharm. Bull. 1988. V. 36., N. 1. P. 291-296.

13. Wang A. M. , Crensey A.A., Ladner M.B. et. al. //Science. 1985. V. 228., N. 4696. P. 149-154.

14. Nobuhara M. , Kanamori T. et. al. //14th Symp. Nucl. Acids Chem., Tokushima, Oct. 30th-Nov. 1st. 1986. Oxford. Washington. D.C. 1986. P. 134-137.

15. Marmenout A., Fransen A.L., Tavernier J. et. al. // Eur. J. Biochem. 1985. V. 152., N. 3. P. 515-522.

16. Davis J.M., Narachi M.A. et. al. //Biochemistry. 1987. V. 26., N. 5. P. 1322-1326.

17. Ashman K., Matthews N., Frank R.W. //Protein Eng. 1989. V. 2., N. 5. P. 387-391.

18. Shirai T. , Yamaguch H. Ito H. et. al. //Nature. 1985. V. 313. N. 6005. P. 803-806.

19. Tsujimoto M., Tanaka S., Sakuhragawa Y. //Biochem. 1987. V. 101., N. 4. P. 919-925.

20. Nakamura S. , Masegi S., Fukuoka M. et. al. //Agrical. Biol. Chem. 1991. N. 1. P. 53-57.

21. Афанасьев В.М., Хлебников В.С. //Препаратив. хроматогр. физ. актив. веществ на полимер. сорбентах: Тез. докл. 1 Всес. Симп. Ленинград. 11-13 окт. 1988. - Л. 1988. С. 21.

22. Тихонов Р.В., Якимов С.А., Коробко В.Г., Вульфсон Ф.Н. //Биоорган. химия. 1996. Т. 22., N. 3. С. 163-167.

23. Laemmli U.K. // 1970. V. 227. P. 680.

24. РФ 42-28-9-89. Общие требования к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методом генетической инженерии. Москва. 1988.

25. Roth R.I., Levin J. //Methods in Enzymology. 1994. V. 231. P. 75-91.

26. Tanaka S., Iwanaga //Methods in Enzymology. 1993. V. 223. P. 358-364.

27. Патент РФ N 1445193, кл. 6 C 12 N 15/28. 1/21. Опубл. 20.03.96. Б. N 8.

28. Kramer S.M., Carwer M.E. //Immunol. Meth. 1986. V. 93. P. 201.

29. ВФ 42-226 ВС-89. Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2 (полуфабрикат).

30. Заявка на патент РФ N 93008125/13. Положительное решение от 30.01.96.

31. Davis J.M. et. al. //Biochemistry. 1987. V. 26. P. 1322-1326.

32. Narachi M.A. et. al. //J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 13107-13110.

33. Aggarwal B. B. et. al. //J. Biol. Chem. 1985. V. 260. N. 4., P. 2345-1354.6

Формула изобретения

Способ получения рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека, включающий культивирование штамма-продуцента, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса и хроматографию на колонках с сорбентами, отличающийся тем, что в качестве источника рекомбинантного ФНО-альфа человека используют штамм E.coli SG20050/pTNF311, а хроматографическую очистку продукта проводят последовательно на ДЕАЕ-целлюлозе в линейном градиенте NaCl при pH 7,6 0,1, на гидроксилапатите в линейном градиенте К-фосфата при pH 6,9 0,1 и вновь на ДЕАЕ-целлюлозе.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10

Другие изменения, связанные с зарегистрированными изобретениями

Изменения:Зарегистрирован переход исключительного права без заключения договораДата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 11.12.2009/РП0000390Патентообладатель: Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человекаПрежний патентообладатель: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Номер и год публикации бюллетеня: 3-2000

Извещение опубликовано: 20.01.2010        БИ: 02/2010

QC4A Государственная регистрация расторжения зарегистрированного договора

Дата и номер государственной регистрации расторгаемого договора: 24.07.2001 № 12857

Вид договора: лицензионный

Лицо(а), передающее(ие) исключительное право: Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "ВЕКТОР" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (RU)

Лицо, приобретающее право использования: Общество с ограниченной ответственностью "ДИАФАРМ" (RU)

Дата и номер государственной регистрации расторжения договора: 22.07.2011 РД0084416

Дата публикации: 10.09.2011