Способы и композиции, применимые для модуляции ангиогенеза с использованием протеинкиназы raf и ras

Способы и композиции, применимые для модуляции ангиогенеза с использованием протеинкиназы raf и ras

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет Предварительной патентной заявки с регистрационным номером 60/215951, поданной 5 июля 2000 года, и Предварительной патентной заявки с регистрационным номером 60/148924, поданной 13 августа 1999 года.

Область техники

Данное изобретение относится в общем к области медицины и, в частности, относится к способам и композициям для модуляции ангиогенеза тканей с использованием протеинкиназы Raf или Ras, вариантов Raf или Ras, с использованием реагентов, которые модулируют Raf или Ras, и с использованием кодирующих их нуклеиновых кислот.

Предпосылки изобретения

Ангиогенез является процессом васкуляризации тканей, который включает в себя рост новых кровеносных сосудов в ткань, и называется также реваскуляризацией (неоваскуля-ризацией). Этот процесс опосредован инфильтрацией эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц. Считается, что этот процесс происходит одним из трех путей: сосуды могут ответвляться от предсуществующих сосудов, de novo развитие сосудов может возникать из клеток-предшественников (образование и развитие сосудов) или существующие небольшие сосуды могут увеличиваться в диаметре. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990).

Ангиогенез является важным процессом в неонатальном росте, но является также важным в заживлении ран и в патогенезе большого числа клинических заболеваний, в том числе воспалении тканей, артрите, росте опухоли, диабетической ретинопатии, макулярной дегенерации за счет реваскуляризации сетчатки и подобных состояний. Эти клинические проявления, ассоциированные с ангиогенезом, называют ангиогенными заболеваниями. Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987). Ангиогенез обычно отсутствует во взрослых или зрелых тканях, хотя он действительно происходит при заживлении ран и в цикле роста желтого тела. См., например, Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990).

Предполагалось, что ингибирование ангиогенеза могло бы быть полезной терапией для ограничения опухолевого роста. Ингибирование ангиогенеза предлагалось посредством (1) ингибирования высвобождения «ангиогенных молекул», таких как bFGF (основной фибробластный фактор роста), (2) нейтрализации ангиогенных молекул, например, с использованием антител против bFGF, (3) применения ингибиторов рецептора витронектина α_vβ₃ и (4) ингибирования реакции эндотелиальных клеток на ангиогенные стимулы. Эта последняя стратегия привлекла внимание, и Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96 (1992) описали несколько ингибиторов реакции эндотелиальных клеток, в том числе ингибитор коллагеназы, ингибиторы обновления базальной мембраны, ангиостатические стероиды, полученные из грибов ингибиторы ангиогенеза, тромбоцитарный фактор 4, тромбоспондин, лекарственные средства против артрита, например D-пеницилламин и тиомалат золота, аналоги витамина D, альфа-интерферон и т.п. ингибиторы, которые могут быть использованы для ингибирования ангиогенеза. В отношении дополнительных предлагаемых ингибиторов ангиогенеза см. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988) и Патенты Соединенных Штатов Америки с номерами 5092885, 5112946, 5192744, 5202352, 5753230 и 5766591. Однако ни один из ингибиторов ангиогенеза, описанных в предыдущих ссылках, не включал в себя Raf-белки.

Для того чтобы происходил ангиогенез, эндотелиальные клетки должны сначала разрушиться и пересечь базальную мембрану кровеносного сосуда способом, сходным со способом, используемым опухолевыми клетками во время инвазии и образования метастазов.

Ранее сообщалось, что ангиогенез зависит от взаимодействия между васкулярными интегринами и белками внеклеточного матрикса. Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994). Кроме того, сообщалось, что запрограммированная смерть клеток (апоптоз) ангиогенных васкулярных клеток инициируется взаимодействием, которое могло бы ингибироваться некоторыми антагонистами васкулярного интегрина α_vβ₃. Brooks et al., Cell, 79:1157-1164 (1994). Не так давно сообщалось, что связывание металлопротеиназы-2 матрикса (ММР-2) с рецептором витронектина (α_vβ₃) может быть ингибировано с использованием антагонистов α_vβ₃, и посредством этого происходит ингибирование ферментативной функции этой протеиназы. Brooks et al., Cell, 85:683-693 (1996).

Сущность изобретения

Данное изобретение рассматривает модуляцию ангиогенеза в тканях, где ангиогенез зависит от активности протеинкиназы Raf, называемой здесь также в общем Raf.

Рассматриваются композиции и способы для модуляции ангиогенеза в ткани, связанной с патологическим состоянием. Композицию, содержащую модулирующее ангиогенез количество Raf-белка, вводят в ткань, подлежащую лечению в отношении патологического состояния, которая отвечает на модуляцию ангиогенеза. Композиция, обеспечивающая Raf-белок, может содержать очищенный белок, биологически активные фрагменты белка, рекомбинантно полученные белок или фрагменты или слитые белки Raf или экспрессирующие векторы гена/нуклеиновой кислоты для экспрессии Raf-белка.

Если Raf-белок является инактивированным или ингибированным, модуляция является ингибированием ангиогенеза. Если Raf-белок является активным или активированным, модуляция является потенциированием ангиогенеза.

Тканью, подлежащей обработке, может быть любая ткань, в которой модуляция ангиогенеза является желательной. Для ингибирования ангиогенеза полезной является обработка подвергнутой заболеванию ткани, где происходит вредная реваскуляризация. Примеры тканей включают в себя воспаленную ткань, солидные опухоли, метастазы, ткани, подвергшиеся рестенозу, и тому подобные ткани.

Для потенциирования полезно лечить пациентов с гипоксическими тканями, например пациентов после удара (инсульта), инфаркта миокарда, или пациентов с хроническими язвами, с тканями ишемических конечностей, в которых имеется ненормальное, т.е. слабое, кровообращение вследствие диабетических или иных состояний. Могут лечиться также пациенты с хроническими ранами, которые не заживают и, следовательно, могли бы получить благопрятное действие от увеличения пролиферации васкулярных клеток и реваскуляризации.

Особенно предпочтительным является применение Raf-белка, содержащего модифицированную аминокислотную последовательность, описанную здесь. Несколько особенно полезных модифицированных Raf-белков, в том числе слитых Raf-белков, таких как Raf-caax, и конструкций нуклеиновых кислот, которые кодируют их экспрессию, описаны здесь и находятся в границах данного изобретения.

Данное изобретение включает в себя также фармацевтическую композицию, пригодную для ингибирования ангиогеиеза в ткани-мишени млекопитающего, содержащую вирусный или невирусный вектор переноса генов, содержащий нуклеиновую кислоту, причем эта нуклеиновая кислота имеет сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий Raf-белок, и Raf-белок имеет любой аминокислотный остаток в кодоне 375, за исключением лизина, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В особенно предпочтительном варианте используется Raf-белок, названный Raf К375М, и этот вариант описан в примерах ниже. Другой неактивной конструкцией Raf является нуклеиновая кислота, которая кодирует Raf-белок, имеющий удаленную карбоксиконцевую часть. Один из предпочтительных вариантов использует Raf-белок, названный Raf 1-305, который является неактивным Raf-белком.

Рассматривается также фармацевтическая композиция, пригодная для стимуляции ангиогенеза в ткани-мишени млекопитающего и содержащая вирусный или невирусный вектор переноса генов, содержащий нуклеиновую кислоту, причем эта нуклеиновая кислота имеет сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий Raf-белок, имеющий киназную активность, и его фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Предпочтительная нуклеиновая кислота кодирует ингибиторный слитый Raf-белок, который представляет собой Raf-caax. Другая ингибиторная конструкция Raf содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Raf-белок, имеющий делегированную аминоконцевую часть белка. Один предпочтительный вариант использует Raf-белок, названный Raf 306-648, и он описан в примерах ниже.

Далее данное изобретение рассматривает модуляцию ангиогенеза в тканях небольшой ГТФазой Ras, также называемой в общем Ras, вследствие ее роли в передаче сигнала Raf, как описано здесь. Также рассматривается модуляция ангиогенеза в тканях с использованием комбинации модуляции Ras и Raf. Такая комбинированная модуляция может иметь форму единого введения комбинированных композиций белка или нуклеиновой кислоты, кодирующей модулирующий белок, или отдельного введения индивидуальных доз, в ангиогенез-модулирующем количестве.

Рассматриваются композиции и способы для модуляции ангиогенеза в ткани, ассоциированной с патологическим состоянием, где эта модуляция направлена на опосредованный Raf путь ангиогенеза через Ras-белок. Композицию, содержащую ангиогенез-модулирующее количество Ras-белка, вводят в ткань, подлежащую лечению в отношении патологического состояния, которая реагирует на модуляцию ангиогенеза. Композиция, обеспечивающая Ras-белок, может содержать очищенный белок, биологически активные фрагменты белка, рекомбинантно полученные белок или фрагменты Ras-белка или слитые Ras-белки или экспрессирующие векторы гена/нуклеиновой кислоты для экспрессии Ras-белка.

Если Ras-белок является инактивированным или ингибированным, модуляция является ингибированием ангиогенеза. Если Ras-белок является активным или активированным, модуляция является потенциированием ангиогенеза. Фармацевтические композиции и способы применения доминантных негативных белков Ras, таких как S17N Ras или V12C40 Ras, обсуждаются в отношении применения способом, сходным со способом применения белков семейства Raf. В дополнительном аспекте данного изобретения фармацевтические композиции и способы применения для доминантных активных белков Ras, таких как G12V Ras или V12S35 Ras, обсуждаются для применений, сравнимых с применениями для белков семейства Raf.

Далее, рассматриваются способы модуляции ангиогенеза в ткани, ассоциированной с патологическим состоянием, предусматривающие введение модулирующего ангиогенез количества фармацевтической композиции, содержащей Raf-белок или нуклеотидную последовательность, способную экспрессировать Raf-белок, и Ras-белок или нуклеотидную последовательность, способную экспрессировать Ras-белок. В таких способах, где желательной модуляцией является ингибирование ангиогенеза, по меньшей мере, один или оба из Raf- или Ras-белков являются неактивными. Если желательной модуляцией является стимуляция ангиогенеза, по меньшей мере, один или оба из Raf- или Ras-белков являются активными.

Краткое описание чертежей

В этих чертежах, составляющих часть данного описания:

Фиг.1A-1D показывают, что экотропно упакованный ретровирус инфицирует только мышиные клетки. Экотропно упакованные клетки трансфицировали ретровирусной конструкцией, кодирующей ген β-галактозидазы (b-Gal), и супернатант собирали спустя 24 часа. Супернатант, содержащий вирус, помещали на полученные из мышей фибробласты (Фиг.1А), полученные из мышей эндотелиальные клетки (Фиг.1В), эпителиальные клетки аденокарциномы человека (Фиг.1C) или клетки меланомы человека (Фиг.1D) на 24 часа. Активность b-Gal визуализировали с использованием стандартных способов.

Фиг.2 показывает, что bFGF-индуцируемые увеличения активности Raf блокировались предварительной инфекцией Raf К375М в мышиной линии эндотелиальных клеток. Экотропно упакованные клетки трансфицировали ретровирусной конструкцией, кодирующей дефектный ген киназы Raf, и супернатант собирали спустя 24 часа. Супернатант, содержащий вирус, помещали на мышиные эндотелиальные клетки на 24 часа. Затем клетки обрабатывали bFGF в течение 5 минут и лизировали. Киназную активность Raf определяли количественно по способности иммунопреципитированной Raf-киназы фосфорилировать субстрат МЕК радиоактивно меченным ³²P. Реакционные смеси фракционировали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и проводили количественное определение с использованием сканирующей денситометрии.

Фиг.3А-3В показывают, что мутантная неактивная Raf K375M ингибирует bFGF-индуцированный ангиогенез в модели мышиного подкожного ангиогенеза. Ангиогенез индуцировали подкожной инъекцией в бок мыши 250 мкл охлажденного на льду, имеющего сниженное количество факторов роста матригеля, содержащего 400 нг/мл bFGF, с экспрессирующими ретровирус упакованными клетками или без этих клеток, которые экспрессируют Raf K375M. Спустя пять дней специфический для эндотелия FITC-конъюгированный лектин Bandeiriea Simplifica B5 инъецировали через хвостовую вену и давали циркулировать и выводили в течение 30 минут. Затем ангиогенез определяли количественно удалением, экстракцией и анализом ангиогенной ткани на флуоресцентное содержание (Фиг.3А). Реваскуляризацию подтверждали исследованием срезов под световым микроскопом (Фиг.3В).

Фиг.4А-4В показывают, что мутационно активный Raf стимулирует ангиогенез в мышиной модели подкожного ангиогенеза. Ангиогенез индуцировали подкожной инъекцией в бок мыши 250 мкл охлажденного на льду, имеющего сниженное количество факторов роста матригеля, содержащего экспрессирующие ретровирус упакованные клетки, которые экспрессируют GFP-контрольную или делегированную на аминоконце Raf-киназу (Raf 306-648). Спустя пять дней ангиогенез определяли количественно удалением, экстракцией и анализом ангиогенной ткани на флуоресцентное содержание (Фиг.4А). Реваскуляризацию подтверждали приготовлением срезов и окрашиванием красителем трихромом Mason (Фиг.4В).

Фиг.5A-5D показывают, что ретровирусная доставка Raf К375М-киназы в опухоль индуцировала апоптоз специфическим для эндотелия образом. Опухоли человека инъецировали подкожно на боку бестимусной мыши wehi (nu/nu) и давали им имплантироваться. Когда опухоли достигали 100 мм³, их инъецировали внутрь опухоли культуральным супернатантом, содержащим 10⁶ БОЕ экотропно упакованного Raf K375M. Спустя сорок восемь часов опухоль извлекали, готовили срезы и выполняли иммуногистохимию. Эндотелиальные клетки идентифицировали по экспрессии vWF (Фиг.5А), тогда как маркерную метку FLAG использовали для обнаружения клеток, инфицированных геном Raf К375М-киназы (Фиг.5В). Каждый из этих маркеров можно видеть колокализованным с маркером TUNEL, указывающим на апоптотические клетки (Фиг.5С и 5D).

Фиг.6А-6В показывают, что эндотелиальная доставка гена Raf К375М-киназы ингибировала рост опухоли и стимулировала регрессию опухоли. Опухоли человека инъецировали подкожно на боку бестимусной мыши wehi (nu/nu) и давали им расти до 100 мм³. В этой точке либо выполняли единственную инъекцию упакованных клеток, экспрессирующих Raf К375М-киназу, в смежном с опухолью участке, либо начинали ряд инъекций внутрь опухоли вирусного супернатанта. Эта стратегия приводила к быстрым регрессам опухолей, которые не наблюдали с инъекцией контрольного гена GFP (Фиг.6А). Этот регресс происходил быстро и сохранялся на протяжении всего эксперимента (Фиг.6В).

Фиг.7 изображает кДНК-последовательность, кодирующую с-Raf человека, которая является полной кодирующей последовательностью с делегированными интронами. Эта последовательность доступна через номер доступа GenBank Х03484 (GI-35841, HSRAFR) (SEQ ID NO:1).

Фиг.8 изображает кодируемую транслируемую последовательность аминокислотных остатков c-Raf человека, кодирующей последовательности, изображенной в последовательности нуклеиновой кислоты, показанной на Фиг.7 (SEQ ID NO:2).

Фиг.9 показывает, что ангиогенез зависит от активации пути Ras-Raf-MEK-ERK. Активность Ras была повышенной в лизатах хорионаллантоисной куриной мембраны (САМ), подвергнутых действию bFGF, как определено с использованием анализа Ras с оттягиванием САМ. САМ из 10-дневных куриных эмбрионов стимулировали локально фильтровальными дисками, пропитанными ЗФР или 30 нанограммами (нг) bFGF. Спустя 5 мин ткань САМ иссекали, гомогенизировали в лизисном буфере и затем активность Ras определяли по его способности осаждаться слитым с GST-белком, содержащим Ras-связывающий домен Raf. Поскольку только активный Ras связывает Raf, получали рекомбинантный белок, состоящий из Ras-связывающего домена Raf, конъюгированного с глутатион-S-трансферазой (GST). В свою очередь, GST конъюгировали с сефарозными гранулами, позволяющими осаждать активный Ras из лизата ткани.

Фиг.10 изображает кДНК, кодирующую нуклеотидную последовательность домена Ras дикого типа человека (wt H-Ras). (SEQ ID NO:3). Полная кодирующая последовательность для протоонкогена с-HA-Ras1 доступна через GenBank (GI=190890, HUMRASH). (SEQ ID NO:5).

Фиг.11 изображает последовательность аминокислотных остатков, кодируемую нуклеотидной последовательностью кДНК Ras дикого типа человека (wt H-Ras), показанной на Фиг.10. (SEQ ID NO:4).

Фиг.12 показывает, что инфекция мутантным нуль-Ras блокировала индуцируемый фактором роста ангиогенез в САМ. Пятнадцать микролитров (мкл) имеющего высокий титр ретровируса куриной саркомы, RCAS(А), кодирующего мутантный нуль-Ras, S17N Ras (H-Ras дикого типа с заменой Ser на Asn в позиции 17), локально наносили на фильтровальные диски на САМ, стимулированные bFGF, как описано на Фиг.9. Ангиогенез оценивали спустя 72 часа счетом точек ветвления сосудов.

Фиг.13А и 13В показывают схематически и в виде диаграммы, соответственно, что инфекция мутантной конструкцией Ras, Ras V12S35, которая селективно активирует путь Ras-Raf-MEK-ERK, индуцировала ангиогенез, тогда как мутантная конструкция, Ras V12C40, которая селективно активирует пути PI3K, не индуцировала ангиогенез. Пятнадцать мкл имеющего высокий титр вируса RCAS(А), кодирующего Raf-MEK-ERK-активирующую конструкцию Ras, Ras V12S35, или активирующую РI3-киназу конструкцию Ras, Ras V12C40, наносили локально на фильтровальные диски и результаты оценивали, как описано на Фиг.12.

Фиг.14 изображает нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок Raf-caax, где нуклеотидная последовательность, кодирующая карбоксиконец Raf человека (wt H-RAf), слита с нуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность из 20 аминокислотных остатков домена мембранной локализации К-Ras. (SEQ ID NO:6).

Фиг.15 изображает последовательность аминокислотных остатков Raf-caax, слитый белок, полученный из слитой нуклеотидной последовательности, изображенной на Фиг.14. (SEQ ID N0:7).

Фиг.16А-16Е и Фиг.16F, соответственно, в виде фотографий и диаграммы показывают, что ингибитор МЕК, PD98059, блокировал ангиогенез, индуцированный либо мутантным активным Ras, либо Raf. Вирус, кодирующий активирующую Ras конструкцию, Ras V12 (также называемую G12V), и активирующую Ras конструкцию, Raf-caax, наносили локально на фильтровальные диски, как описано на Фиг.12. Спустя 24 часа один (1) наномоль ингибитора МЕК, PD98059, добавляли на диск. Затем САМ оценивали, как описано на Фиг.12. Данные изображены в виде среднего ± стандартная ошибка (SE) для 20 эмбрионов.

Фиг.17A-17F и Фиг.17G, соответственно, в виде фотографий и диаграммы показывают, что ангиогенез, индуцированный Raf, но не Ras, был нечувствительным к ингибированию блокадой интегрина. Инфицирование обеими мутантными активными конструкциями Ras и Raf, индуцировало ярко выраженный ангиогенез, но только Ras-индуцированный ангиогенез ингибировался α_vβ₃-интегрин-блокирующими антителами. САМ из 10-дневных куриных эмбрионов стимулировали, как описано на Фиг.9 и 12, фильтровальными дисками, пропитанными либо ЗФР (контроль), bFGF, RCAS(А)-ретровирусными конструкциями G12V-Ras, либо Ras-caax. LM609, моноклональное антитело к интегрину α_vβ₃, доставляли внутривенно спустя 24 часа и ангиогенез оценивали анализом точек ветвления сосудов спустя 72 часа. Репрезентативные САМ показаны во вставке. Данные представляют собой среднее ± SE для 20 эмбрионов.

Фиг.18A-18D и 18Е, соответственно, в виде фотографий и диаграммы показывают, что коинфицирование САМ мутантной нуль-фокальной адгезионной киназой, FRNK, блокировало индуцированный Ras, но неиндуцированный Raf ангиогенез. Вирусы RCAS(А), кодирующие Ras V12 или Raf-caax, наносили локально, как описано на Фиг.12, вместе с вирусом RCAS (В), кодирующим FAK-родственную нуль-киназу (FRNK), на фильтровальный диск САМ. Данные представляют собой среднее ± SE для 20 эмбрионов.

Фиг.19А и 19B-19G, соответственно, в виде фотографий и диаграмм показывают, что FRNK блокировала индуцированный bFGF и Ras, но не Raf, ангиогенез в мышиной модели подкожного ангиогенеза. Ангиогенез индуцировали подкожной инъекцией в бок мыши 250 мкл охлажденного на льду имеющего сниженное количество факторов роста матригеля, содержащего 400 нг/мл bFGF, или экспрессирующих ретровирус Молони, упакованный в клетки, экспрессирующие описанный ген. Ретровирус FRNK добавляли к матригелю в виде имеющего высокий титр вируса, упакованного белком оболочки vsv.g. Спустя пять дней специфический для эндотелия FITC-конъюгированный лектин Bandeiriea Simplifica B5 инъецировали через хвостовую вену и давали циркулировать. Затем ангиогенез определяли количественно удалением, экстракцией и анализом ангиогенной ткани на флуоресцентное содержание.

Фиг.20А и 20В показывают, что коинфицирование САМ с мутантной нуль-фокальной адгезионной киназой, FRNK, блокировало Ras-индуцированную активацию Raf. САМ обрабатывали, как описано на Фиг.18, за исключением того, что спустя 24 часа ангиогенную ткань иссекали, солюбилизировали, Raf-иммунопреципитировали и активность Raf оценивали по ее способности фосфорилировать МЕК с убитой киназной активностью. Фиг.20А показывает анализированные иммунопреципитированные активные Raf-белки в сравнении с тотальными Raf-белками, под каждой из комбинаций приведенных выше результатов. Фиг.20В показывает в виде диаграммы результаты определений активного Raf при этих условиях.

Подробное описание изобретения

А. Определения

Аминокислотный остаток: Аминокислота, образуемая при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида при его пептидных связях. Аминокислотные остатки, описанные здесь, предпочтительно находятся в "L"-изомерной форме. Однако остатки в "D"-изомерной форме могут заменять любой L-аминокислотный остаток, пока полипептид сохраняет желательное функциональное свойство. NH₂ обозначает свободную аминогруппу, присутствующую на аминоконце полипептида. СООН обозначает свободную карбоксигруппу, присутствующую на карбоксиконце полипептида, в соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов (описанной в J.Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) и взятой в 37 CFR параграф 1.822(b) (2)).

Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены здесь формулами, левая и правая ориентация которых имеет общепринятое направление аминоконец → карбоксиконец. Кроме того, следует заметить, что черта в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков указывает пептидную связь со следующей последовательностью из одного или нескольких аминокислотных остатков.

Полипептид: обозначает линейный ряд аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями между альфа-аминогруппой и карбоксигруппой смежных аминокислотных остатков.

Пептид: в применении здесь обозначает линейный ряд не более чем приблизительно 50 аминокислотных остатков, связанных друг с другом, как в полипептиде.

Циклический пептид: обозначает соединение, имеющее содержащую гетероатомы циклическую структуру, которая включает в себя несколько амидных связей, как в типичном пептиде. Циклический пептид может быть циклизованным по типу связывания «головы с хвостом» линейным полипептидом, в котором N-конец линейного пептида имеет образованную амидную связь с концевой СООН-группой этого линейного пептида, или он может содержать кольцевую структуру, в которой структура полимера является гомогенной или гетерогенной и полимер содержит амидные связи и/или другие связи вблизи кольца, например дисульфидные мостики, тиоэфирные, тиоамидные, гуанидиносвязи и т.п.

Белок: обозначает линейный ряд из более чем 50 аминокислотных остатков, связанных друг с другом, как в полипептиде.

Слитый белок: обозначает полипептид, содержащий по меньшей мере два разных полипептидных домена, функционально связанных типичной пептидной связью («слитых»), где эти два домена соответствуют пептидам, не находящимся в слитом виде в природе.

Синтетический пептид: обозначает химически образованную цепь аминокислотных остатков, связанных вместе пептидными связями, которая не содержит природно встречающихся белков и их фрагментов.

В. Общие обсуждения

Данное изобретение относится в общем к обнаружению того, что ангиогенез опосредуется белком протеинкиназы Raf и что ангиогенез может модулироваться обеспечением либо активных, либо неактивных Raf-белков для потенциирования или ингибирования ангиогенеза, соответственно. Данное изобретение относится также к обнаружению того, что Ras-белок может влиять на Raf и благодаря этому модулировать ангиогенез.

Это открытие является важным вследствие роли, которую играет ангиогенез, образование новых кровеносных сосудов, в различных патологических процессах. С другой стороны, в том случае, когда ткани, ассоциированные с патологическим состоянием, требуют ангиогенеза для роста тканей, желательно ингибировать ангиогенез и тем самым ингибировать рост патологических тканей. В случае, когда ткань требует ангиогенеза для роста и заживления ткани, желательно потенциировать или стимулировать ангиогенез и тем самым стимулировать заживление и рост ткани.

Если рост новых кровеносных сосудов является причиной патологии, ассоциированной с патологической тканью, или способствует этой патологии, ингибирование ангиогенеза будет уменьшать вредные эффекты данного заболевания. Ингибированием ангиогенеза можно противодействовать заболеванию, ослаблять симптомы и в некоторых случаях вылечивать данное заболевание.

Примеры ткани, ассоциированной с заболеванием и реваскуляризацией, которая будет иметь пользу от модуляции ангиогенеза, включают в себя рак, ревматоидный артрит, глазные заболевания, например, диабетическую ретинопатию, воспалительные заболевания, рестеноз и т.п. Если рост новых кровеносных сосудов необходим для поддержания роста вредной ткани, ингибирование ангиогенеза уменьшает кровоснабжение этой ткани и тем самым способствует уменьшению массы ткани на основе требований кровоснабжения. Особенно предпочтительные примеры включают в себя рост опухолей, где реваскуляризация является непременным требованием для того, чтобы опухоль росла до толщины более нескольких миллиметров, и для установления метастазов твердых опухолей.

Если рост новых кровеносных сосудов способствует заживлению ткани, потенциирование ангиогенеза способствует заживлению. Примеры включают в себя лечение пациентов с ишемическими конечностями, в которых присутствует ненормальная, т.е. слабая циркуляция (кровоток) в результате диабета или других состояний. Рассматриваются также пациенты с хроническими ранами, которые не заживают и, следовательно, будут получать пользу от увеличения пролиферации и реваскуляризации клеток.

Способы данного изобретения являются эффективными отчасти вследствие того, что эта терапия является высокоизбирательной для ангиогенеза, но не для других биологических процессов.

Как описано ранее, ангиогенез включает в себя различные процессы, включающие в себя ревакуляризацию ткани, в том числе "разветвление" сосудов, васкулогенез (образование и развитие сосудов) или увеличение сосудов, причем все эти процессы ангиогенеза подвергаются действию одного Raf-белка или его действию вместе с Ras-белком. Считается, что за исключением заживления травматических ран, образования желтого тела и эмбриогенеза большинство процессов ангиогенеза связаны с патологическими процессами и, следовательно, применение данных терапевтических способов являются селективным для таких заболеваний и не имеет вредных побочных действий.

С. Raf-белки

Белок протеинкиназы Raf для применения в данном изобретении может варьироваться в зависимости от предполагаемого применения. Термины "Raf-белок" или "Raf" используются для совокупного обозначения различных форм белка протеинкиназы Raf, в активной или неактивной формах.

"Активный Raf-белок" обозначает любую из различных форм Raf-белка, которые потенциируют, стимулируют, активируют, индуцируют или увеличивают ангиогенез. Здесь описаны анализы для измерения потенциирования ангиогенеза, и они не должны рассматриваться как ограничительные. Белок считается активным, если уровень ангиогенеза является по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 25% и более предпочтительно на 50% более высоким, чем контрольный уровень, где в тест-систему не добавляют Raf. Предпочтительным тестом для измерения потенциирования является тест определения Raf-киназы in vitro, описанный в примерах, в котором субстрат МЕК фосфорилируется ³²P. Примеры активных Raf-белков описаны в примерах.

"Неактивный Raf-белок" обозначает любую из форм Raf-белка, которые ингибируют, уменьшают, задерживают или ограничивают ангиогенез. Анализы для измерения ингибирования ангиогенеза описаны здесь, и они не должны рассматриваться как ограничительные. Белок считается неактивным, если уровень ангиогенеза является, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно на 25% и более предпочтительно на 50% более низким, чем контрольный уровень, где в тест-систему не добавляют экзогенный Raf. Предпочтительным тестом для измерения ингибирования является тест определения Raf-киназы in vitro, описанный в примерах, в котором субстрат МЕК фосфорилируется ³²P. Примеры неактивных Raf-белков описаны в примерах.

Raf-белок, применимый в данном изобретении, может быть получен любым из множества способов, в том числе выделением из природных источников, в том числе ткани, образованием экспрессией рекомбинантной ДНК и очисткой, и т.п. Raf-белок может быть также обеспечен "in situ" введением системы генной терапии в представляющую интерес ткань, которая затем экспрессирует этот белок в данной ткани.

Ген, кодирующий Raf-белок, может быть получен различными способами, известными в данной области, и данное изобретение не должно пониматься как ограничительное в этом отношении. Например, хорошо известно, что природная история Raf включает в себя множество гомологов млекопитающих, птиц, вирусов и т.п. видов, и этот ген может быть легко клонирован с использованием способов кДНК-клонирования из любой ткани, экспрессирующей этот белок. Предпочтительный Raf для применения в данном изобретении является клеточным белком, таким как гомологи из млекопитающих или птиц, называемые c-Raf. Особенно предпочтительным является человеческий c-Raf. Дополнительным предпочтительным Raf-белком данного изобретения является слитый белок Raf, который является конститутивно активным, но независимым от опосредованной Ras активации. Такой Raf-белок может быть слитым белком. Предпочтительным Ras-независимым Raf-белком является Raf-caax, который является белком Raf дикого типа, слитым на карбоксиконце с доменом мембранной локализации K-Ras, описанным дополнительно в примерах.

D. Ras-белки

Ras-семейство ГТФаз для применения в данном изобретении может варьироваться в зависимости от предполагаемого применения. Термин «Ras-белок» или «Ras» обозначает любую из множества форм Ras-белка, либо в активной, либо в неактивной формах.

"Активный Ras-белок" обозначает любую из различных форм Ras-белка, которые потенциируют, стимулируют, активируют, индуцируют или увеличивают ангиогенез. Здесь описаны анализы для измерения потенциирования ангиогенеза при помощи Ras, и они не должны рассматриваться как ограничительные. Белок считается активным, если уровень ангиогенеза является по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 25% и более предпочтительно на 50% более высоким, чем контрольный уровень, где в тест-систему не добавляют Ras. Примерами активных Ras-белков являются Ras G12V, также называемый V12, и Ras V12S35, оба описаны в примерах.

"Неактивный Ras-белок" обозначает любую из форм Ras-белка, которые ингибируют, уменьшают, задерживают или ограничивают ангиогенез. Анализы для измерения ингибирования ангиогенеза описаны здесь, и они не должны рассматриваться как ограничительные. Белок считается неактивным, если уровень ангиогенеза является/ по меньшей мере, на 10%, предпочтительно на 25% и более предпочтительно на 50% более низким, чем контрольный уровень, где в тест-систему не добавляют экзогенный Ras. Примеры неактивных Ras-белков включают в себя нуль-мутантный (молчащий мутантный) Ras, называемый Ras S17N (или иногда N17), и V12C40, оба описаны дополнительно в примерах.

Ras-белок, применимый в данном изобретении, может быть получен любым из множества способов, в том числе выделением из природных источников, в том числе ткани, образованием экспрессией рекомбинантной ДНК и очисткой, и т.п. Ras-белок может быть также обеспечен "in situ" введением системы генной терапии в представляющую интерес ткань, которая затем экспрессирует этот белок в данной ткани.

Ген, кодирующий Ras-белок, может быть получен различными способами, известными в данной области. Данное изобретение не должно пониматься как ограничительное в этом отношении. Например, хорошо известно, что природная история Ras включает в себя множество гомологов из видов млекопитающих, птиц, вирусных и т.п. видов, и этот ген может быть легко клонирован с использованием способов кДНК-клонирования из любой ткани, экспрессирующей этот белок.

Должно быть понятно в результате данных указаний, что Ras-белок в его совокупных формах может быть использован в тех же самых различных вариантах, которые описаны здесь для Raf-белка, и, следовательно, детали для применения Ras-белка не повторяются снова и снова. Например, Ras может быть представлен в активной и неактивной форме для модуляции ангиогенеза, или может быть обеспечен экспрессией нуклеиновой кислоты продукта Ras-белка, посредством применения векторной системы доставки, и в различных фармацевтических (терапевтических) композициях и промышленных изделиях для применения на практике данного изобретения. Рассматриваются также способы модуляции ангиогенеза, использующие реагент на основе Ras вместо цитированных реагентов на основе Raf.

Е. Рекомбинантные молекулы ДНК и системы экспрессии для экспрессии Raf- или Ras-белка

Данное изобретение описывает несколько нуклеотидных последовательностей, конкретно используемых в данном изобретении. Они определяют последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют Raf-белок или Ras-белок, применимые в данном изобретении, и различные ДНК-сегменты, рекомбинантные молекулы ДНК (рДНК) и векторы, сконструированные для экспрессии Raf- и/или Ras-белка.

ДНК-молекулы (сегменты) данного изобретения могут содержать последовательности, которые кодируют целые структурные гены, фрагменты структурных генов и транскрипционные единицы, как дополнительно описано здесь.

Предпочтительным ДНК-сегментом является нуклеотидная последовательность, которая кодирует Raf-белок, определенный здесь, или его биологически активный фрагмент.

Другим предпочтительным ДНК-сегментом является нуклеотидная последовательность, которая кодирует Ras-белок, определенный здесь, или его биологически активный фрагмент. Под биологически активным подразумевают, что экспрессируемый продукт будет иметь по меньшей мере некоторую часть биологической активности интактного белка, обнаруживаемого в клетке, такую как связывание лиганда, или, в случае активных форм этого белка, ферментативная активность.

Последовательность аминокислотных остатков и нуклеотидная последовательность предпочтительных c-Raf и h-Ras описаны в примерах.

Предпочтительный ДНК-сегмент кодирует последовательность аминокислотных остатков, по существу, такую же, что и последовательность аминокислотных остатков или ее часть, и предпочтительно состоящую из последовательности аминокислотных остатков или ее части, соответствующих Raf- или Ras-белку, описанному здесь. Репрезентативные и предпочтительные ДНК-сегменты описаны дополнительно в примерах.

Последовательность аминокислотных остатков белка или полипептида прямо связана через генетический код с последовательностью дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) структурного гена, который кодирует данный белок. Таким образом, структурный ген или ДНК-сегмент может быть определен последовательностью аминокислотных остатков, т.е. белком или полипептидом, которые он кодирует.

Важным и хорошо известным признаком генетического кода является его избыточность. То ест