Вариант мальтогенной -амилазы

Вариант мальтогенной -амилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение касается вариантов мальтогенной амилазы и способов создания таких вариантов.

Предпосылки изобретения

Мальтогенная α-амилаза (глюкан-1,4-α-мальтогидролаза, ЕС 3.2.1. 133) способна гидролизовать амилозу и амилопектин в мальтозу в ее α-конфигурации, а также способна гидролизовать мальтотриозу, равно как и циклодекстрин.

Мальтогенная α-амилаза палочки Bacillus (европейская патентная заявка 120693) доступна на коммерческой основе под торговой маркой новамил - Novamil^® (производится датской фирмой Novo Nordisk A/S): он широко используется в хлебопечении в качестве замедлителя черствения хлеба благодаря его способности подавлять ретроградацию крахмала. Novamil^® обладает рядом свойств, характерных для циклодекстринглюкантрансфераз (ЦДГТаз), включая гомологию аминокислотных последовательностей (B.Henrissat & A.Bairoch, 1996) и образование продуктов трансгликозилирования (C.Chris-tophersen et al., 1997, Starch, 50 [1], 39-45).

Цикломальтодекстринглюкантрансфераза (ЕС 2.4.1.19), также обозначаемая как циклодекстринглюкантрансфераза или циклодекстрингликозилтрансфераза, для краткости обозначаемая в данном тексте как ЦДГТаза, катализирует конверсию крахмала и сходных субстратов в цикломальтодекстрины за счет внутримолекулярной реакции трансгликозилирования, в результате чего образуются цикломальтодекстрины (или ЦМД) различной длины.

ЦДГТазы широко распространены, а в научной литературе эти ферменты подробно описаны у различных видов бактерий, включая Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Klebsiella, Micrococcus, Thermoanaerobacter и Thermoanaerobacterium. ЦДГТаза, вырабатываемая термоанаэробной бактерией Thermoanaerobacter sp., была описана у B.E.Norman & S.Т. Jorgensen, 1992, Denpun Kagaku, 39, 99-106 и в международной патентной заявке WO 89/03421/, а ее аминокислотная последовательность была представлена в международной патентной заявке WO 96/33267. Аминокислотные последовательности ЦДГТаз Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes и палочки Bacillus circulans доступны в Интернете (страницы SCOP или PDF) в виде файла 1CIU формата pdf, а аминокислотная последовательность ЦДГТазы В.circulans доступна в файле 1CDG.pdf.

У Y.Tachibana, 1997, J. Fermentat. & Bioeng., 83 [6], 540-548 описано клонирование и экспрессия ЦДГТазы. Варианты ЦДГТаз были описаны у Y.-H. Kim, 1997, Biochem. & Mol. Biol. Intern., 41 [2], 227-234; К.-A.Sin, 1994, J. Biotechnol., 32 [3], 283-288; D.Penlnga, 1995, Biochemistry, 34 [10], 3368-3376 и в международной патентной заявке WO 96/33267.

Недавно были опубликованы данные о третичной структуре некоторых ЦДГТаз. Hofman с соавт. (B.E.Hofman, Н.Bender & G.E. Schultz, 1989, J. Mol. Biol., 209, 793-800) и Klein и Schultz (C.Klein & G.E.Schultz, 1991, J. Mol. Biol., 217, 737-750) описана третичная структура ЦДГТазы, выделенной у Bacillus circulans штамма 8; Kubota с соавт. (M.Kubota, Y.Matsuura, S.Sakai & Y.Katsube, 1991, Denpun Kagaku, 38, 141-146) описана третичная структура ЦДГТазы Bacillus stearothermophilus штамма ТС-91; Lawson с соавт. (C.L.Lawson, R. van Montfort, B.Strokopytov, H.J. Rozeboom, K.H.Kalk, G.E. de Vries, D.Penninga, L.Dijkhuizen & B.W.Dijkstra, 1994, J. Mol. Biol., 236, 590-600) описана третичная структура ЦДГТазы Bacillus circulans.штамма 251; Strokopytov с соавт. (B.Strokopytov, D.Penninga, H.J.Rozeboom, K.H.Kalk, L.Dijkhuizen & B.W.Dijkstra, 1995, Biochemistry, 34, 2234-2240) описана третичная структура ЦДГТазы Bacillus circulans штамма 251, при том, что эта ЦДГТаза была соединена с акарбозой, являющейся эффективным ингибитором ЦДГТаз; и Knegtel с соавт. (R.M.A.Knegtel, R.D.Wind, H.J.Rozeboom, K.H.Kalk, R.M. Buitelaar, L.Dijkhuizen & B.W.Dijkstra, 1996, J. Mol. Biol., 256, 611-622) описана третичная структура ЦДГТазы Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes.

Краткое описание изобретения

Заявители осуществили модифицирование аминокислотной последовательности мальтогенной α-амилазы с целью получения вариантов, характеризующихся улучшенными свойствами, основываясь на третичной структуре мальтогенной α-амилазы Novamyl. Эти варианты обладают измененными физико-химическими свойствами, например измененным оптимумом рН, повышенной термостабильностью, увеличенной специфической активностью, измененными параметрами расщепления субстрата или повышенной способностью подавлять ретроградацию крахмала или зачерствение хлеба.

Таким образом, настоящее изобретение представляет способ создания варианта исходной мальтогенной α-амилазы, при том что такой вариант характеризуется по крайней мере одним измененным свойством по сравнению с упомянутой исходной мальтогенной α-амилазой, причем этот способ включает:

(1) анализ структуры мальтогенной α-амилазы с целью идентификации на основе оценки ее структурных параметров по крайней мере одного аминокислотного остатка или по крайней мере одного структурного сегмента в составе мальтогенной α-амилазы, который связан с изменениями указанного свойства;

(2) конструирование варианта мальтогенной α-амилазы, который, по сравнению с исходным вариантом модифицирован по тому аминокислотному остатку или структурному участку, который был идентифицирован на стадии (1) в связи с изменением указанного свойства; и

(3) тестирование полученного в результате варианта мальтогенной α-амилазы на указанное свойство.

Свойством, которое может быть изменено с помощью указанных выше способов по настоящему изобретению, может быть, например, уровень стабильности, зависимость активности от величины рН, способность подавлять ретроградацию крахмала и зачерствение хлеба, уровень специфической активности или субстратная специфичность. Следовательно, данный вариант может, например, характеризоваться увеличенной термостабильностью или повышенной активностью при меньших значениях рН, а при оптимальном значении рН - повышенной способностью подавлять ретроградацию крахмала и зачерствение хлеба.

Еще ряд аспектов настоящего изобретения касается вариантов мальтогенной α-амилазы, ДНК, кодирующих такие варианты, и способов создания таких вариантов. Наконец, настоящее изобретение касается применения указанных вариантов в различных промышленных целях, в частности в хлебопечении.

Подробное описание изобретения

Мальтогенная α-амилаза

Мальтогенная α-амилаза - фермент, имеющий в Классификации ферментов (ЕС) номер 3.2.1.133. Ее каталитическая активность не зависит от наличия у субстрата нередуцирующей концевой части, а первичная каталитическая активность этого фермента приводит к гидролизу амилопектина и амилозы с образованием мальтозы и более длинных мальтодекстринов. Этот фермент способен гидролизовать амилозу и амилопектин с образованием мальтозы, находящейся в α-конфигурации, а также способен гидролизовать мальтотриозу и циклодекстрин.

Конкретно предпочтительной мальтогенной α-амилазой является амилаза, клонированная на материале палочек Bacillus в соответствии с описанным в европейской патентной заявке 120693 (здесь и далее она обозначается как Novamyl). Novamyl характеризуется аминокислотной последовательностью, показанной аминокислотами 1-686 в SEQ ID NO: 1. Novamyl кодируется геном, выделенным из Bacillus штамма NCIB-11837, а нуклеотидная последовательность этого гена показана в SEQ ID NO: 1. Третичная структура Novamyl описана ниже.

В целом, предпочтительная мальтогенная α-амилаза обладает одним или несколькими из нижеперечисленных свойств:

(1) гомологичностью третичной структуры с таковой у Novamyl;

(2) аминокислотной последовательностью, характеризующейся по крайней мере 70%-ным уровнем идентичности с SEQ ID NO: 1, предпочтительно по крайней мере 80%-ным или 90%-ным, например 95%-ным или 98%-ным уровнем идентичности;

(3) кодирующей ее последовательностью ДНК, гибридизующей с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: l, или с последовательностью ДНК, кодирующей Novamyl Bacillus штамма NCIB-11837;

(4) наличием сайта связывания кальция, координационно эквивалентного осевому атому углерода в составе остатка аспарагина-77, атомам боковых цепей ОЕ1 и ОЕ2 из состава остатка Glu-102, атому боковой цепи OD1 из состава остатка Asp-79, атому OD1 из состава остатка Asp-76 и атому ОЕ1 из состава остатка Glu-101, и одной молекуле воды WAT-V21 (атом OWO);

(5) присутствием последовательности аминокислот «Pro-Ala-Gly-Phe-Ser» в положении, эквивалентном остаткам 191-195 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1; и структурная гомология с соответствии с отмеченным выше в п.(1) основывается на других параметрах гомологии последовательностей, на анализе гидрофобных кластеров или с помощью «обратного нанизывания» аминокислот (T.Huber & A.E.Torda, 1998, Protein Sci., 7 [1], 142-149), причем любой из этих методов указывает на наличие одинаковой четвертичной структуры по сравнению с Novamyl: при этом четвертичная структура характеризуется общей укладкой (фолдингом) или укладкой только доменов А, В и С, более предпочтительно включая домен D, а наиболее предпочтительно включая домен Е. С другой стороны, сопоставление структур Novamyl и мальтогенной α-амилазы может быть использовано для целей идентификации эквивалентных положений.

Установление сайта связывания кальция, на что указывалось выше в п. (4), основывается на положении кальций-связывающего сайта в трехмерной структуре Novamyl, что обсуждается далее в разделе «Сайты связывания кальция».

Определение «эквивалентного положения», на что указывалось выше в п.(5), основывается на сопоставлении нуклеотидных или аминокислотных последовательностей и анализе структурной гомологии с применением методов, известных в данной области техники.

Трехмерная структура мальтогенной α-амилазы

Novamyl был использован для установления трехмерной структуры, образуемой на основе настоящего изобретения.

Структура Novamyl была раскрыта в соответствии с данными рентгенографических методов, применяемых в кристаллографии, например, в соответствии с руководством G.К.Stout & L.H.Jensen, 1989, "X-Ray Structure Determination", J.Wiley & Sons Inc., NY.

Координаты установленной кристаллической структуры Novamyl при разрешении в 2,2 при использовании метода изоморфного замещения даны в стандартном для описания белков (PDB) формате (Protein Data Bank, Brookhaven Nat,. Lab., Brookhaven, CT). Используются следующие сокращения: СА обозначает ион кальция или α-атом углерода в составе осевой цепи полипептида; WAT обозначает воду или кальций; MAL обозначает мальтозу; HEX обозначает углеводную составляющую субстратного аналога; и SUL обозначает сульфатный ион.

Аминокислотные остатки в последовательности фермента обозначаются в данном тексте с использованием соответствующих 3-или 1-буквенных аббревиатур.

Пространственная структура указанной мальтогенной α-амилазы определяется пятью глобулярными доменами, обозначенными А, В, С, D и Е. Эти домены определяются аминокислотными остатками 1-132 и 204-403 (домен А), остатками 133-203 (домен В), остатками 404-496 (домен С), остатками 497-579 (домен D) и остатками 580-686 (домен Е), причем нумерация соответствует аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Свойства доменов А, В и С, представляющих конкретный интерес, описаны далее.

Домен А

Домен А является наиболее крупным доменом и содержит активный сайт, который включает кластер из трех аминокислотных остатков - D329, D228 и Е256, - пространственно расположенных на «дне» щели, имеющейся на поверхности данного фермента. Характер общей укладки домена А является типичным для тех α-амилаз, для которых определена структура: а именно он является β/α-8-цилиндром, включающим восемь расположенных по центру β-тяжей (пронумерованных от 1 до 8) и восемь фланкирующих их α-спиралей. β-Цилиндр был определен McGregor, (цит. выше). С-концевая часть 1-го β-тяжа соединена с 1-й спиралью через петлю, обозначенную как «петля 1», и такая структура обнаруживается во всех остальных петлях, хотя для этих петель демонстрируется некоторая изменчивость размеров и некоторые из них могут быть весьма протяженными.

Восемь расположенных по центру β-тяжей в β/α-8-цилиндре в существенной степени соответствуют известным структурам ЦДГТаз. Эта часть структуры, включая тесное окружение активного сайта, находящегося с С-конца данных β-тяжей, проявляет высокий уровень идентичности с ЦДГТазами.

С другой стороны, петли, обеспечивающие контакт между β-тяжами и α-спиралями, характеризуются высоким уровнем изменчивости по сравнению с известными структурами ЦДГТаз. Эти петли создают т.н. «структурный контекст» активного сайта, а большинство контактов с субстратом выявляется с участием аминокислотных остатков, расположенных в составе указанных петель. Отличительные свойства, такие как субстратная специфичность, связывание с субстратом, зависимость активности от рН, параметры расщепления субстрата и подобное, определяются конкретными аминокислотами и положениями, занимаемыми этими петлями. Домен А белка Novamyl включает два кальций-связывающих сайта, один из которых гомологичен кальций-связывающим сайтам ЦДГТаз; другой - уникален для Novamyl. Структура кальций-связывающего сайта обсуждается ниже в разделе «Кальций-связывающие сайты».

Домен В

Домен В, также обозначаемый как петля 3 β/α-8-цилиндра, составлен аминокислотными остатками 133-203 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Эта структура отчасти гомологична структуре домена В ЦДГТаз, а наиболее значимое отличие связано с присутствием 5-аминокислотной вставки, соответствующей положениям 191-195 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: I - эта вставка в других ЦДГТазах не обнаруживается. Эта вставка пространственно расположена вблизи активного сайта и в тесном контакте с соответствующим субстратом.

Домен С

Домен С в белке Novamyl составлен аминокислотными остатками 404-496 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Домен С полностью составлен (β-тяжами, которые образуют единую 8-нитевую плоскостную структуру, которая заворачивается (укладывается) назад за себя - соответственно, она может быть определена как структура «β-сэндвича». Одна из частей такой β-плоскости образует «интерфейс» с доменом А.

Кальций-связывающие сайты

Структура мальтогенной α-амилазы включает три кальций-связывающих сайта: следовательно, три иона кальция, как выявляется, присутствуют в данной структуре. Как и в большинстве из 13 других известных структур, один из ионов кальция - WAT-693 расположен между доменами А и В. Этот ион кальция координируется атомами осевого углеродного скелета из состава остатков Gln-184 и His-232, атомами боковых цепей OD2 и OD1 из состава остатка Asp-198, атомом OD1 боковой цепи остатка Asn-131 и тремя молекулами воды WAT-V1, WAT-V5 и WAT-V8.

Второй ион кальция находится в пределах домена А, и он типичен для структуры ЦДГТаз, но не известен в составе α-амилаз. Этот ион кальция (WAT-694) координируется углеродными атомами осевого скелета остатков Gly-48 и Asp-23, атомом OD2 боковой цепи остатка Asp-50, атомом OD1 боковой цепи остатка Asp-21, атомом OD1 боковой цепи остатка Asn-26 и атомом OD1 боковой цепи остатка Asn-27 и одной молекулой воды WAT-V62.

Третий ион кальция расположен в пределах домена А и является уникальным для Novamyl. Этот ион кальция (WAT-692) координируется с участием атома углерода осевого скелета остатка Asn-77, атомами ОЕ2 и ОЕ1 боковой цепи остатка Glu-102, атомом OD1 боковой цепи остатка Asp-79, атомом OD1 боковой цепи остатка Asp-76 и атомом ОЕ1 боковой цепи остатка Glu-101 и одной молекулой воды WAT-V21.

Сайт связывания субстрата

Участки петель, обсуждавшихся выше в связи с доменами А и В, представляют конкретный интерес с точки зрения взаимодействия с субстратом и реактивности активного сайта. В частности, в домене А это остатки 37-45 1-й петли, остатки 261-266 5-й петли, остатки 327-330 7-й петли и остатки 370-376 8-й петли; в домене В - остатки 135-145 3-й петли, остатки 173-180 и 188-196 3-й петли, причем положения этих остатков соответствуют аминокислотам в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.

Вне связи с какой-либо теорией, в настоящее время считается, что связывание субстрата и фермента обеспечивается предпочтительными взаимодействиями, происходящими в пространстве диаметром 4-6 , расположенном между молекулой субстрата и данным ферментом, такими как образование водородных связей и (или) наличие мощного электростатического взаимодействия. Следующие остатки в последовательности Novamyl (SEQ ID NO: 1) находятся в пределах расстояния 6 от субстрата, коим является HEX, и, следовательно, могут быть предположительно вовлечены во взаимодействия с упомянутым субстратом:

44, 89, 90, 92, 93, 127, 129, 132, 135, 177, 178, 188, 191, 194, 196, 226, 228, 229, 230, 231, 232, 256, 258-261, 288, 328, 329, 371, 372, 373, 376 и 690.

Следующие остатки последовательности Novamyl находятся на расстоянии в 4 от субстрата HEX и, следовательно, предположительно могут участвовать во взаимодействии с упомянутым субстратом:

90, 92, 93, 129, 132, 177, 188, 189, 190, 191, 196, 226, 228, 229, 231, 232, 256, 258, 259, 260, 261, 328, 329, 372, 376 и 690.

Достижение гомологии с Novamyl^®

Структура Novamyl® являлась моделью, выстроенной по параметрам структуры, описанной здесь в таблице 1. Аналогичным образом может быть выстроена структура других вариантов мальтогенных α-амилаз.

Модельная структура мальтогенной α-амилазы может быть выстроена с использованием программы «Homology» или аналогичных программ, например, программы «Modeller» (обе они предоставляются фирмой Simulations Inc., San Diego, CA). Базовым принципом является сопоставление последовательности мальтогенной α-амилазы с известной структурой той мальтогенной α-амилазы, структура которой уже была сконструирована ранее. Структурно консервативные участки затем могут быть определены на основании консенсусных последовательностей. На участках, характеризующихся отсутствием гомологии, могут быть внесены петлевые структуры или же последовательности могут быть делетированы с последующим связыванием необходимых остатков, для чего применяется, например, программа «Homology». Последующее уточнение и оптимизация получаемой структуры могут быть осуществлены с применением той же программы «Homology» или иной программы, предназначенной для молекулярного конструирования, например, программы CHARMm (Molecular Simulations).

Способы создания новых вариантов мальтогенной α-амилазы

В первом своем аспекте настоящее изобретение представляет способ создания варианта исходной мальтогенной α-амилазы, причем упомянутый вариант характеризуется по крайней мере одним измененным свойством по сравнению с указанной исходной мальтогенной α-амилазой, причем этот способ включает:

(1) анализ структуры мальтогенной α-амилазы с целью идентификации на основе оценки ее структурных параметров по крайней мере одного аминокислотного остатка или по крайней мере одного структурного сегмента в составе мальтогенной α-амилазы, который связан с изменениями указанного свойства;

(2) конструирование варианта мальтогенной α-амилазы, который, по сравнению с исходным вариантом модифицирован по тому аминокислотному остатку или структурному участку, который был идентифицирован на стадии (1) в связи с изменением указанного свойства;

(3) тестирование полученного в результате варианта мальтогенной α-амилазы на указанное свойство.

Структурная единица, которая идентифицируется на стадии (1) способа по настоящему изобретению, может быть составлена единственным аминокислотным остатком. Однако обычно эта структурная часть включает более одного аминокислотного остатка и, как правило, она включает одну из указанных выше частей структуры мальтогенной α-амилазы, таких как домены А, В, С, D или Е, «интерфейс» (граничный участок) между любыми из этих доменов, кальций-связывающий сайт, петлевая структура, сайт связывания субстрата или подобное.

Структурные или функциональные аспекты могут основываться на анализе участвующих структур или структурных элементов с определением их вкладов в функционирование данного фермента. Например, анализ функциональной дифференцировки мальтогенной α-амилазы и различных ЦДГТаз может быть использован для оценки некоторых свойств Novamyl или для проявления таких отношений. Например, различия в параметрах или структуре петель, окружающих конкретный активный сайт, могут обусловливать дифференцировку степени доступности активного сайта для субстрата, а следовательно, и различия в уровне субстратной специфичности и (или) параметрах расщепления субстрата.

Более того, были идентифицированы (см. далее) участки мальтогенной α-амилазы, вовлеченные в связывание субстрата, а следовательно, например, в определение субстратной специфичности и (или) расщепления, связывании ионов кальция, что важно, например, с точки зрения зависимости данного фермента от кальция, и в подобное.

Модификация аминокислотного остатка или структурного участка обычно осуществляется путем подходящего модифицирования последовательности ДНК, кодирующей исходный рассматриваемый фермент. Такая модификация может быть заменой, делецией или вставкой аминокислотного остатка или структурной части.

Предназначенное к модифицированию свойство может быть стабильностью (например, термостабильностью), рН-зависимой активностью, субстратной специфичностью, специфической активностью или способностью подавлять ретроградацию крахмала или зачерствение хлеба. Следовательно, измененное свойство может являться измененной специфической активностью при данной величине рН и (или) измененной субстратной специфичностью, такой как измененный параметр расщепления субстрата или измененный параметр субстратного ингибирования.

На стадии (2) способа по настоящему изобретению предназначенная для идентификации часть данной структуры предпочтительно является частью, которая в составе пространственно уложенного фермента, который предположительно участвует в контактировании с субстратом (см. описание, приведенное выше в разделе «Сайт связывания субстрата») или вовлечен в обеспечение субстратной специфичности и (или) параметров расщепления, и (или) частью, которая контактирует с одним из ионов кальция, и (или) частью, влияющей на рН- или температурный профиль данного фермента, или частью, иным образом влияющей на свойства мальтогенной α-амилазы.

Далее описаны конкретные типы вариантов, которые были сконструированы с применением способа по настоящему изобретению.

Варианты по настоящему изобретению могут нести дополнительные модификации по отношению к описанным здесь модификациям. Предпочтительно такие варианты характеризуются более чем 70%-ным уровнем идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1, предпочтительнее более чем 80%-ным, в частности, более чем 90%-ным, особенно более чем 95%-ным, например более чем 98%-ным уровнем идентичности.

Варианты мальтогенной α-амилазы с измененной зависимостью активности от величины рН

Профиль зависимости активности фермента от величины рН может быть изменен путем изменения параметров рКа остатков на расстоянии 10 от остатков активного сайта в последовательности мальтогенной α-амилазы. Изменение рКа остатков активного сайта достигается, например, путем изменения электростатических взаимодействий или гидрофобных взаимодействий между функциональными группами боковых цепей аминокислот в составе данного аминокислотного остатка и остатков из ближайшего окружения. Для достижения повышенной активности при более высоком рН отрицательно заряженные остатки помещают рядом с аминокислотой-донором водорода, в то время как положительно заряженные остатки, помещенные рядом с нуклеофильной кислотой, обусловливают повышенную активность при низких значениях рН. Также снижение рКа может быть достигнуто подавлением доступности воды или повышением гидрофобности окружающей среды.

Следовательно, другой аспект настоящего изобретения представляет вариант исходной мальтогенной α-амилазы, причем этот вариант характеризуется измененным профилем зависимости активности от величины рН по сравнению с исходным вариантом, причем данный вариант может быть получен с применением следующего способа:

(1) идентификация аминокислотного остатка в пределах 15 от остатка активного сайта в составе мальтогенной α-амилазы в трехмерной структуре указанной исходной мальтогенной α-амилазы, в частности в 10 от остатка активного сайта, причем. указанный аминокислотный остаток предположительно вовлечен в электростатические или гидрофобные взаимодействия с остатком активного сайта;

(2) замена в данной структуре указанного аминокислотного остатка на аминокислотный остаток, в результате чего изменяется электростатическое и (или) гидрофобное окружение остатка активного сайта, и оценка согласованности данного аминокислотного остатка с данной структурой;

(3) необязательное повторение стадии (1) и (или) (2) вплоть до того момента, как будет идентифицирована аминокислотная замена, которая эффективно встроится в состав данной структуры;

(4) конструирование варианта мальтогенной α-амилазы, как следствие осуществления стадий (1) и (2), и необязательно стадии (3), и тестирование указанного варианта на зависимость активности фермента от величины рН.

В предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы, характеризующийся измененным профилем зависимости активности от величины рН по сравнению с исходной мальтогенной α-амилазой, включает модификацию аминокислотного остатка, соответствующего одному или большему числу следующих остатков из состава последовательности SEQ ID NO: 1:

D127, V129, F188, А229, Y258, V281, F284, Т288, N327, М330, G370, N371 и D372,

L71, S72, V74, L75, L78, Т80, L81, G83, Т84, D85, N86, Т87, G88, Y89, Н90, G91, Т94, R95, D96, F97, I174, S175, N176, D178, D179,.R180, Y181, Е182, А183, Q184, К186, N187, F188, Т189, D190, А192, G193, F194, S195, L196.

В более предпочтительном варианте данный вариант включает модификацию, соответствующую одной или нескольким следующим модификациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

D127N/L, V129S/T/G/V, F188E/K/H, A229S/T/G/V, Y258E/D/K/R /F/N, V281L/T, F284K/H/D/E/Y, T288E/K/R, N327D, M330L/F/I/D/E/K, G370N, N371D/E/G/K и D372N/V,

L71I, S72C, V74I, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T80I/L/V/S/N/G, L81I/V/S/ T/N/Q/K/H, G83A/S/T/N/Q/E/D/R/H/L, T84S/A/N/D/G, D85A/T/S/N/G, N86 Q/E/D/Y/H/K, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D/A/M/V/I, R95K/Q, D96N/V/Q/I, F97Y, I174N/Q/L, S175T/A/N/D, N176S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/I/H/N, T189N/D/A/S/H/Y/G, D190E/Q/H/N/K, A192T/D/E/N/K, G193A/S/T, F194Y, S195N/D/E/R/K/G, L196I.

Сходные модификации могут быть внесены по эквивалентным положениям в состав других мальтогенных α-амилаз. Представляющие конкретный интерес варианты характеризуются сочетанием одной или нескольких из перечисленных выше модификаций с любой из других модификаций, описанных в настоящей заявке.

Варианты мальтогенной α-амилазы с измененной стабильностью

Вариант с улучшенной (обычно - увеличенной) стабильностью может быть получен путем стабилизации связывания кальция, внесения пролина, замены гистидина на другую аминокислоту, внесения междоменной дисульфидной связи, удаления сайта дезамидирования, изменения контакта в водородной связи, заполнения внутренней полости в пространственной структуре одной или несколькими аминокислотами с более крупными боковыми цепями, внесения междоменных взаимодействий, изменения распределения заряда, кэпирования спирали или внесения солевого мостика.

Связывание кальция

Настоящее изобретение представляет вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется измененной стабильностью за счет измененной стабилизации связывания ионов кальция (Ca²⁺). Данный вариант фермента может характеризоваться измененной термостабильностью или измененной стабильностью в диапазоне рН, или он может обладать активностью мальтогенной α-амилазы в присутствии низкой концентрации ионов кальция. В настоящее время считается, что аминокислотные остатки, расположенные в пределах 10 от иона кальция, вовлечены в обеспечение способности связывать Ca²⁺ данным ферментом или играют в этом важную роль.

Аминокислотные остатки, обнаруженные на расстоянии до 10 от сайтов связывания Са²⁺ в составе последовательности мальтогенной α-амилазы, показанной в SEQ ID NO: 1, были установлены в соответствии с описанным в примере 2:

16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 87, 88, 89, 91, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 109, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 145, 150, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 174, 177, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 206, 210, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 378 и 637.

С целью создания варианта в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения желательным является заменить по крайней мере один из перечисленных выше аминокислотных остатков, для которых определено участие в не являющемся оптимальным связывании кальция, на любой иной аминокислотный остаток, который бы улучшил аффинность по связыванию Са²⁺ полученным вариантом фермента. Следовательно, в другом аспекте настоящего изобретения представляется способ создания варианта исходной мальтогенной α-амилазы, причем указанный вариант характеризуется стабилизированным связыванием Са²⁺ по сравнению с указанным исходным вариантом, причем такой способ включает:

(1) идентификацию аминокислотного остатка на расстоянии до 10 от сайта связывания Са²⁺ в составе мальтогенной α-амилазы в модели трехмерной структуры указанной α-амилазы, для которого, исходя из структурных или функциональных характеристик, установлено влияние на не являющееся оптимальным взаимодействие с ионом кальция;

(2) конструирование варианта, в составе которого указанный аминокислотный остаток заменен на другой аминокислотный остаток, который, исходя из структурных или функциональных характеристик, как установлено, играет важную роль в обеспечении измененной аффинности по связыванию ионов Са²⁺;

(3) тестирование параметров Са²⁺-связывания полученным вариантом мальтогенной α-амилазы.

Замена аминокислотного остатка, связанного с не являющимся оптимальным взаимодействием с ионом кальция, на другой остаток может обусловливать изменение взаимодействия по связыванию иона кальция данным ферментом. Например, рассматриваемый аминокислотный остаток может быть подобран на основании одного или нескольких следующих соображений:

(а) с целью улучшения взаимодействия между ионом кальция и аминокислотным остатком, исходя из параметров структуры мальтогенной α-амилазы. Например, если рассматриваемый аминокислотный остаток подвергается воздействию внешнего растворителя, то предпочтительным может быть увеличение уровня прикрытия указанного аминокислотного остатка от этого растворителя таким образом, чтобы обеспечить стабилизацию взаимодействия между указанным аминокислотным остатком и ионом кальция. Это может быть достигнуто путем замены указанного остатка или аминокислотного остатка, находящегося в непосредственной близости от указанного остатка и участвующего в образовании данной «защиты», на аминокислотный остаток с более крупной боковой группой или на остаток, улучшающий «эффект прикрытия» каким-либо иным путем,

(б) с целью стабилизации сайта связывания кальция, например, за счет стабилизации структуры мальтогенной α-амилазы, например, стабилизации контактов между двумя или большим числом из пяти доменов, или стабилизации одного или нескольких отдельных доменов таким же образом. Это может быть достигнуто, например, путем обеспечения лучшей координации между боковыми цепями аминокислот, что может быть достигнуто, например, путем замены остатка аспарагина на остаток аспарагиновой кислоты и (или) остатка глутамина на остаток глутаминовой кислоты, находящихся в пределах 10 , а предпочтительнее - в пределах 3-4 от сайта связывания кальция,

(в) с целью улучшения координации между ионом кальция и кальций-связывающими остатками, например, за счет улучшения взаимодействия между данным ионом и координирующими остатками или повышения числа координаций боковых групп в результате замены координирующей молекулы воды на боковую цепь аминокислоты,

(г) замена молекулы воды на координирующий кальций аминокислотный остаток.

Предпочтительно аминокислотный остаток, предназначенный к модифицированию, находится в пределах 8 от иона Са²⁺, а предпочтительнее - в пределах 5 от иона Са²⁺. Аминокислотные остатки на расстоянии до 8 и до 5 , соответственно, могут быть легко установлены с применением того же самого метода, который использовали при установлении аминокислотных остатков на расстоянии 10 (см. пример 2).

В предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы, характеризующийся измененным связыванием ионов Са²⁺ по сравнению с исходной мальтогенной α-амилазой, несет замену аминокислотного остатка в соответствии с одним или несколькими нижеперечисленными остатками из состава аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

D17, А30, S32, R95, Н103, N131, Q201, I174 и (или) Н169,

V74, L75, L78, Т80, L81, Т87, G88, Y89, Н90, G91, Т94, R95, D96, F97, Y167, F168, Н169, Н170, N171, G172, D173, I174, S175, N176, D178, D179, R180, Y181, Е182, А183, Q184, К186, N187, F188, Т189.

В более предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает замену, соответствующую одной или большему числу следующих замен в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

D17E/Q, A30M/L/A/V/I/E/Q, S32D/E/N/Q, R95M/L/A/V/I/E/Q, Н103 Y/N/Q/D/E, N131D, Q201E, I174E/Q и H169N/D/E/Q,

V74I, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T80I/L/V/S/N/G, L81I/V/S/T/N/Q/K/H, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D/A/M/V/I, R95K/Q, D96N/V/Q/I, F97Y, Y167F/R/C, F168Y, H169N/Q/K, H170N/Q/K, N171D/E/ Q/H/R/K/G, G172A/T/S, D173N/S/T/Y/R/G, I174N/Q/L, S175T/A/N/D, N176 S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/I/H/N, T189N/ D/A/S/H/Y/G.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения в связи с изменением связывания Са²⁺ мальтогенной α-амилазой модифицируют частичную последовательность N28-P29-A30-K31-S32-Y33-G34 в соответствии с показанным в SEQ ID NO: 1.

Сходные замены могут быть внесены по эквивалентным положениям других мальтогенных α-амилаз. Представляющие конкретный интерес модификации могут составлять произвольное сочетание одной или нескольких из перечисленных выше модификаций и любых других модификаций, описанных в данной заявке.

Другие замены

Варианты фермента, характеризующиеся улучшенной стабильностью, могут быть получены путем улучшения существующих или внесенных новых междоменных и внутридоменных контактов. Такая улучшенная стабильность может быть достигнута с помощью перечисленных далее модификаций.

Мальтогенная α-амилаза, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, может быть стабилизирована путем внесения одной или нескольких междоменных дисульфидных связей. Соответственно, в другом предпочтительном варианте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется улучшенной стабильностью и наличием по крайней мере одной «лишней» междоменной дисульфидной связи по сравнению с указанным исходным вариантом, причем указанный вариант включает модификацию в положении, соответствующем по крайней мере одному из следующих пар положений в последовательности SEQ ID NO: 1:

G326+S583; G618+R272; Т252+V433 и (или) А348+V487.

В более предпочтительном варианте данная замена соответствует по крайней мере одной из следующих пар:

G326C+S583C; G618C+R272C; Т252С+V433C и (или) А348С+V487C.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется улучшенной стабильностью и измененным междоменным взаимодействием по сравнению с указанным, исходным вариантом, причем указанный вариант включает замену в положении, соответствующем по крайней мере одному из следующих положений в последовательности SEQ ID NO: 1:

(i) F143, F194, L78;

(ii) A341, A348, L398, I415, T439, L464, L465;

(iii) L557;

(iv) S240, L268;

(v) Q208, L628;

(vi) F427, Q500, N507/ M508, S573; и

(vii) I510, V620.

В более предпочтительном варианте данная замена соответствует по крайней мере одной из следующих замен:

(i) F143Y, F194Y, L78Y/F/W/E/Q;

(ii) A341S/D/N, A348V/I/L, L398E/Q/N/D, I415E/Q, T439D/E/Q/N, L464D/E, L465D/E/N/Q/R/K;

(iii) L557Q/E/N/D;

(iv) S240D/E/N/Q, L268D/E/N/Q/R/K;

(v) Q208D/E/Q, L628E/Q/N/D;

(vi) F427E/Q/R/K/Y, Q500Y, N507Q/E/D,