Производное альфа-аминогидроксамовой кислоты, способ его получения и фармацевтическая композиция

Производное альфа-аминогидроксамовой кислоты, способ его получения и фармацевтическая композиция

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к производным арилсульфонамидо-замещенной гидроксамовой кислоты, к способам и новым промежуточным соединениям для их получения, фармацевтическим композициям, включающим вышеуказанные производные, фармацевтическим композициям, включающим селективные ингибиторы ММП2, к применению производных гидроксамовой кислоты в качестве лекарственных средств, способу лечения ММП-, прежде всего ММП2-зависимых заболеваний, прежде всего гиперпролиферативных заболеваний или состояний млекопитающих, связанных с ММП, прежде всего ММП2, к ингибированию с использованием селективных инигибиторов ММП2, прежде всего производных гидроксамовой кислоты формулы I, или фармацевтических композиций, включающих селективные ингибиторы ММП2, прежде всего производные гидроксамовой кислоты формулы I.

Прежде всего, изобретение относится к производным α-аминогидроксамовой кислоты формулы I,

где

R₁ означает водород, замещенный или незамещенный арил, (низш.)алкил, замещенный или незамещенный карбоциклический арил(низш.)алкил, замещенный или незамещенный гетероциклический (низш.)алкил, замещенный или незамещенный С₃-С₇циклоалкил, замещенный или незамещенный С₃-С₇циклоалкил(низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, (низш.)алкокси(низш.)алкил, (низш.)алкил(тио, сульфинил или сульфонил)(низш.)алкил, амино(низш.)алкил или моно- или ди(низш.)алкиламино(низш.)алкил;

R₂ означает водород или (низш.)алкил,

R₃ означает замещенный или незамещенный С₃-С₇циклоалкил, замещенный или незамещенный карбоциклический арил, замещенный или незамещенный гетероциклический арил, замещенный или незамещенный гетероциклил или (низш.)алкил,

А означает C₁-С₃алкилен, незамещенный или замещенный (низш.)алкилом,

q равно 1-5;

R означает С₂-С₇алкил, моно-, ди- или тризамещенный галогеном, нитро, (низш.)ацилокси, трифторметокси, циано, С₃-С₅циклоалкилом или незамещенным или замещенным С₃-С₆гетероарилом, включающим один или два гетероатома, выбранных из группы О, S и N, или С₃-С₇алкенил, или С₃-С₇алкинил, который в каждом случае является незамещенным или моно-, ди- или тризамещенным галогеном, нитро, (низш.)ацилокси, трифторметокси, циано, С₃-С₅циклоалкилом или незамещенным или замещенным С₃-С₆гетероарилом, включающим один или два гетероатома, выбранных из группы О, S и N,

и к их фармацевтически приемлемым пролекарствам и их фармацевтически приемлемым солям.

Соединения формулы I являются ингибиторами матрикс-деградирующих металлопротеиназ (ММП) и применяются для терапии состояний, связанных с этими ферментами.

q предпочтительно равен 1-3, как правило, равен 1 или 2, предпочтительно 1. Только если это возможно стереохимически, q может быть равен 4 или 5. Если q равно 1, OR находится, например, в положении 3 или предпочтительно в положении 4.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения R₁ или R₂ означают водород. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения R₁ и R₂ каждый означает водород.

Если не указано иное, термины, используемые в данном тексте, имеют указанные значения в объеме настоящего изобретения.

Например, галоген означает фтор, хлор, бром или иод, предпочтительно фтор или хлор.

Если не указано иное, органические радикалы, обозначаемые в данном тексте как "низший" (низш.), содержат не более 7, предпочтительно не более 4 углеродных атомов.

Арил означает карбоциклический или гетероциклический арил.

(Низш.)алкил может быть разветвленным или неразветвленным, может включать от 1 до 7 атомов углерода, предпочтительно 1-4 атома углерода, например может означать метил, этил, пропил, бутил, изопропил и изобутил.

Карбоциклический арил означает моноциклический или бициклический арил, предпочтительно незамещенный фенил,

или фенил, моно-, ди- или тризамещенный одним, двумя или тремя радикалами, выбранными из группы (низш.)алкил, (низш.)алкокси, гидрокси, галоген, циано, трифторметил, (низш.)алкиламино, ди(низш.)алкиламино, фенокси или фенил, необязательно замещенный группой (низш.)алкокси, (низш.)алкил, галоген, циано, нитро или трифторметил,

или фенил, дизамещенный по соседним атомам углерода группой (низш.)алкилен-диокси, такой, как метилендиокси,

или фенил, замещенный гетероциклическими радикалами, как описано ниже, прежде всего пирролил, имидазолил, триазолил, тетразолил, фурил, тиенил, морфолинил, пирролидинил, пиперидинил, или (низш.)алкил, замещенный гетероциклическими радикалами, как описано ниже, прежде всего имидазолил, триазолил, хинолинил или морфолинил,

или 1- или 2-нафтил.

Предпочтительны незамещенный фенил или фенил, монозамещенный группой (низш.)алкокси, фенокси, фенил, галоген или трифторметил. Более предпочтительны фенил или фенил, монозамещенный группой (низш.)алкокси, галоген или трифторметил.

Карбоциклический арил(низш.)алкил предпочтительно означает арилС₁-С₄алкил с прямой или разветвленной цепью, в котором карбоциклический арил имеет значения, указанные выше, например бензил или фенил(этил, пропил или бутил), каждый из которых является незамещенным или замещенным в фенильном цикле, как указано выше для группы карбоциклический арил, предпочтительно необязательно замещенный бензил.

Гетероциклические радикалы представляют собой, прежде всего, моно- или бициклические аза-, тиа-, окса-, тиаза-, оксаза- или диазарадикалы ароматического характера и отчасти или прежде всего означают полностью насыщенные гетероциклические радикалы этого типа, возможно замещенные одной, двумя или тремя функциональными группами. Эти радикалы связаны с остатком молекулы С-С связью и, прежде всего, означают моноциклические или бициклические радикалы, включающие один атом азота, кислорода или серы, и, прежде всего, ароматические радикалы этого типа, например 2-пиррил или 3-пиррил, пиридил, например, 2-, 3- или 4-пиридил, а также тиенил, например 2- или 3-тиенил, или фурил, например 2-фурил; аналогичные бициклические радикалы с одним атомом азота, кислорода или серы, означают, например, индолил, такой как 2- или 3-индолил, хинолил, такой как 2- или 4-хинолил, изохинолил, такой как 3- или 5-изохинолил, бензофуранил, такой как 2-бензофуранил, хроменил, такой как 3-хроменил, или бензотиенил, такой как 2- или 3-бензотиенил. Приемлемые моноциклические и бициклические радикалы, содержащие более одного гетероатома, включают, например, имидазолил, такой как 2-имидазолил, пиримидинил, такой как 2-или 4-пиримидинил, оксазолил, такой как 2-оксазолил, изоксазолил, такой как 3-изоксазолил, или тиазолил, такой как 2-тиазолил, или бензимидазолил, такой как 2-бензимидазолил, бензоксазолил, такой как 2-бензоксазолил, или хиназолил, такой как 2-хиназолинил. Кроме того, приемлемы частично или, прежде всего, полностью насыщенные аналогичные радикалы, такие как 2-тетрагидрофурил, 4-тетрагидрофурил, 2- или 3-пирролидил, 2-, 3- или 4-пиперидил, и, кроме того, 2- или 3-морфолинил, 2- или 3-тиоморфолинил, 2-пиперазинил и N,N'-бис(низш.)алкил-2-пиперазинил.

Гетероциклический радикал может быть замещен одним, двумя или тремя идентичными или различными заместителями (функциональными группами), наиболее пригодны следующие заместители: свободные гидроксигруппы, их простые и сложные эфиры, меркапто и (низш.)алкилтиогруппы и замещенные и незамещенные фенилтиогруппы, атомы галогена, оксогруппы, которые могут быть в форме формил (например, альдегидо) и кетогрупп, и, кроме того, соответствующие ацетали или кетали, азидо и нитрогруппы, первичные, вторичные и, предпочтительно, третичные аминогруппы, первичные и вторичные аминогруппы, ациламиногруппы и диациламиногруппы, защищенные обычными защитными группами, и немодифицированные или функционально модифицированные сульфогруппы, такие как сульфамоилгруппы или сульфогруппы, присутствующие в солевой форме. Все указанные функциональные группы не связаны с атомом углерода со свободной валентностью и предпочтительно отделены от него двумя или более углеродными атомами. Кроме того, гетероциклический радикал может иметь свободные и функционально модифицированные карбоксильные группы, такие как карбоксильные группы в солевой форме или в форме сложноэфирной, карбамоил, уреидо или гуанидиногрупп, которые могут содержать или могут не содержать один или два углеводородных радикала, и цианогрупп.

Замещенный карбоциклический арил R₃ предпочтительно означает фенил, замещенный галогеном, (низш.)алкокси, (низш.)алкил, ди(низш.)алкиламино, триазолил, прежде всего, 1,2,4-триазолил, 1,3,4-триазолил или 1,2,3-триазолил, имидазолил, например 1-имидазолил, морфолинил, пирролидинил, пиперидинил, тетразолил, пирролил, фурил, предпочтительно 3-фурил, тиенил, морфолинил(низш.)алкил, хинолинил(низш.)алкил, имидазолил(низш.)алкил и триазолил(низш.)алкил.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения R₃ означает замещенный карбоциклический арил, причем в указанном варианте замещенный карбоциклический арил означает фенил, который предпочтительно замещен в 4 положении, предпочтительно триазолилом, прежде всего 1,2,4-триазол-1-илом.

Гетероциклический арил R₃ означает моноциклический или бициклический гетероарил, например пиридил, хинолил, изохинолил, бензотиенил, бензофуранил, бензопиранил, бензотиопиранил, фуранил, пирролил, тиазолил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, пирразолил, имидазолил, тиенил или любой вышеуказанный радикал, замещенный (низш.)алкилом или галогеном. Пиридил означает 2-, 3- или 4-пиридил. Тиенил означает 2- или 3-тиенил, преимущественно 2-тиенил. Хинолил предпочтительно означает 2-, 3-или 4-хинолил, преимущественно 2-хинолил. Изохинолил предпочтительно означает 1-, 3- или 4-изохинолил. Бензопиранил, бензотиопиранил предпочтительно означают 3-бензопиранил или 3-бензотиопиранил, соответственно. Тиазолил предпочтительно означает 2- или 4-тиазолил, преимущественно 4-тиазолил. Триазолил предпочительно означает 2- или 5-(1,2,4-триазолил). Тетразолил предпочительно означает 5-тетразолил. Имидазолил предпочительно означает 4-имидазолил. Гетероциклический арил предпочительно означает пиридил. Он может быть замещен одним, двумя или более идентичными или различными заместителями, указанными выше для гетероциклических радикалов.

Гетероциклический R₃ означает насыщенные или частично ненасыщенные, моноциклические или бициклические гетероциклические радикалы, включающие от 3 до 10 атомов углерода и один или два гетероатома, выбранные из группы, включающей О, S и N. Предпочтительно гетероциклический R₃ выбирают из группы, включающей пиперидинил, морфолинил, пирролидинил, пирролинил, пиперазинил и тетрагидропиранил. Он может быть замещен одним, двумя или более идентичными или различными заместителями, указанными выше для гетероциклических радикалов. Предпочтительно R₃ означает незамещенный или замещенный (низш.)алкил.

Гетероциклический (низш.)алкил предпочтительно означает прямой или разветвленный гетероциклический С₁-С₄алкил, в котором гетероциклический имеет значения, указанные выше, например 2-, 3- или 4-пиперидилметил или (2- или 3-морфолинил)(этил, пропил или бутил).

С₃-С₇Циклокалкил означает насыщенный циклический углеводород, незамещенный или замещенный (низш.)алкилом, и содержащий от 3 до 7 атомов углерода в цикле, преимущественно циклопентил или циклогексил, незамещенный или замещенный (низш.)алкилом.

Циклоалкил(низш.)алкил предпочтительно означает (циклопентил- или циклогексил)(метил или этил).

(Низш.)алкокси(или алкилокси)группа предпочтительно содержит 1-4 углеродных атома, предпочтительно 1-3 углеродных атома, и означает, например, этокси, пропокси, изопропокси или, наиболее предпочтительно, метокси.

(Низш.)алкилтиогруппа предпочтительно содержит 1-4 углеродных атома, предпочтительно 1-3 углеродных атома, и означает, например, этилтио, пропилтио, изопропилтио или, наиболее предпочтительно, метилтио.

(Низш.)алкилсульфинилгруппа предпочтительно содержит 1-4 углеродных атома, предпочтительно 1-3 углеродных атома, и означает, например, этилсульфинил, пропилсульфинил, изопропилсульфинил или, наиболее предпочтительно, метилсульфинил.

(Низш.)алкилсульфонилгруппа предпочтительно содержит 1-4 углеродных атома, предпочтительно 1-3 углеродных атома, и означает, например, этилсульфонил, пропилсульфонил, изопропилсульфонил или, наиболее предпочтительно, метилсульфонил.

(Низш.)ацилоксигруппа предпочтительно содержит 1-4 углеродных атома и означает, например, ацетокси, пропаноилокси или бутаноилокси.

Ацилпроизводные пролекарства предпочтительно означают такие пролекарства, которые получены из органической угольной кислоты, органической карбоновой кислоты или карбаминовой кислоты.

Ацилпроизводным, полученным из органической карбоновой кислоты, является, например, (низш.)алканоил, фенил(низш.)алканоил или незамещенный или замещенный ароил, такой, как бензоил.

Ацилпроизводным, полученным из органической угольной кислоты, является, например, алкоксикарбонил, незамещенный или замещенный ароматическим радикалом, или циклоалкоксикарбонил, незамещенный или замещенный (низш.)алкилом.

Ацилпроизводным, полученным из карбаминовой кислоты, является, например, аминокарбонил, замещенный (низш.)алкилом, арил(низш.)алкилом, арилом, (низш.)алкиленом или (низш.)алкиленом, прерванным О или S.

Ациламино предпочтительно означает (низш.)алканоиламино или (низш.)алкоксикарбониламино.

C₁-С₃алкилен может означать, например, метилен, этилен, 1,2-диметилэтилен, 1,1-диметилэтилен, пропилен, 1,2-диметилпропилен, 2,2-диэтилпропилен или 1-метил-2-этилпропилен. C₁-С₃алкилен предпочтительно незамещен, наиболее предпочтительно означает метилен или этилен.

Радикал R, С₂-С₇алкил, имеет разветвленную или неразветвленную цепь, содержит от 2 до 7 атомов углерода и предпочтительно моно- или дизамещен галогеном, нитро, (низш.)ацилокси, трифторметокси, циано, С₃-С₅циклоалкил или С₃-С₆гетероарилгруппой, включающей один или два гетероатома, выбранные из группы О, S и N, и незамещенной или замещенной (низш.)алкилом. Более предпочтителен С₃-С₆гетероарил, монозамещенный галогеном, наиболее предпочтительно хлором или фтором, С₃-С₅циклоалкил, наиболее предпочтительно циклопропил, или незамещенный С₃-С₆гетероарил, включающий один или два гетероатома, предпочтительно один гетероатом, выбранный из группы О, S и N, например фурил, тиенил, пирролил, имидазолил, оксазолил, тиазолил или пиридинил. Радикал R, С₂-С₇алкил, означает, например, 7-фторгептил, 7-хлоргептил, 6-фторгексил, 6-хлоргексил, 5-хлорпентил, 5-нитропентил,5-цианопентил, 5-фторпентил, 4-фторпентил, 5,5,5-трифторпентил, 5-ацетоксипентил, 4-хлорбутил, 4-фторбутил, 3-фторбутил, 4,4,4-трифторбутил, 3,4-дихлорбутил, 4,4-дифторбутил, 4-ацетоксибутил, 4-пропионилоксибутил, 4-нитробутил, 4-цианобутил, 4-трифторметоксибутил, 3,4-дицианобутил, 4,4-дицианобутил, 4-ацетилокси-2,2-диметилбутил, 4-фтор-1-метилбутил, 1-этил-4-фторбутил, 3-хлорпропил, 3-фторпропил, 2-фторпропил, 3-цианопропил, 3-трифторметоксипропил, 2,3-дихлорпропил, 3-хлор-1,2-диметилпропил, 2-хлор-3-фторпропил, 3-циано-1,2-диметилпропил, 2-циано-3-фторпропил, 2-нитро-3-фторпропил, 2-циано-3-хлорпропил, 3,3,3-трифторпропил, 2-хлорэтил, 2-фторэтил, 2-цианоэтил, 2-циклопропилэтил, 3-циклопропилбутил, 2-циклобутилэтил, циклопропилметил, циклобутилметил, 3-фурилметил или 2-(3-фурил)этил. Предпочтительно радикал R, С₂-С₇алкил, содержит 3-5 атомов углерода и является неразветвленным. Предпочтительно заместители локализованы в конце цепи. Наиболее предпочтительно радикал R, С₃-С₇алкил, означает 4-хлорбутил, 4-фторбутил, 3-хлорпропил или 3-фторпропил.

Радикал R, С₃-С₇алкенил, может быть разветвленным или неразветвленным и содержит от 3 до 7 атомов углерода. Например, радикал R, С₃-С₇алкенил, означает 2-пропенил, 2-хлорметил-2-пропенил, 3-бутенил, 2-бутенил, 4-хлор-2-бутенил, 4-фтор-2-бутенил, 4-ацетокси-2-бутенил, 2-изобутенил, 2-пентенил, 3-пентенил, 5-хлор-2-пентенил, 5-фтор-3-пентенил, 5-нитро-З-пентенил, 4-пентенил, 5-гексенил, 3-хлор-5-гексенил, 4-гексенил или 6-гептенил. Предпочтительно радикал R, С₃-С₇алкенил, содержит 3-5 атомов углерода и является незамещенным. Двойная связь предпочтительно локализована в конце цепи. Предпочтительно радикал R, С₃-С₇алкенил, означает 4-пентенил, 3-бутенил или 2-пропенил, наиболее предпочтителььно 3-бутенил.

Радикал R, С₃-С₇алкинил, может быть разветвленным или неразветвленным и содержит от 3 до 7 атомов углерода. Предпочтительно радикал R, С₃-С₇алкинил, содержит 3-5 атомов углерода и является незамещенным. Например, радикал R, С₃-С₇алкинил, означает 2-пропинил, 2-бутинил, 4-циано-2-бутинил, 4-нитро-2-бутинил, 3-бутинил, 5-хлор-2-пентинил, 2-пентинил, 5-фтор-3-пентинил, 5-хлор-3-пентинил, 3-пентинил, 4-гексинил или 4-гептинил, предпочтительны 2-пропинил, 2-бутинил, 2-пентинил или 3-пентинил. Предпочтительно тройная связь локализована в конце цепи. Прежде всего, удовлетворительные результаты получены с соединениями, у которых R означает 2-пропинил.

Фармацевтически приемлемыми солями кислотных соединений по изобретению являются соли, образованные с основаниями, а именно катионные соли, такие как соли щелочных и щелочно-земельных металлов, таких как натрий, литий, калий, кальций, магний, а также аммониевые соли, такие как соли аммония, триметиламмония, диэтиламмония и трис(гидроксиметил)метиламмония.

Кроме того, аналогичным образом входящая в структуру основная группа, такая как пиридил, может образовывать кислотно-аддитивные соли с неорганическими кислотами, органическими карбоновыми кислотами и органическими сульфокислотами, например с хлористоводородной кислотой, метансульфокислотой, малеиновой кислотой.

Соединения формулы I обладают ценными фармакологическими свойствами. В частности, они обладают ингибирующими активностями, которые представляют интерес с фармакологической точки зрения.

Представители семейства разлагающих матрикс металлопротеиназ (ММР), такие как желатиназа, стромелизин и коллагеназа, принимают участие в различных биологических процессах, например в разложении матрикса ткани (например, коллагеновый коллапс) и во многих патологических состояниях, включающих аномальный метаболизм матрикса соединительной ткани и базальной мембраны, таких как артрит (например, остеоартрит и ревматоидный артрит), изъязвление ткани (например, изъязвление роговицы, эпидермальной ткани и желудка), аномальное заживление ран, болезнь периодонта, болезнь кости (например, болезнь Педжета и остеопороз), метастазы или инвазия опухоли, псориаз, а также ВИЧ-инфекция (J.Leuk. Biol., 52 (2): 244-248, 1992), атеросклероз, дилатация желудочка и рестеноз при ангиопластике.

Металлоэластаза макрофага является еще одним представителем разлагающих матрикс металлопротеиназ, и она принимает участие в разложении эластина и участвует в таких патологических состояниях, как, например, заболевания легкого, такие как эмфизема и ХОЛЗ (хроническое обструктивное заболевание легких).

Избирательность действия обычно является важным преимуществом фармакологически активных веществ, поскольку побочные действия лекарственных средств, включающих соединения избирательного действия, ниже по сравнению с лекарственными средствами, которые включают соединения с меньшей избирательностью. Поскольку семейство ММР состоит из нескольких различных ферментов, которые принимают участие в различных биологических процессах, то существует потребность в избирательных ингибиторах индивидуальных ММР или подгрупп семейства ферментов ММР.

Соединения формулы I и их фармацевтически приемлемые соли ингибируют разлагающую матрикс металлопротеиназу, такую как желатиназа, стромелизин и металлоэластаза макрофага, а также матриксные металлопротеиназы мембранного типа, такие как МТ1-ММР и МТ2-ММР. Оно особенно пригодны в качестве ингибиторов МТ1-ММР и ММР2 (желатиназа А).

Известны многочисленные пептиды, которые оказывают воздействие на биологические субстанции типа ферментов, клеток или рецепторов, участвующих в патологических процессах или болезнях. Недостатком пептидов является то, что они легко поддаются гидролизу в физиологических условиях, особенно в физиологических условиях, характерных для крови или желудка теплокровных животных. Соединения формулы I обладают преимуществом, поскольку они не являются пептидами. Соединения формулы I представляют собой не относящиеся к пептидам ингибиторы ММР2.

Эффективность соединений оценивают с использованием обычных хорошо известных в данной области фармакологических тестов, которые проиллюстрированы в настоящем описании.

Вышеуказанные свойства можно продемонстрировать в опытах in vitro и in vivo преимущественно при использовании млекопитающих, например крыс, морских свинок, собак, кроликов, или выделенных органов и тканей, а также препаратов ферментов млекопитающих. Указанные соединения можно применять in vitro в форме растворов, например, предпочтительно водных растворов, и in vivo либо энтерально, либо парентерально, предпочтительно перорально, например, в виде суспензии или водного раствора. Дозы, применяемые in vitro, могут находиться в диапазоне приблизительно от 10^-5 до 10^-10 молей. Дозы, применяемые in vivo, в зависимости от пути введения могут составлять от 0,1 до 100 мг/кг.

Противовоспалительную активность можно определять с использованием хорошо известных в данной области стандартных моделей воспаления и артрита у животных, например на модели вызванного адъювантом артрита у крыс и на модели вызванного коллагеном II артрита у мышей (Mediators of Inflam. 1, 273-279 (1992)).

Один из опытов, позволяющих определить ингибирование активности стромелизина, основан на гидролизе вещества Р с использованием модифицированного метода Харрисона и др. (Harrison R.A., Teahan J. и Stein R. A semicontinuous high performance chromatography based assay for stromelysin, Anal. Biochem. 180, 110-113 (1989)). В этом опыте вещество Р гидролизуют с помощью рекомбинантного человеческого стромелизина, получая фрагмент, а именно вещество Р 7-11, который можно количественно оценивать с помощью ЖХВР. В типичном опыте 10 мМ маточный раствор соединения, подлежащего тестированию, разбавляют в буфере для анализа до 50 мкМ, смешивая в соотношении 1:1 с 8 мкг рекомбинантного человеческого стромелизина (молекулярная масса 45-47 кДа, 2 единицы; где 1 единица продуцирует за 30 мин 20 ммолей вещества Р 7-11), и инкубируют вместе с 0,5 мМ веществом Р в конечном объеме 0,125 мл в течение 30 мин при 37°С. Реакцию прекращают, добавляя 10 мМ ЭДТК, и вещество Р 7-11 количественно определяют с помощью ОФ-8-ЖХВР. Значение IC₅₀ в качестве показателя ингибирующей активности в отношении стромелизина и значение K_i оценивают, используя в качестве контроля реакцию без ингибитора.

Эффективность соединений по изобретению в опытах in vivo можно определять на кроликах. Обычно четырем кроликам вводят перорально соединение за 4 ч до внутрисуставной инъекции в оба коленных сустава (N=8) 40 ед. рекомбинантного человеческого стромелизина, растворенного в 20 мМ Трис, 10 мМ CaCl₂ и 0,15М NaCl, pH 7,5. Через 2 ч кроликов умерщвляют, собирают синовиальную жидкость и количественно оценивают фрагменты кератансульфата (КС) и сульфированного гликозаминогликана (S-ГАГ), которые высвобождаются в сустав. Содержание кератансульфата измеряют по ингибированию с помощью ELISA в соответствии с методом Тонара (Thonar E.J.-M.A., Lenz M.E., Klinsworth G.K., Caterson В., Pachman L.M., Glickman P., Katz R., Huff J., Keuttner K.E., Arthr. Rheum. 28, 1367-1376 (1985)). Содержание сульфированных гликозаминогликанов сначала оценивают по разложению синовиального лаважа гиалуронидазой из бактерий Streptomices, а затем измеряют связывание с красителем DMB по методу Гольдберга (Goldberg R.L. и Kolibas L., Connect. Tiss. Res., 24, 265-275 (1990)). Для внутривенного введения соединения растворяют в 1 мл ПЭГ-400, а при применении перорально соединение вводят в 5 мл обогащенного кукурузного крахмала на килограмм веса тела.

Ингибирующую активность в отношении металлоэластазы макрофага (ММЕ) можно определять путем измерения ингибирования разложения [³Н]-эластина с помощью укороченной рекомбинантной мышиной металлоэластазы макрофага следующим образом.

Приблизительно 2 нг укороченной рекомбинантной мышиной металлоэластазы макрофага (FASEB Journal, том 8, А151, 1994), очищенной с помощью хроматографии на колонке, заполненной Q-сефарозой, инкубируют при 37°С в течение ночи с тестируемыми соединениями в требуемой концентрации в присутствии 5нМ CaCl₂, 400 нМ NaCl, [³Н]-эластина (60000 импульсов в мин/пробирку) и 20 мМ Трис, рН 8,0. Образцы вращают на микроцентрифуге при 12000 об/мин в течение 15 мин. Для количественной оценки разложения [³Н]-эластина с помощью сцинтилляционного счетчика измеряют радиоактивность в аликвотных количествах супернатанта. Значение IC₅₀ определяют с использованием различных концентраций тестируемых соединений и вычисляют процент ингибирования активности фермента.

Ингибирующие активности соединений формулы I в отношении МТ1-ММР, ММР1 (коллагеназа 1) и ММР2" (желатиназа А) можно определить следующим образом.

Маточные растворы субстрата (MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂, Knight C.G,, Willenbrick F., Murphy G., A novel coumarin-labelled peptide for sensitive continous assay of matrix metalloproteinases, FABS lett. 296, 263-266 (1992)) готовят в 100%-ном ДМСО в концентрации 1,0 мМ. Маточные растворы ингибиторов готовят в 100%-ном ДМСО. Для проведения анализов ингибитор разбавляют из раствора в 100%-ном ДМСО, а для получения контрольных образцов заменяют ингибитор равным объемом ДМСО так, чтобы конечная концентрация ДМСО в разбавлениях ингибитора и субстрата во всех анализах составляла 6,0%. Анализы проводят в буфере для анализа (150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 50 мМ Трис-Cl, рН 7,5, 0,05% Brij-35), содержащем 6,0% ДМСО, причем в нем растворяют и субстрат, и ингибитор. Используемая в анализах концентрация субстрата составляет 10 мкМ. Опыт осуществляют при 37°С. Оценивают изменение флуоресценции при использовании длины волны возбуждения 320 нм и длины волны испускания 340 нм. Реакционную смесь добавляют с дублированием в соответствующие лунки 96-луночного микропланшета для измерения флуоресценции. Реакционную смесь предварительно инкубируют с ингибитором в течение 30 мин, реакцию инициируют, добавляя фермент ММР, и интенсивность флуоресценции измеряют в течение 10 мин. Для определения активности выбирают момент времени, соответствующий линейной части кривой. Результаты опытов по ингибированию выражают в виде концентраций ингибиторов, при которых наблюдается 50%-ное ингибирование (IC₅₀) активности относительно контрольной реакции (без ингибиторов). В этом опыте для соединений формулы I и их фармакологически приемлемых солей значение IC₅₀ [мкмоль/л] в отношении ингибирования ММР2 составляет 0,0001 и 0,030, как привило, 0,002-0,010, а значение IC₅₀ [мкмоль/л] в отношении ингибирования МТ1-ММР составляет 0,0005 и 0,125, как привило, 0,001-0,050. Для соединений формулы I значение IC₅₀ в отношении ингибирования ММР1 (коллагеназа 1) превышают значения IC₅₀ в отношении ингибирования МТ1-ММР вплоть до 1000 раз, как правило, превышают примерно в 40-200 раз. Для соединений формулы I значение IC₅₀ в отношении ингибирования ММР1 превышают значения IC₅₀ в отношении ингибирования ММР2 вплоть до 5000 раз, для большинства соединений формулы I превышают примерно в 100-2000 раз.

Применяемые в вышеописанных опытах ферменты получают следующим образом.

МТ1-ММР

Плазмида: Каталитический домен фрагмента кДНК, кодирующего полноразмерный человеческий ген (МТ1-ММР) [получен от проф. Motoharu Seiki, Institute of Medical Science, The University of Tokyo; Sato H., Takino Т., Okada Y., Cao J., Shinagawa A., Yamamoto E. и Sieki M, Nature (London), 370: 61-65 (1994)], апмплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применяют следующие праймеры: CTCCATATGTACGCCATCCAGGGTCTCAA в качестве смыслового праймера, включающего сайт NdeI на 5'-конце для стартового кодона ATG, и CTCGGATCCTCACCCATAAAGTTGCTGGAT-GCC в качестве смыслового праймера, включающего сайт BamHI с одним стоп-кодоном TGA (1). Полученный в результате ПЦР-продукт, представляющий собой фрагмент длиной 519 т.п.н., субклонируют между уникальными сайтами NdeI и BamHI плазмиды pET11a (фирма Stratagene). Последовательность каталитического домена МТ1-ММР (CD-MT1-MMP) подтверждают с помощью набора для секвенирования с использованием термоячейки с красителем типа ABI PRISMTM с использованием ДНК-секвенатора типа ABI PRISMTM 377 (фирма Perkin Elmer).

Экспрессия и очистка: Субклонированный домен CD-MT1-MMP применяют для трансфекции штамма Е. coli BL21[DE3] (Hanahan D., J. Mol. Biol., 166(4); 557-580 (1983) и экспрессируют в виде нерастворимых внутриклеточных телец. Трансфектатнты выращивают при 37°С в 50 мл среды Лурия-Бертани (LB) в присутствии 50 г/мл ампициллина до достижения плотности клеток ОП₆₀₀, составляющей 0,6-1,0, и производство CD-MT1-MMP индуцируют с помощью 1 мМ изопропил-1D-галактопиранозида (IPTG). После обработки 5 мг/мл лизоцима и 10 мкг/мл ДНКазы I из собранных клеток выделяют внутриклеточные тельца с помощью детергентного буфера, содержащего 0,2М NaCl, 1% (мас./об.) дезоксихолевой кислоты и 1 об.% Nonodet P-40. Осуществляют солюбилизацию путем ресуспендирования внутриклеточных телец в буфере для солюбилизации, включающем 6М мочевину, 100 мМ 2-меркаптоэтанол и 20мМ Трис-Cl, рН 8,5. Фермент очищают и ренатурируют с помощью 10-миллилитровой заполненной Q-сефарозой (фирма Amersham Pharmacia Biotech.) колонки, уравновешенной 5мМ CaCl₂, 0,02 об.% NaNs в 20мМ Трис-Cl, рН 7,5. После промывки тремя объемами этого же буфера связанные протеины элюируют двумя объемами раствора с линейным градиентом 0,5-1,0М NaCl. Собранные фракции (по 1 мл каждой) подвергают диализу в противотоке уравновешивающего буфера в течение 6 ч. Superdex 0200-колонку (1×15 см) (фирма Amersham Pharmacia) уравновешивают в 20мМ Трис-Cl, рН 7,5, 5мМ CaCl₂, 0,02% NaN₃. Обессоленный образец вносят в Superdex С200-колонку и хроматографируют при скорости потока 0,5 мл/мин. Собирают фракции объемом по 1 мл и аликвоты по 30 мл анализируют с помощью иммуноблоттинга. Объединяют наиболее чистые фракции, концентрируют с помощью мешалки типа Amicon, снабженной мембраной типа YM2, и хранят при -80°С. Элюированный протеин дважды подвергают диализу в противотоке 5 л буфера, включающего 5 мМ CaCl₂, 0,5 мМ ZnSO₄, 20 мМ Трис-Cl, рН 7,5, затем концентрируют с помощью мешалки типа Amicon, снабженной мембраной типа YM2. В этих условиях рекомбинантные протеины сохраняют растворимость и имеют правильную укладку.

ММР1 (коллагеназа 1)

Плазмида: кДНК человеческой коллагеназы получают с помощью ПЦР с использованием кДНК, полученной из РНК, выделенной из человеческих клеток линии U937 (АТСС No. CRL-2367). Праймеры, которые применяют для получения этой кДНК, представляют собой AAAGAAGCTTAAGGCCAGTATGCACAGCTTTCCT и AAGGCGGCCGCACACCTTCTTTGGACTCACACCA, соответствующие нуклеотидам 58-1526 описанной последовательности кДНК, GenBank, регистрационный номер Х05231. Полученный в результате фрагмент кДНК субклонируют в сайте NotI экспрессионного вектора млекопитающих pBPV-ММТ (Matthias Р. и др. J. Mol. Biol., 187(4): 557-568 (1986)).

Клетки линии С127 (АТСС-линия клеток опухоли молочной железы) выращивают в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла, дополненной 10% подвергнутой температурной инактивации фетальной бычьей сыворотки и 1-кратным (IX) раствором антибиотика-противогрибкового агента при 37°С в увлажняющем СО₂-инкубаторе. Клетки, высеянные с плотностью 8×10⁵ в 10-миллиметровые чашки, трансфектируют с использованием метода осаждения фосфатом кальция. За 5 ч до трансфекции среду заменяют свежей средой. Каждую чашку трансфектируют 15 мкг экспрессионного вектора. Клетки промывают дважды с помощью ЗФР через 16-18 ч после трансфекции и инкубируют в среде для выращивания в течение еще 48 ч. Затем клоны отбирают путем инкубации с родственным неомицину антибиотиком G48 в концентрации 400 мкг/мл. Среды отобранных клонов анализируют в отношении экспрессии коллагеназы путем ферментного анализа.

Экспрессия и очистка: 16 л культуральной среды концентрируют до 1,6 л и фермент выделяют с помощью метода, описанного у Wilhelm с соавторами (Proc. Acad. Sci. (USA), 84: 6725-6729 (1987)). Конечный продукт дополнительно очищают на заполненной Superose G-75 (фирма Pharmacia/LKB, Пискатавей, штат Нью-Джерси) колонке для гель-фильтрации, уравновешенной буфером для анализа, который содержит 0,15М NaCl. Объединяют фракции фермента и хранят в виде аликвот при -70°С. Рекомбинантную проколлагеназу (43-45 кДа) активируют с помощью 1 мМ АФРА (ацетат аминонофенил ртути, фирма ICN Pharmaceuticals) в течение 2 ч при 37°С и АФРА удаляют путем интенсивного диализа в противотоке буфера для анализа, содержащего 0,15М NaCl. Активированный фермент (˜36 кДа) хранят в замороженном виде при -70°С до применения.

ММР2 (желатиназа А)

Плазмида: кДНК человеческой proMMP получена от проф. Motoharu Seiki, Institute of Medical Science, The University of Tokyo. кДНК, кодирующую полноразмерную человеческую проММР2, получают с помощью ПЦР из кДНК, полученной из РНК, выделенной из человеческой линии клеток НТ1080 (АТСС No. CCL121). Праймеры, которые применяют для получения этой кДНК, представляют собой GAATTCGATGGAGGCGCTAATGGCCCGG и CTCGAGTCAGCAGCCTAGCCAGTCGGATTTGAT, соответствующие полноразмерной человеческой proMMP указанной последовательности кДНК, GenBank, регистрационный номер J03210. Полученный в результате ПЦР-фрагмент длиной 2,0 т.п.н. клонируют в сайте EcoRI/XhoI вектора pFAST ВАС 1 (рВАС-ММР2) (Collier I.E., Wolhelm S.M., Eisen A.Z., Marmer B.L., Grant G.A., Seltzer J.L., Kronberger A., He C., Bauer E.A. и Goldberg G.I,, J. Biol. Chem., 263: 6579-6587, 1988).

Экспрессия и очистка: Для экспрессии в бакуловирусе r-proMMP2 с помощью рВАС-ММР2 трансформируют компетентные клетки линии DH10BAC, получая бакмидную ДНК r-proMMP2. Рекомбинантной бакмидной ДНК трансфектируют культивируемые клетки насекомых (Tn-клетки) с помощью реагента целлфектина (Cellfectin, фирма Gibco BRL). Рекомбинантный бакуловирус очищают до гомогенных бляшек и применяют для получения маточных растворов с высоким титром рекомбинантного бакуловируса. Экспрессию r-proMMP2 подтверждают с помощью зимографии с использованием желатина.

Культуральные жидкости Tn-клеток, зараженных бакуловирусом, центрифугируют и фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мм, удаляя клеточный дебрис. Рекомбинантная proMMP абсорбирутся желатин-сефарозой 4В (фирма Pharmacia Biotech) в уравновешивающем буфере, который включает 25 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 1М NaCl, 10 мМ CaCl₂, 0,05% Brij 35 при 4°С. После промывки гранул уравновешивающем буфером проММР элюируют с помощью уравновешивающего буфера, который содержит 10% ДМСО. Фермент хранят при 4°С до активации. Для анализа очищенную проММР активируют с помощью 1 мМ АФРА в течение 1 ч при 37°С.

ММР9

ММР9 получают из культуральной среды человеческих моноцитных клеток лейкемии линии ТНР1, обработанных ТРА (12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат). Клетки линии ТНР1 поддерживают в культуральной среде DMEM/F-12, дополненной 10% ФТС, и стимулируют к производству про-ММР9 с помощью ТРА (1 нМ) в бессывороточной среде в течение 48 ч. Все процессы очистки осуществляют при 4°С. Один литр культуральной среды концентрируют до 100 мо с помощью устройства типа Centricon (фирма Amicon) и вносят в колонку (1×8 см), заполненную желатином-сефарозой, которая уравновешена 50 мМ Трис-Cl (рН 8,0), 300 мМ NaCl. Фракцию, содержащую про-ММР9, элюируют с помощью 10% ДМСО в 50 мМ Трис-Cl (рН 8,0), 300 мМ NaCl, а затем подвергают диализу в противотоке 50 мМ Трис-Cl (рН 7,5), 150 мМ NaCl. Фракцию концентрируют с помощью устройства типа Centricon и хроматографируют на колонке, заполненной Sephadex G200 (2×20 см), уравновешенной 50 мМ Трис-Cl (рН 7,5), который содержит 150 мМ NaCl. Очищенную про-ММР9 хранят при -80°С в виде маточного раствора, и необходимое количество профермента используют для активации. Про-ММР9 активируют с помощью 1 мМ АФРА (ацетат аминофенилртути, фирма ICN Pharmaceuticals) в 50 мМ Трис-Cl (рН 7,5), который содержит 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 0,05% Brij 35 (буфер для анализа ММР) в течение 18 ч при 37°С, и АФРА удаляют путем интенсивного диализа в противотоке буфера для анализа ММР. Активированную ММР9 хранят при -80°С до использования.

Анализ ММР9

Затем активированную ММР-9 (82 кДа) применяют для скрининга соединений. В этом опыте флуорогенный пептид 2-N-метиламинобензойная кислота (Nma)-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-Lys-N^ε-(2,4-динитрофенил) (Dnp)-NH₂ (Peptide Institute, Осака, Япония) в концентрации 25 мкМ применяют в качестве единственного субстрата во всех анализах ММР. Маточные растворы субстрата готовят в 100% ДМСО в концентрации 1,0 мМ. Анализы осуществляют в буфере д