Циклипостины, способ их получения, фармацевтическая композиция на их основе, способ ее получения и штамм streptjmyces, являющийся продуцентом циклипостинов

Циклипостины, способ их получения, фармацевтическая композиция на их основе, способ ее получения и штамм streptjmyces, являющийся продуцентом циклипостинов

Реферат

Изобретение относится к новым соединениям, называемым циклипостинами, которые получают путем культивирования вида Streptomyces HAG 004107 (DSM 13381), и их физиологически приемлемым солям и химическим эквивалентам. Изобретение относится далее к способу получения циклипостинов, микроорганизму HAG 004107 (DSM 13381), применению циклипостинов и их физиологически приемлемых солей и химических эквивалентов в качестве лекарственных средств, в особенности в качестве ингибиторов липаз, а также к фармацевтическим композициям, содержащим циклипостин или его физиологически приемлемую соль, или его эквивалент.

Заболеванием, которое особенно предпочтительно можно лечить с помощью ингибиторов липазы, является сахарный диабет (Diabetes mellitus). Сахарный диабет представляет собой заболевание, которое характеризуется повышенными концентрациями сахара крови вследствие хронических нарушений обмена веществ. Нарушения обмена веществ основываются на дефиците инсулина или пониженном действии инсулина. Отсутствие действия инсулина приводит к недостаточной утилизации соматическими клетками поступающей в кровь глюкозы. Посредством этого, а также за счет новообразования глюкозы из белков (глюконеогенез) повышается уровень глюкозы в крови. Сверх того, в случае пониженного действия инсулина в жировой ткани антагонистические к инсулину гормоны, как глюкоген, приводят к усиленному липолизу и тем самым к повышенным концентрациям жирных кислот в крови. Речь идет о кетоацидозе, то есть о повышенном образовании кетоновых тел (как ацетоуксусная кислота, β-гидроксибутановая кислота, ацетон). В острых ситуациях отсутствие биохимического регулирования является опасным для жизни и приводит, без лечения, к диабетической коме, наконец, к быстрой смерти. Сахарный диабет относится к самым частым хроническим болезням обмена веществ человека, причем полагают, что свыше 3% населения имеют диабетическую или предиабетическую предрасположенность и тем самым находятся под экстренной угрозой заболевания. Поэтому существует большая потребность в средствах для лечения или излечения сахарного диабета.

Лечение сахарного диабета осуществляют путем введения инсулина; в случае старческого диабета, так называемого инсулиннезависимого диабета (NIDDM) или диабета типа II, сначала вводят сульфонилмочевины. Принцип действия сульфонилмочевин заключается в увеличении секретирования инсулина β-клетками в поджелудочной железе с целью компенсации дефицита гормона или инсулинорезистентности. В случае прогрессирования заболевания также нужно вводить инсулин. Действие инсулина можно обобщить следующим образом. Этот пептидный гормон снижает концентрацию глюкозы в крови и приводит к усилению анаболических и одновременно к подавлению катаболических процессов:

- увеличивает транспорт глюкозы в соматические клетки;

- повышает образование гликогена в печени и в мышцах;

- подавляет липолиз;

- повышает поступление жирных кислот в жировую ткань и

- увеличивает поступление аминокислот в соматические клетки, а также усиливает синтез белка.

Одним из самых сильных эффектов инсулина является подавление липолиза. В случае больных диабетом типа II этой регуляции липолиза более недостаточно и приходят к повышенному уровню свободных жирных кислот в крови. Свободные жирные кислоты в крови стимулируют глюконеогенез в печени и снижают утилизацию глюкозы в скелетных мышцах. Липолиз, то есть высвобождение жирных кислот, контролируется благодаря так называемой гормончувствительной липазе (HSL), которая находится в жировых клетках и подавляется инсулином за счет каскада фосфорилирования. Поэтому были бы желательны ингибиторы, то есть ингибиторы HSL, которые могут имитировать действие инсулина и снижать уровень жира в крови. Такие агенты пригодны для лечения больных диабетом типа II в целях регуляции жирового обмена, которые, однако, также можно было бы применять в случае других болезней накопления. По всем этим причинам настоятельно необходимы и поэтому изыскиваются новые ингибиторы HSL и других липаз.

Неожиданно было показано, что штамм микроорганизма вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, может вырабатывать высокоэффективные новые ингибиторы липазы, которые ингибируют гормончувствительную липазу еще в очень незначительных концентрациях. Новые природные соединения представляют собой фосфорорганические соединения, которые состоят из двойной циклической системы (бицикл) и замещенной углеродной цепи и специфически ингибируют липазы. Циклический скелет - только с метильной группой вместо углеродной цепи - в качестве ингибитора ацетилхолинэстеразы, CGA 134736, впервые был описан R. Neumann and H.H. Peter в Experientia, 43, 1235-1237 (1987) и позднее такое же соединение, названное циклофостин, было описано T. Kurokawa и др., в J. Antibiotics, 46, 1315-1318 (1993). Это структурнородственное соединение не обладает никаким селективным, ингибирующим липазу свойством. Известные до сих пор вещества обладают недостатками, которые выражаются в неудовлетворительной интенсивности действия, высокой токсичности и/или нежелательных побочных действиях.

Настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы (I):

где

R¹ означает

1. углеродную цепь с 2-30 атомами углерода, которая может быть линейной, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной, карбо- или гетероциклической, и причем углеродная цепь может быть одно- или двукратно замещена с помощью:

1.1 -ОН;

1.2 =О;

1.3 -О-(С₁-С₆)-алкила, где алкил является линейным или разветвленным;

1.4 -О-(С₂-С₆)-алкенила, где алкенил является линейным или разветвленным;

1.5 -(С₁-С₆)-алкила, где алкил является линейным или разветвленным;

1.6 -арила;

1.7 -(С₁-С₆)-алкилбензола;

1.8 -дифенила;

1.9 -NH-(C₁-C₆)-алкила, где алкил является линейным или разветвленным;

1.10 -NH-(C₂-C₆)-алкенила, где алкенил является линейным или разветвленным;

1.11 -NH₂;

1.12 =S;

1.13 -S-(C₁-C₆)-алкила, где алкил является линейным или разветвленным; или

1.14 -S-(C₂-C₆)-алкенила, где алкенил является линейным или разветвленным;

1.15 галогена; причем заместители 1.1-1.15 также могут быть еще замещены;

2. -[арил-(СН₂)_n]_m, где [арил-(СН₂)_n]_m незамещен или одно- или двукратно замещен как описано в 1.1-1.15, и n, а также m, независимо друг от друга, означают целые числа нуль, 1, 2 или 3;

R² означает

1. (С₁-С₆)-алкил, где алкил незамещен или одно- или двукратно замещен как описано в 1.1-1.15;

2. (С₂-С₆)-алкенил, где алкенил незамещен или одно- или двукратно замещен, как описано в 1.1-1.15; или

3. (С₂-С₆)-алкинил, где алкинил незамещен или одно- или двукратно замещен, как описано в 1.1-1.15;

Е означает атом фосфора (Р) или атом серы (S);

Х₁, Х₂ и Х₃ независимо друг от друга означают

1. -О-;

2. -NH-;

3. -N=;

4. -S- или

5. -СН₂- и -CHR²-;

ко всем их стереохимическим формам и смесям этих форм в любом соотношении, а также их физиологически приемлемым солям и химическим эквивалентам.

Предпочтительно R¹ имеет длину цепи, состоящую предпочтительно из 6-24 атомов углерода, в высшей степени предпочтительно из 10-18 атомов углерода. Цепь может быть насыщенной, как, например, алкил, где алкил может быть линейным или разветвленным, или ненасыщенной, как, например, алкенил или алкинил, где алкенил или алкинил является линейным или разветвленным. R¹ может быть незамещен или одно- или двукратно, одинаково или различно замещен с помощью групп 1.1-1.15, как описанные выше. Предпочтительны заместители у атомов углерода 8'-16'; особенно предпочтительны положения 10'-14'. Заместители 1.1-1.15 также могут быть еще замещены одной или несколькими группами, выбираемыми из спиртовых, альдегидных, ацетальных, кетальных, простых эфирных, карбоксильных, сложноэфирных, амино-, циано-, нитро-, оксимных групп, групп простых эфиров оксимов и галогена.

Карбоциклическая углеродная цепь с 2-30 атомами углерода означает состоящую из 2-30 атомов углерода цепь с одной или несколькими, предпочтительно с одной, двумя или тремя циклическими системами, которые предпочтительно состоят, соответственно, из 4, 5, 6 или 7 атомов углерода. Эти системы могут быть моно-, ди- или трициклическими, предпочтительно моноциклическими, и могут быть расположены в начале, в середине и/или на конце углеродной цепи. Карбоциклы могут быть алифатической или ароматической природы. Примерами являются замещенные дифенилы или алкилбензолы.

Гетероциклическая углеродная цепь с 2-30 атомами углерода означает состоящую из 2-30 атомов углерода цепь с одной или несколькими, предпочтительно с от одной до трех циклическими системами, в которых по меньшей мере один атом углерода заменен гетероатомами, как, например, О, S или N. Эти системы могут быть моно-, ди- или трициклическими, предпочтительно моноциклическими, и могут быть расположены в начале, в середине и/или на конце углеродногй цепи. Могут быть предпочтительно 4-, 5-, 6- или 7-членные циклы алифатической или ароматической природы. Примерами являются замещенные или незамещенные алкилпиперидины.

Арил означает ароматический цикл или циклическую систему с 6-14, предпочтительно с 6-10, атомами углерода, как, например, возможно замещенный, алкилфенол или алкилнафтол.

Галоген означает хлорид, бромид, фторид или псевдогалогениды, как цианид (нитрил).

(С₁-С₆)-алкил означает линейный или разветвленный алкил с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомами углерода, как, например, метил, этил, изопропил, трет-бутил и гексил.

(С₂-С₆)-алкенил означает линейный или разветвленный алкенил с 2, 3, 4, 5 или 6 атомами углерода, как, например, аллил, кротил и пентенил.

(С₂-С₆)-алкинил означает линейный или разветвленный алкинил с 2, 3, 4, 5 или 6 атомами углерода, как, например, пропинил, бутинил и пентинил.

R¹ предпочтительно означает:

1. -(СН₂)₁₅СН₃;

2. -(СН₂)₁₃СН(СН₃)₂;

3. -(СН₂)₁₁СН(ОН)(СН₂)₃СН₃;

4. -(СН₂)₁₁СН(ОН)СН₂СН(СН₃)₂;

5. -(СН₂)₁₂СН(ОН)(СН₂)₂СН₃;

6. -(СН₂)₁₃СН(ОН)СН₂СН₃;

7. -(СН₂)₁₄СН(ОН)СН₃;

8. -(СН₂)₁₅СН₂(ОН);

9. -(СН₂)₁₆СН₃ или

10.0 -(СН₂)₁₃С=ОСН₂СН₃;

11.0 -(СН₂)₁₂С=ОСН₂СН₂СН₃;

12.0 -(СН₂)₁₁С=ОСН₂СН₂СН₂СН₃;

13.0 -(СН₂)₁₃СН₃;

14.0 -(СН₂)₁₁СН(СН₃)₂;

15.0 -(СН₂)₁₄СН₃ или

16.0 -(СН₂)₁₂СН(СН₃)₂.

R² предпочтительно означает (С₁-С₆)-алкил, в особенности метил, этил или пропил.

Предпочтительные соединения согласно изобретению указаны ниже:

циклипостин А формулы (II):

циклипостин А2 формулы (II A):

циклипостин В формулы (III):

циклипостин С формулы (IV):

циклипостин D формулы (V):

циклипостин E формулы (VI):

циклипостин F формулы (VII):

циклипостин G формулы (VIII):

циклипостин H формулы (IX):

циклипостин N формулы (X):

циклипостин P формулы (XI):

циклипостин P2 формулы (XI A):

циклипостин Q формулы (XII):

циклипостин R формулы (XIII):

циклипостин R2 формулы (XIII A):

циклипостин S формулы (XIV):

циклипостин T формулы (XV):

циклипостин T2 формулы (XV A):

все их стереохимические формы и смеси этих форм в любом соотношении, а также их физиологически приемлемые соли и химические эквиваленты.

Система нумерации атомов углерода для спектров ЯМР в вышеуказанных формулах является следующей:

Циклическая система содержит только два асимметрически замещенных атома, атом углерода в положении 3 (атом С3) и атом фосфора. Оба атома могут быть в R- или в S- конфигурации. Неожиданно было показано, что штамм вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, способен продуцировать, соответственно, несколько стереоизомеров соединений общей формулы (I), то есть штамм синтезирует соединения, в которых атомы С3 и Р независимо друг от друга могут принимать R- или S-конфигурацию. Изомеры с пространственной формой у углерода-(3) в R-конфигурации и у атома фосфора в S-конфигурации встречаются в культурах вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, в большем количестве. Формула (IA):

Наряду с ними, однако, также образуются циклипостины с другими конфигурациями, как (R,R), (S,S) или (S,R), которые неожиданно также обладают значительными, ингибирующими липазу, активностями.

Соединение формулы (I) или его физиологически приемлемую соль, или его химический эквивалент получают тем, что микроорганизм вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, или один из его вариантов или мутантов ферментируют в пригодных условиях в культуральной среде вплоть до накопления в культуральной среде одного или нескольких соединений формулы (I) и затем выделяют из культуральной среды и, в случае необходимости, переводят в химические эквиваленты и физиологически приемлемые соли.

Предлагаемые согласно изобретению циклипостины могут продуцироваться видом Actinomycetales, предпочтительно видом Streptomyces HAG 004107, DSM 13381. Вид Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, имеет окрашенный дентином мицелий (RAL 1014) и отличается характерными для стрептомицетов конидиофорами.

Выделенный продукт депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ, Mascheroder Weg 1B, D 38124 Брауншвейг, Германия, согласно правилам Будапештского Договора, 16 марта 2000 г. под следующим номером: Streptomyces species HAG 004107, DSM 13381.

Вместо штамма вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, можно использовать также его мутанты и варианты, которые продуцируют один или несколько предлагаемых согласно изобретению циклипостинов. Такие мутанты можно получать само по себе известным образом при использовании физических средств, например путем облучения как с помощью ультрафиолетовых или рентгеновских лучей, или химических мутагенов, как, например, этилметансульфонат (EMS), 2-гидрокси-4-метоксибензофенон (МОВ) или N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG).

Таким образом, изобретение относится к способу получения соединения формулы (I) или его физиологически приемлемой соли, отличающемуся тем, что микроорганизм вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, или один из его вариантов или мутантов ферментируют в пригодных условиях в культуральной среде вплоть до накопления в культуральной среде одного или нескольких соединений общей формулы (I) и затем выделяют из культуральной среды и, в случае необходимости, переводят в химические эквиваленты и физиологически приемлемые соли.

Предпочтительно штамм вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, его мутанты и/или варианты ферментируют в питательном растворе (также называемом культуральной средой) с источниками углерода и азота, а также с обычными неорганическими солями вплоть до накопления новых циклипостинов в культуральной среде, затем циклипостины выделяют из культуральной среды и в случае необходимости разделяют на отдельные активные компоненты.

Ферментацию предпочтительно осуществляют в аэробных условиях, она протекает особенно хорошо при температуре в диапазоне от 18°С до 35°С и при значении рН 6-8.

Предлагаемый согласно изобретению способ можно использовать для ферментации в лабораторном масштабе (в объеме от миллилитра до литра) и в промышленном масштабе (в объеме кубического метра). Все указанные в процентах данные относятся, если не указано иное, к массе. Соотношения компонентов смеси в случае жидкостей относятся к объему, если не приводятся другие указания.

В качестве предпочтительных источников углерода для аэробной ферментации пригодны ассимилируемые углеводы и получаемые восстановлением сахаров спирты, как глюкоза, лактоза, сахароза или D-маннит, а также содержащие углеводы натуральные продукты, как, например, овсяные хлопья, соевая мука и солодовый экстракт. В качестве азотсодержащих питательных веществ используют аминокислоты, пептиды и белки, а также продукты их расщепления, как пептоны или триптоны, далее, мясные экстракты, дрожжевые экстракты (Hefeextrakte), размолотые семена, например, кукурузы, пшеницы, фасоли, сои или хлопчатника, остатки от перегонки при получении спиртов, мясную кормовую муку, однако, также аммониевые соли и нитраты. В качестве неорганических солей питательный раствор может содержать, например, хлориды, карбонаты, сульфаты или фосфаты щелочных или щелочноземельных металлов, железа, цинка, кобальта и марганца.

Образование предлагаемых согласно изобретению циклипостинов формул (II)-(XVA) протекает особенно хорошо в культуральной среде, которая содержит примерно 0,1-5%, предпочтительно 0,3-3%, овсяных хлопьев и микроэлементы. Данные в процентах, соответственно, относятся к массе всей культуральной среды.

Предпочтительно, согласно изобретению образование циклипостинов формул (VIII)-(XVA) особенно хорошо происходит в питательных растворах, которые содержат примерно 0,1-5%, предпочтительно 0,3-2%, глицерина и 0,2-5%, предпочтительно 0,5-3%, соевой муки и 0,05-1,0 г/л, предпочтительно 0,1-1,0 г/л, хлорида натрия.

В культуральной среде вид Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, продуцирует смесь циклипостинов. В зависимости от состава культуральной среды можно изменять массовую долю одного или нескольких предлагаемых согласно изобретению циклипостинов. Кроме того, за счет состава сред можно ускорять синтез отдельных циклипостинов, так что один или также несколько циклипостинов вовсе не продуцируются микроорганизмом или продуцируются в количестве ниже предела обнаружения.

Культура, предпочтительно, содержит обнаруживаемый циклипостин. Предпочтительно образуются циклипостины А или Р, или Р2.

Наряду с циклипостинами А-Т2 (соединения формул (II)-(XVA)) в культуральной среде вида Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, образуются другие родственные соединения, которые отличаются измененными остатками R¹ и R² в представленных формулами (II)-(XVA) соединениях. В меньших количествах обнаруживают циклипостины, которые обладают укороченным или более разветвленным остатком R¹. В культурах Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, также обнаруживают продукты окисления (гидроксилирования) этих дополнительных компонентов.

Культивирование микроорганизма происходит аэробно, например, в погруженном состоянии путем встряхивания или перемешивания во встряхиваемых колбах или ферментерах в случае необходимости при пропускании воздуха или кислорода. Культивирование можно осуществлять в температурном интервале примерно от 18°С до 35°С, предпочтительно при примерно 25-32°С, в особенности при 26-30°С. Область значений рН должна составлять 6-8, предпочтительно 6,5-7,8. Микроорганизм культивируют в этих условиях в общем в течение периода времени от 24 часов до 300 часов, предпочтительно 30-90 часов.

Предпочтительно культивируют в несколько стадий, то есть сначала в жидкой культуральной среде получают одну или несколько предкультур, которые затем пересевают непосредственно в производственную питательную среду (основная культура), например, в объемном соотношении 1:10. Предкультуру получают, например, тем, что мицелий пересевают в питательный раствор и культивируют в течение примерно 36-120 часов, предпочтительно 48-96 часов. Мицелий можно получать, например, тем, что штамм культивируют в течение примерно 3-40 дней, предпочтительно 4-10 дней, на твердой или жидкой питательной среде, например солододрожжевом агаре или агаре из овсяных хлопьев.

За протеканием процесса ферментации можно следить по значениям рН культур или объему мицелия, а также посредством хроматографических методов, как, например, тонкослойная хроматография или высокоэффективная жидкостная хроматограция (ВЭЖХ), или путем тестирования биологической активности. Циклипостины согласно изобретению содержатся в мицелии, в меньшем количестве также в культуральной жидкости. Описанный ниже способ выделения служит для очистки предлагаемых согласно изобретению циклипостинов, предпочтительно для очистки циклипостинов А и Р.

Выделение, соответственно, очистку предлагаемых согласно изобретению циклипостинов из культуральной среды осуществляют известными способами при учете химических, физических и биологических свойств природных веществ. Для определения концентрации циклипостина в культуральной среде или на отдельных стадиях выделения можно использовать тонкослойную хроматографию, например, на силикагеле с помощью смесей дихлорметана и этилацетата или хлороформа и метанола (например, в количественном соотношении 98:1) в качестве растворителей, или ВЭЖХ. Детектирование в случае разделения путем тонкослойной хроматографии можно осуществлять, например, с помощью окрашивающих реагентов, как фосфорномолибденовая кислота или пары йода, причем количество образовавшегося вещества целесообразно сравнивают с эталонным раствором.

Для выделения предлагаемых согласно изобретению циклипостинов сначала отделяют мицелий от культуральной среды обычными способами и затем циклипостины экстрагируют из клеточной массы с помощью в случае необходимости смешивающегося с водой органического растворителя. Органическая фаза растворителя содержит циклипостины согласно изобретению, в случае необходимости ее концентрируют в вакууме и очищают далее как описано ниже.

Культуральную жидкость в случае необходимости объединяют с концентратом экстракта из мицелия и экстрагируют с помощью пригодного, не смешивающегося с водой органического растворителя, например с помощью н-бутанола или этилацетата. Отделенную затем органическую фазу в случае необходимости концентрируют в вакууме и растворяют в 1/30 первоначального объема смеси воды и метанола.

Дальнейшую очистку одного или нескольких предлагаемых согласно изобретению циклипостинов осуществляют путем хроматографии на пригодных материалах, предпочтительно, например, на молекулярных ситах, на обычных неподвижных фазах, как, например, силикагель, оксид алюминия, на ионообменниках или на адсорбирующих смолах, соответственно, на обращенных фазах (RP). С помощью этих хроматографических способов циклипостины разделяют. Хроматографию циклипостинов осуществляют с помощью органических растворителей или смесей водных и органических растворов.

Под смесями водных или органических растворов понимают все смешивающиеся с водой органические растворители, предпочтительно метанол, пропанол и ацетонитрил, в концентрации 10-100% растворителя, предпочтительно 60-90% растворителя, или также все забуференные водные растворы, которые смешиваются с органическими растворителями. Используемые буферы являются такими, как указанные выше.

Разделение циклипостинов на основании их различной полярности осуществляют с помощью хроматографии с обращенными фазами, например, на MCI^® (смола-адсорбент фирмы Mitsubishi, Япония) или Амберлит XAD^® (TOSOHAAS), на других гидрофобных материалах, как, например, на фазах RP-8 или RP-18. Кроме того, разделение можно осуществлять с помощью хроматографии на обычных неподвижных фазах, например, на силикагеле, оксиде алюминия и тому подобных.

Хроматографию циклипостинов осуществляют с помощью забуференных или подкисленных водных растворов или смесей водных растворов со спиртами или другими, смешивающимися с водой органическими растворителями. В качестве органического растворителя предпочтительно используют пропанол и ацетонитрил.

Под забуференными или подкисленными водными растворами понимают, например, воду, фосфатный буфер, ацетат аммония, цитратный буфер в концентрации от 1 мМ до 0,5 М, а также муравьиную кислоту, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту или все имеющиеся в продаже известные специалисту кислоты предпочтительно в концентрации 0,01-3%, в особенности 0,1%.

Хроматографируют с помощью градиента, который начинается со 100% водного буфера и заканчивается 100% растворителя, предпочтительно используют линейный градиент от 50% до 100% пропан-2-ола или ацетонтрила.

Альтернативно также можно осуществлять гель-хроматографию или хроматографию на гидрофобных фазах.

Гель-хроматографию осуществляют на полиакриламидных или сополимерных гелях, как, например, Biogel-Р 2^® (фирма Biorad), Fractogel TSK HW 40^® (фирма Merck, Германия, или Toso Haas, США) или на Sephadex^® (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция).

Последовательность вышеуказанных хроматографий может изменяться.

Дальнейшей очень эффективной стадией очистки циклипостинов является кристаллизация. Циклипостины кристаллизуют из растворов в органических растворителях и из смесей воды с органическими растворителями. Кристаллизацию осуществляют само по себе известным образом, например, путем концентрирования или охлаждения насыщенных растворов циклипостина.

Предлагаемые согласно изобретению циклипостины находятся в твердом или жидком состоянии и стабильны в растворах в области значений рН 4-8, в особенности 5-7, и тем самым их можно вводить в обычные галеновые композиции.

Изобретение относится далее также к химическим эквивалентам соединений формулы (I), которые обладают незначительным химическим отличием, следовательно, обладают такой же эффективностью или в мягких условиях могут превращаться в предлагаемое согласно изобретению соединение. К указанным эквивалентам относятся, например, сложные и простые эфиры, а также продукты окисления, восстановления и гидрирования предлагаемых согласно изобретению соединений.

Сложные и простые эфиры в качестве производных, продукты окисления, гидрирования, а также восстановления можно получать описанными в литературе способами, как, например, в «Advanced Organic Synthesis», четвертое издание, J. March, John Wiley and Sons, 1992.

Настоящее изобретение относится ко всем стереоизомерным формам соединений формул (I)-(XV A). Все асимметрические центры, содержащиеся в соединениях формул (I)-(XV A), независимо друг от друга могут иметь S-конфигурацию или R-конфигурацию. К изобретению относятся все возможные энантиомеры и диастереомеры, а также смеси двух или более стереоизомерных форм, например смеси энантиомеров и/или диастереомеров в любых соотношениях. Объектом изобретения являются, следовательно, энантиомеры в форме чистых энантиомеров как в виде левовращающих, так и в виде правовращающих антиподов R- и S-конфигураций, в форме рацематов и в форме смесей обоих энантиомеров в любых соотношениях. В случае наличия цис/транс-изомерии объектом изобретения являются как цис-форма, так и транс-форма и смеси этих форм в любых соотношениях.

Благодаря своим ценным фармакологическим свойствам предлагаемые согласно изобретению соединения пригодны для применения в качестве лекарственных средств в медицине человека и/или животного. Они ингибируют липазы и обладают благоприятными свойствами для лечения болезней обмена веществ, причиной которых является нарушение липидного обмена. Предлагаемые согласно изобретению соединения общей формулы (I) обладают неожиданным ингибирующим воздействием на гормончувствительную липазу, HSL, аллостерический фермент в адипоцитах, который ингибируется инсулином и является ответственным за расщепление жиров в жировых клетках и тем самым за переведение жировых компонентов в кровяное русло. Ингибирование этого фермента соответствует, следовательно, инсулиноподобному действию предлагаемых согласно изобретению соединений, которое в конечном счете приводит к уменьшению количества свободных жирных кислот в крови и сахара крови. Следовательно, их можно использовать при отклонении от нормы обмена веществ, как, например, в случае инсулиннезависимого сахарного диабета, при диабетическом синдроме и в случае прямого повреждения поджелудочной железы.

Изобретение относится, таким образом, к фармацевтическим композициям, которые содержат один или несколько предлагаемых согласно изобретению циклипостинов и/или их эквивалентов. Предпочтительным является применение в смеси с пригодными вспомогательными веществами или носителями. В качестве носителя в случае человека можно использовать все фармакологически приемлемые носители и/или вспомогательные вещества.

Изобретение относится далее к способу получения предлагаемого согласно изобретению лекарственного средства, отличающемуся тем, что по меньшей мере одно из предлагаемых согласно изобретению соединений вместе с фармацевтически пригодным и физиологически приемлемым носителем и в случае необходимости другими пригодными биологически активными веществами, добавками или вспомогательными веществами доводят до пригодной формы применения.

Предлагаемые согласно изобретению лекарственные средства вводят в общем перорально, локально или парентерально, однако также в принципе возможно ректальное применение.

Пригодными твердыми или жидкими галеновыми формами композиций являются, например, грануляты, порошки, таблетки, драже, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, аэрозоли, капли или растворы для инъекций в ампульной форме, а также препараты с пролонгированным высвобождением биологически активного вещества, при получении которых находят применение обычно носители и добавки и/или вспомогательные средства, как порофоры, связующие, средства для покрытия, средства для набухания, придающие скользкость (таблеткам) вещества или смазки, вкусовые вещества, подслащивающие вещества или способствующие растворению вещества. В качестве часто применяемых носителей или вспомогательных веществ следует назвать, например, карбонат магния, диоксид титана, лактозу, маннит и другие сахара, тальк, молочный белок, желатин, крахмал, витамины, целлюлозу и ее производные, животные или растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители, как, например, стерильная вода, спирты, глицерин и многоатомные спирты.

В случае необходимости разовые дозы для орального введения можно микроинкапсулировать для замедления или продления времени высвобождения, как, например, путем покрытия или введения биологически активного вещества в форме частиц в пригодные полимеры, воски или тому подобное.

Фармацевтические препараты предпочтительно приготовляют и вводят в виде разовых доз, причем каждая разовая доза содержит в качестве активного компонента определенное количество одного или нескольких циклипостинов согласно изобретению и/или их химических производных. В случае твердых разовых доз, как таблетки, капсулы и суппозитории, это количество может составлять вплоть до примерно 200 мг, предпочтительно, однако, примерно 0,1-100 мг, и в случае растворов для инъекций в ампульной форме вплоть до примерно 200 мг, предпочтительно, однако, примерно 0,1-100 мг, в сутки.

Вводимая суточная доза зависит от массы тела, возраста, пола и состояния пациента. Смотря по обстоятельствам, однако, также можно вводить более высокие или более низкие суточные дозы. Введение суточной дозы можно осуществлять путем одноразового введения в форме единичной разовой дозы или в виде нескольких меньших разовых доз, а также путем многократного введения разделенных доз в определенные интервалы времени.

Изобретение относится также к фармацевтическим композициям, которые содержат один или несколько предлагаемых согласно изобретению циклипостинов и/или их химических производных. Предпочтительным является применение в смеси с пригодными вспомогательными веществами или носителями. В качестве носителя в случае человека можно использовать все фармакологически приемлемые носители и/или вспомогательные вещества.

Действие предлагаемых согласно изобретению соединений формулы (I) тестировали согласно следующей ферментной тест-системе:

Получение фермента:

Получение частично очищенной HSL:

Изолированные жировые клетки крыс получают из жировой ткани придатка яичка необработанных самцов крыс (Wistar, 220-250 г) путем обработки коллагеназой согласно опубликованным способам (например, S. Nilsson и др., Anal. Biochem., 158, 399-407 (1986); G. Fredrikson и др., J. Biol. Chem., 256, 6311-6320 (1981); H. Tornquist и др., J. Biol. Chem., 251, 813-819 (1976)). Жировые клетки из 10 крыс промывают трижды путем флотации с помощью каждый раз 50 мл буфера для гомогенизации (25 мл Трис/HCl, рН=7,4; 0,25 М сахарозы; 1 мМ ЭДТУ, 1 мМ дитиотреитола, 10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл антипаина, 20 мкг/мл пепстатина) и, наконец, обрабатывают 10 мл буфера для гомогенизации. Жировые клетки гомогенизируют в тефлоновых стаканах в гомогенизаторе (Braun-Melsungen) путем 10 ходов при скорости 1500 оборотов в минуту и при температуре 15°С. Гомогенизат центрифугируют (пробирки Sorvall SM 24, 5000 оборотов в минуту, 10 минут, 4°С). Отбирают супернатант, находящийся между вышерасположенным жировым слоем и осадком после центрифугирования, и повторяют центрифугирование. Полученный из него супернатант снова центрифугируют (пробирки Sorvall SM 24, 20000 оборотов в минуту, 45 минут, 4°С). Отбирают супернатант и смешивают с 1 г гепаринсефарозы (Pharmacia-Biotech, CL-6B, промытая 5 раз с помощью 25 мМ Трис/HCl, рН=7,4; 150 мМ NaCl). После инкубации в течение 60 минут при температуре 4°С (в интервалы 15 минут встряхивают) смесь центрифугируют (пробирки Sorvall SM 24, 3000 оборотов в минуту, 10 минут, 4°С). Супернатант доводят до рН=5,2 путем добавления ледяной уксусной кислоты и инкубируют в течение 30 минут при температуре 4°С. Осадки, полученные путем центрифугирования (Sorvall SS34, 12000 оборотов в минуту, 10 минут, 4°С), собирают и суспендируют в 2,5 мл 20 мМ Трис/HCl, рН=7,0; 1 мМ ЭДТУ, 65 мМ NaCl, 13% сахарозы, 1 мМ дитиотреитола, 10 мкг/мл лейпептина/пепстатина/антипаина. Суспензию диализуют в течение ночи при температуре 4°С против 25 мМ Трис/HCl, рН=7,4; 50% глицерина, 1 мМ дитиотреитола, 10 мкг/мл лейпептина, пепстатина, антипаина, и затем вносят в колонку с гидроксиапатитом (0,1 г на 1 мл суспензии, уравновешенную с помощью 10 мМ фосфата калия, рН=7,0; 30% глицерина, 1 мМ дитиотреитола). Колонку промывают с помощью четырех объемов буфера для уравновешивания при скорости потока 20-30 мл/час. HSL элюируют с помощью одного объема буфера для уравновешивания, который содержит 0,5 М фосфата калия, затем диализуют (см. выше) и концентрируют в 5-10 раз путем ультрафильтрации (фильтр Amicon Diaflo PM 10) при температуре 4°С. Частично очищенную HSL можно хранить 4-6 недель при температуре -70°С.

Анализ:

Для приготовления субстрата смешивают 25-50 мкКи [³H]-триолеоилглицерина (в толуоле), 6,8 мкмоль немеченого триолеоилглицерина и 0,6 мг фосфолипидов (фосфатидилхолин/фосфатидилинозитол в соотношении 3:1 масса/объем), высушивают в атмосфере азота и затем растворяют в 2 мл 0,1 М КР_i (рН=7,0) путем обработки ультразвуком (Branson 250, микропиковая нагрузка, регулировка 1-2, 2×1 мин с 1-минутным интервалом). После добавления 1 мл KP_i и новой обработки ультразвуком (4×30 сек на льду с интервалами 30 сек) вводят 1 мл 20%-ного бычьего сывороточного альбумина (в KP_i) (конечная концентрация триолеоилглицерина составляет 1,7 мМ). Для реакции 100 мкл раствора субстрата пипеткой добавляют к 100 мкл раствора HSL (HSL получают как описано выше, разбавляют в 20 мМ КР_i, рН=7,0; 1 мМ ЭДТУ, 1 мМ дитиотреитола, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 20 мкг/мл пепстатина, 10 мкг/мл лейпептина) и инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С. После добавления 3,25 мл смеси метанола, хлороформа и гептана (10:9:7) и 1,05 мл раствора 0,1 М К₂СО₃, 0,1 М борной кислоты (рН=10,5) хорошо перемешивают и, наконец, центрифугируют (800 g, 20 минут). После разделения фаз отбирают один эквивалент верхней фазы (1 мл) и определяют радиоактивн