Штамм бактерий lactobacillus helveticus lbk-16 h, используемый для получения пробиотика, бактериальный пробиотический препарат и пищевой продукт

Штамм бактерий lactobacillus helveticus lbk-16 h, используемый для получения пробиотика, бактериальный пробиотический препарат и пищевой продукт

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение касается нового микроорганизма и его применения. Более точно, описан новый штамм Lactobacillus helveticus, его физиологические характеристики и применение, например, в пищевой промышленности и фармацевтической промышленности.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В Berqey's Manual of Systematic Bacteriology, vol.2, ed. by Sneath et al., Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, Part 14, p.1208 (см. далее) под заголовком "Regular, Nonsporing Gram-Positive Rods" описаны характеристики и классификация микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus. а также свойства вида Lactobacillus helveticus. Как правило, штаммы Lactobacillus helveticus выделяют из молочных продуктов, таких как ферментированные молочные продукты и сыры, и обычно их применяют в качестве заквасочных микроорганизмов в производстве сыров, в частности, сыров типа Emmental и

В прототипах описаны также биологические эффекты штаммов Lactobacillus helveticus. Например, в международной патентной заявке WO 99/16862, Yamamoto et. al, описан штамм Lactobacillus helveticus CM4, FERM ВР-6060, который способен продуцировать большое количество трипептида Val-Pro-Pro и/или Ile-Pro-Pro и имеет высокую внеклеточную протеазную активность. В данной публикации описаны также ферментированные молочные продукты, содержащие указанные выше трипептиды и бактерии, и способ их получения при помощи ферментирующих продуктов, содержащих трипептидные последовательности с указанной бактерией.

В патенте США 5449661, Nakamura и др., описано получение пептида, содержащего трипептидную последовательность Val-Pro-Pro, и его применение для снижения гипертензии. Данный пептид получают ферментацией обезжиренного молока штаммом Lactobacillus helvetlcus JCM 1004, после чего пептид очищают хроматографически и сушат вымораживанием.

Yamamoto и др. описывают также очистку и характеристики протеиназы, происходящей из микроорганизма Lactobacillus helveticus CP790 (J.Biochem., 1993, 114:740). Кроме того, Yamamoto и др. сообщают об исследовании, в котором α_s1- и β-казеик гидролизуют при помощи указанной протеиназы и полученные пептиды исследуют на их ингибирующее действие на АСЕ (J.Dairy Sci., 1994, 77:917). Всего исследовано 25 пептидов, и их молекулярные размеры и эффекты сильно различаются. Наиболее эффективны три пептида, полученные из β-казеина и содержащие 8, 18 и 27 аминокислот соответственно. Данное исследование также сравнивает АСЕ-активность молока, ферментированного при помощи штамма Lactobacillus helveticus CP790 и его варианта СР 791 с дефектной протеиназной активностью, при этом обнаружено, что микроорганизм эффективен у спонтанно гипертензивных крыс SHR, но не эффективен у штамма обычных крыс, тогда как последний вообще не имеет активности.

Хотя молочнокислые бактерии, а также виды Lactobacillus helveticus широко изучены и рекомендованы к применению в качестве обычной закваски и веществ, способствующих здоровью, все еще проводится постоянный поиск новых эффективных микроорганизмов, которые полезны и как закваски, и как вещества для симбиоза в молочном и других пищевых производствах, а также как природные продукты и в фармацевтической промышленности.

Описание изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение нового штамма Lactobacillus helveticus, обладающего хорошими протеолитическими и физиологическими свойствами и, следовательно, подходящего для применения в качестве закваски и вещества, способствующего здоровью.

В соответствии с настоящим изобретением представлен штамм с широкими возможностями для применения как такового или в производстве годных в пищу продуктов, функциональных продуктов или фармацевтических препаратов.

Таким образом, настоящее изобретение касается Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137.

Настоящее изобретение касается также бактериального препарата, который содержит штамм Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137.

Кроме того, настоящее изобретение касается применения штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 в пищевой или фармацевтической промышленности.

Настоящее изобретение касается также годных в пищу продуктов, таких как пищевые продукты и фармацевтические препараты, которые содержат указанный выше штамм или получены с его использованием.

Данное изобретение касается также штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 для применения в качестве терапевтического вещества.

Данное изобретение касается также штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 для применения при лечении гипертензии.

Данное изобретение касается также применения штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 для получения гипотензивных продуктов.

Кроме того, данное изобретение касается способа получения гипотензивного продукта, причем в данном способе используют штамм Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137.

Данное изобретение основано на новом штамме Lactobacillus helveticus LBK-16 H, который 3 ноября 1999 депонирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkult-uren GmbH (DSMZ) под входящим номером DSM 13137 и который обладает следующими свойствами:

Штамм Lactobacillus helveticus, который является грамположительным и имеет длинные клетки в форме палочек. Диапазон температур роста составляет примерно от 35 до 45°С, оптимальная температура составляет примерно от 37 до 42°С.

Lactobacillus helveticus LBK-16 Н хорошо растет в молоке при температуре от 37 до 42°С, продуцируя 2,5-2,9% молочной кислоты (DL). Оптимальный для роста рН составляет примерно от 4,5 до 7. При культивировании без рН-регулировки рН в молоке снижается до диапазона 3,3-3,6.

Данный штамм хорошо растет в среде, обычно используемой для Lactiobacilli, в качестве источника углерода можно также применять цитрат.

Lactobacillus helveticus LBK-16 H ферментирует углеводы следующим образом:

Углевод L	helveticus LBK-16 H
Глицерин	-
Эритрит	-
D-арабиноза	-
L-арабиноза	-
Рибоза	-
D-ксилоза	-
L-ксилоза	-
Адонит	-
β-Метилксилозид	-
Галактоза	+
D-глюкоза	+
D-фруктоза	+
D-манноза	+
L-сорбоза	-
Рамноза	-
Дульцит	-
Инозит	-
Маннит	-
Сорбит	-
α-Метил-D-маннозид	-
α-Метил-D-глюкозид	-
N-ацетилглюкозамин	+
Эскулининозит	-
Целлобиоза	-
Мальтоза	-
Лактоза	+
Сахароза	-
Трегалоза	-
Инулин	-
Мелезитоза	-
D-рафиноза	-
Гликоген	-
Ксилит	-

Lactobacillus helveticus LBK-16 Н является протеолитически активным. Протеолитическая активность данного штамма, определенная способом ОРА, описанным ниже в примерах и основанном на протеолизе ортофталдиальдегида, составляет величину порядка 0,3-0,6. Протеолитическую активность можно использовать так, как используют закваску, и для получения биологически активных веществ.

Lactobacillus helveticus LBK-16 Н очень хорошо переносит низкие значения рН. Это важное свойство с точки зрения сохранности и физиологической активности. Как описано в примерах, данный штамм очень хорошо переносит рН на уровне 4 и даже 3 в течение четырех часов и обладает хорошей сохранностью, особенно в молочных продуктах, до 4 часов при рН 2. На основании данных результатов можно предположить, что данный штамм выживает в пищеварительном тракте после желудка и остается жизнеспособным в толстой кишке.

Lactobacillus helveticus LBK-16 H демонстрирует также хорошую переносимость желчи, он выдерживает концентрации желчи до 0,5%. Такой результат также указывает, что данный штамм выживает в пищеварительном тракте, пройдя через желудок и тонкую кишку, и остается жизнеспособным в толстой кишке.

Было доказано, что Lactobacillus helveticus LBK-16 H обладает способностью продуцировать оксид азота. Продуцирование оксида азота исследовано как образование оксида азота, обеспеченное активацией оксид азота-синтетазы. В клеточной линии макрофагов J774 данный штамм продуцирует 0,4 мкМ NO, а в клеточной линии энтероцитов человека Т84 примерно от 2 до 6 мкМ NO. Данное свойство очень существенно: активация продуцирования NO в подходящем количестве полезна, например, при воспалительной реакции и регуляции кровяного давления.

Обнаружено также, что Lactobacillus helveticus LBK-16 H обладает способностью продуцировать биологически активные пептиды. В примерах аинской патентной заявки 992360 описано, как двухстадийным способом получают хорошо хранящийся продукт, содержащий гипотензивные пептиды, на первой стадии получают указанные выше биологически активные пептиды ферментацией, например, различных молочных продуктов при помощи Lactobacillus helveticus LBK-16 Н, самого по себе или в комбинации указанного штамма с другими штаммами молочнокислых бактерий. Согласно примерам данной публикации Lactobacillus helveticus LBK-16 H продуцирует известные гипотензивные трипептиды VPP (Val-Pro-Pro) и IPP (Ile-Pro-Pro) 13-15 мг/л и 6-8 мг/л, соответственно. В публикации утверждается, что в ферментативной реакции получают смесь различных пептидов. Если продолжительность ферментации достаточна, получают относительно небольшие ди- и трипептиды.

На основе описанных выше свойств Lactobacillus helveticus LBK-16 Н можно считать организмами для симбиоза.

Lactobacillus helveticus LBK-16 Н полезен, например, как обычная бактерия для закваски в молочной промышленности, например, в производстве ферментированных молочных продуктов и сыров. Предпочтительным вариантом считают применение в производстве сыров, в частности сыра Эмменталь.

Lactobacillus helveticus LBK-16 Н можно также очень хорошо использовать в производстве специальных продуктов, таких как ферментированные молочные продукты, в частности кислое молоко и йогурт, содержащие биологически активные пептиды.

Lactobacillus helveticus LBK-16 H можно также применять в качестве функциональных веществ, например, в производстве годных в пищу веществ или как ингредиент или добавку в веществах, годных в пищу.

Lactobacillus helveticus LBK-16 H получают культивированием бактерии, например, в MRS-бульоне, молоке, таком как сырое молоко, восстановленное порошковое молоко или молоко, обработанное ультразвуком, или в питательной среде, такой как Rogosa или MRS, обычно используемой для Lactobacilli, по обычным методикам. Выбор подходящих условий культивирования и других параметров, таких как температура, рН и аэрация, очевиден для специалиста в данной области. Температура, например, может составлять от 30 до 45°С. Может потребоваться регулировка рН.

Lactobacillus helveticus LBK-16 Н может сам по себе быть культивирован с получением чистой культуры. Данный штамм можно также культивировать в виде смешанной культуры, например, вместе с другими заквасочными микроорганизмами, известными в данной области. Если требуется, можно также получить смешанную культуру путем отдельного культивирования микроорганизмов различных типов и последующего объединения разных микроорганизмов в требуемых пропорциях. Комбинации микроорганизмов выбирают подходящим образом так, чтобы обеспечить наилучшие возможные свойства конечного продукта и снизить риск загрязнения.

После культивирования клеточную суспензию извлекают и используют, как таковую или обработанную определенным образом, например, в концентрированном, высушенном или лиофилизованном виде.

Естественно Lactobacillus helveticus LBK-16 Н можно также применять как чистую культуру или смешанную культуру, отдельно или, например, с обычно используемыми и коммерчески доступными заквасками или веществами для симбиоза.

Согласно данному изобретению предпочтительным считают бактериальный препарат, который лиофилизован и содержит Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 в подходящем адъюванте.

Бактериальный препарат данного изобретения может содержать указанную выше бактерию, саму по себе или объединенную с другими компонентами, такими как другие микроорганизмы.

Согласно настоящему изобретению данный штамм можно также применять в производстве годных в пищу продуктов, в частности, (функциональных) пищевых продуктов, природных продуктов или фармацевтических препаратов.

Годные в пищу продукты данного изобретения получают, используя Lactobaclllus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 или содержащий его бактериальный продукт и обычные ингредиенты для (конечных) продуктов. Бактерию можно добавлять к пищевому или другому продукту в процессе его производства или к конечному продукту. В связи с производством данного продукта бактерию можно также использовать таким образом, что в конечном продукте не остается бактериальных клеток, а только продукты, полученные во время бактериального роста, вкусовые и ароматические вещества или вещества с биологической активностью.

В настоящем документе термин «пищевой продукт» используют в широком смысле, охватывая все годные в пищу продукты, которые могут быть в твердом, желеобразном или жидком виде, включая продукты, готовые к употреблению, и продукты, к которым при употреблении добавляют продукт данного изобретения как добавку или составляющий компонент указанного продукта. Например, пищевые продукты могут быть продуктами молочной промышленности, мясоперерабатывающей промышленности, пищевой перерабатывающей промышленности, производства напитков, пекарной промышленности и кондитерской промышленности. Типичные продукты включают молочные продукты, такие как обезжиренное молоко, молоко с различным естественным содержанием жира, или в виде соответствующего порошкового молока, и ферментированные молочные продукты, такие как кислое молоко, пахта, творог, йогурт, свернувшееся молоко, незрелые сыры и зрелые сыры, заправка для закусок и т.д. Другую важную группу составляют напитки, такие как напитки на основе сыворотки, фруктовые напитки и пиво.

Относящиеся к настоящему изобретению продукты фармацевтической промышленности включают помимо различных фармацевтических препаратов также натуральные продукты, способствующие здоровью, и другие. Типичными формами таких препаратов являются, например, капсулы, таблетки и растворы.

Согласно данному изобретению Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 применяют в количестве, достаточном для обеспечения желательного эффекта. Таким образом, используемое количество может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от применения и эффекта.

Далее изобретение будет описано более подробно при помощи примеров. Данные примеры предназначены только для иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают его объем.

Пример 1

Культивирование штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 H

Штамм Lactobacillus helveticus LBK-16 H культивируют, дважды производя посев штамма данного вида в MRS- или молочный бульон с использованием 1% инокулята, при температуре 37°С в течение 20-24 часов. Фактическое (производительное) культивирование также проводят в бульоне на основе MSR или молока при температуре культивации от 35 до 42°С, выращивая штамм в течение 20-48 часов (с или без регулировки рН).

Клетки можно извлечь из культивирования как таковые или их можно концентрировать, применяя известные методики, и использовать как клеточный концентрат или после концентрирования их можно высушить вымораживанием до порошкообразного продукта.

Пример 2

Протеолитическая активность штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 H

Протеолитическую активность штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 H определяют из молока при помощи способа ОРА (Church F.C., Swaisgood Н.Е., Porter D.H., Catigna G.L, 1983, Spectrophotometric assay using o-Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins, J Dairy Sci 66: 1219-1227).

Для выполнения данного способа бактериальные клетки культивируют в MRS-бульоне в пробирке на 10 мл, после чего суспензию промывают 0,9% NaCl и суспендируют в 10 мл. Бактериальные клетки высевают в виде 1% инокулята в 10 мл 22% молока. В качестве контроля используют соответствующий образец молока без бактериального инокулята.

2,5 мл данного образца, 0,5 мл воды и 0,5 мл 0,75 н. трихлоруксусной кислоты (ТСА) тщательно смешивают в устройстве Vortex, оставляют- на 10 минут и фильтруют через фильтровальную бумагу Whatman #2. Отбирают из ТСА-фильтрата образец объемом 150 мкл и смешивают с 3 мл реагента ОРА в свободной кювете. Смесь инкубируют 2 минуты при комнатной температуре, после чего проводят измерения на спектрофотометре при длине волны 340 нм. Из показания вычитают контрольное значение, при этом протеолитическая активность Lactobacillus helveticus LBK-16 H составляет 0,3-0,6.

Реагент ОРА:

25 мл 100 мМ метабората натрия

2,5 мл 20% (масс./масс.) SDS

40 мг ОРА (ортафталдиальдегид), растворенного в 1 мл метанола

100 мкл β-меркаптоэтанола

Вещества объединяют и растворяют в воде, чтобы конечный объем составлял 50 мл. Реагент сохраняется один день при хранение в темноте.

Пример 3

рН-Толерантность Lactobacillus helveticus LBK-16 H

Перед исследованием LBK-16 H дважды культивируют в течение 17-18 часов в MRS-бульоне. После этого штамм культивируют в течение исследования либо в MRS-бульоне, либо в молочном бульоне. В рН-исследовании рН тестируемого бульона (MRS) доводят до рН 6,5, рН 4 и рН 2 (молочной кислотой). Данные бульоны засевают культурами в MRS- или молочном бульоне таким образом, что начальная концентрация составляет 10⁷ колониеобразующих единиц/мл, и культивируют в течение 3 и 4 часов при 37°С, после чего определяют концентрацию штамма LBK-16 Н из культур (способом определения Lackobacilli на MRS-агаре). Результаты представлены в таблице 1.

Таким образом, данный штамм очень хорошо переносит уровень рН 4 и даже 3 в течение четырех часов. Сохранность данного штамма при рН на уровне 2/4 час. лучше, если его употреблять в молочном продукте, чем в водном продукте.

Пример 4

Толерантность штамма Lactobacillus helveticus LBK-16 Н к желчи

LBK-16 H культивируют как в примере 3, Исследование выполняют в MRS-бульоне, к которому добавляют желчную кислоту. Bile Bovine, Sigma B-3883 в количестве 0,3% и 0,5%. К бульону, содержащему желчь, добавляют 1% свежей культуры из культивирования на основе MRS или молока, начальная концентрация составляет 2-5×10⁶ колониеобразующих единиц/мл. Штамм культивируют в бульоне в течение 3 часов, после чего определяют концентрацию клеток на MRS-агаре. Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, LBK-16 Н выдерживает концентрации желчи до 0,5%.

Пример 5

Продуцирование оксида азота штаммом Lactobacillus helveticus LBK-16 H

Продуцирование оксида азота штаммом Lactobacillus helveticus LBK-16 H исследуют, используя способ, описанный Korhonen et al. (Induction of nitric oxide synthesis by probiotic Lactobacillus GG in J774 macrophages and T84 colon epithelial cells, Korhonen R., Korpela R., Saxelin M., Kankaanranta H. and Moilanen E., подана). Способ основан на индукции индуцируемой оксид азота-синтетазы (iNOS) и производстве в результате этого оксида азота (NO). В исследовании используют две различные клеточные линии: клеточную линию мышиных макрофагов J774 и клеточную линию энтероцитов человека T84. Индукцию осуществляют в клеточной линии J774 при помощи клеток Lactobacillus helveticus LBK-16 H в присутствии γ-интерферона, так как сами бактериальные клетки не продуцируют NO. Соотношение клеток клеточкой линии и бактериального штамма составляет 1:10.

Экспрессию фермента iNOS определяют методом вестерн-блоттинга, используя для сравнения липополисахарид (LPS) и липотеикоевую кислоту (LA).

Продуцирование оксида азота (NO) определяют как количество нитрита, метаболита оксида азота, в питательной среде через 24 часа инкубации. Количество нитрита определяют по реакции Грисса (Green et al., 1988, Analytical Biochemistry, vol.126, p.131-138).

Lactobacillus helveticus LBK-16 H способен продуцировать 0,4 мкМ оксида азота в клеточной линии мышиных макрофагов и 5-6 мкМ оксида азота в эпителиальной клеточной линии человека. Для сравнения можно упомянуть, что Lactobacillus rhamnosus LC 705, DSM 7061 продуцирует только 0,7 мкМ оксида азота в клетках T84.

Пример 6

Продуцирование биологически активных пептидов штаммом Lactobacillus helveticus LBK-16 H

Штамм Lactobacillus helveticus LBK-16 H культивируют в MRS-бульоне при 37°С в течение 24 часов и высевают в восстановленное молоко (10%) для получения инокулята. После двух циклов культивирования инокулят (15%) высевают в ферментационную среду, которая состоит из 9-10% обезжиренного порошкового молока и стерилизована при 110°С в течение 10 мин. Ферментацию проводят при 37°С в течение 22-24 часов, все время энергично перемешивая.

Для выполнения сравнительного исследования повторяют ферментацию, используя (а) смесь нескольких штаммов, а именно L. helveticus LB161, L. helveticus LBK-16 H и L. helveticus LB230, (b) смесь штаммов L. helveticus LBK-16 H и L.rhainnosus LC705, DSM 7061 и (с) смесь штаммов L.helveticus LBK-16 Н и Streptococcus thermophilus T101, DSM 4022.

Используемая питательная среда представляет собой 9%-ное молоко, стерилизованное при 100°С в течение 15 мин. Для получения инокулята штаммы L.helveticus и L.rhamnosus LC705 культивируют в течение 24 часов при 37°С в MRS-бульоне, откуда 1%-ный инокулят переносят в молоко. Str. thermophilus T101 культивируют в течение 18 часов при 37°С в LM17-бульоне, откуда 1%-ный инокулят переносят в молоко.

Первое культивирование проводят, культивируя все штаммы отдельно в молоке, инкубация при 37°С в течение 24 часов. Для второго культивирования 1% штамма каждой смеси пипетируют в молоко, после чего продолжают совместное культивирование в течение 24 часов при 37°С. Для третьего культивирования 5-10% полученной выше совместно культивированной смеси пипетируют в молоко и инкубируют при 37°С в течение 24 часов.

Количества VPP и IPP, продуцируемые штаммом L.helveticus LBK-16 Н и различными микробными смесями, показаны в таблице 3. Lactobacillus helveticus LBK-16 H данного изобретения способен продуцировать большие количества биологически активных пептидов. Другие микроорганизмы в виде различных смесей не продуцируют биологически активные пептиды, но также влияют на активность LBK-16 Н. Между смесями и самим штаммом LBK-16 Н не наблюдается никаких различий.

Таблица 3Количества IPP и VPP, продуцируемые штаммом LBK-16 Н и различными микробными смесями
Микроорганизм (смесь)	VPP, мг/л	IPP, мг/л
L161+LBK16H+LB230, 5%	13-14	6-7
L161+LBK16H+LB230, 10%	13-14	6-7
LBK16H+LC705, 5%	13-14	6-7
LBK16H+LC705, 10%	13-14	6-7
LBK16H+Str.T101, 10%	13-15	6-8
LBK16H (один)	13-15	6-8

1. Штамм бактерий Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137, используемый для получения пробиотика.

2. Штамм по п.1, отличающийся тем, что он используется в пищевой промышленности.

3. Штамм по п.2, отличающийся тем, что используется для получения продукта молочной промышленности или для производства напитков.

4. Штамм по п.1, отличающийся тем, что он используется при лечении гипертензии.

5. Штамм по п.1, отличающийся тем, что он используется при получении антигипертензивных продуктов.

6. Штамм по п.5, отличающийся тем, что антигипертензивный продукт содержит антигипертензивные ди- и трипептиды.

7. Штамм по п.6, отличающийся тем, что антигипертензивный продукт содержит антигипертензивные трипептиды, в частности Ile-Pro-Pro и/или Val-Pro-Pro.

8. Бактериальный пробиотический препарат, содержащий штамм Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 по п.1 формулы изобретения.

9. Бактериальный пробиотический препарат по п.8, отличающийся тем, что он дополнительно содержит другие микроорганизмы.

10. Бактериальный пробиотический препарат по п.8 или 9, отличающийся тем, что он находится в виде лиофилизованного порошка или капсулы.

11. Пищевой продукт, характеризующийся содержанием в нем штамма по п.1 или бактериального препарата по любому из пп.8-10 или полученный с их применением.

12. Пищевой продукт по п.11, отличающийся тем, что он является молочным продуктом.

13. Пищевой продукт по п.11, отличающийся тем, что он является напитком, предпочтительно напитком на основе сыворотки, фруктовым напитком или пивом.