Производные пиперидина и способ их получения

Производные пиперидина и способ их получения

Реферат

Изобретение относится к органическим соединениям, их получению и применению в качестве фармацевтических агентов.

Одним из объектов изобретения являются соединения формулы

в свободной форме или в форме соли, где

Ar¹ обозначает фенил, замещенный одним или несколькими атомами галогена,

Ar² обозначает фенил или нафтил, который является незамещенным или замещен одним или несколькими заместителя, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, гидрокси, нитро, С₁-С₈алкил, С₁-С₈галоалкил, С₁-С₈алкокси или С₁-С₈алкоксикарбонил,

R¹ обозначает водород или С₁-С₈алкил, необязательно замещенный гидрокси-, С₁-С₈алкокси-, ацилоксигруппой, -N(R²)R³, галогеном, карбоксигруппой, C₁-C₈алкоксикарбонилом, -CON(R⁴)R⁵ или одновалентной циклической органической группой,

R² и R³ каждый независимо друг от друга обозначает водород или С₁-С₈алкил, или R² обозначает водород и R³ обозначает ацил или - SO₂R⁶, или R² и R³ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членную гетероциклическую группу,

R⁴ и R⁵ каждый независимо друг от друга обозначает водород или С₁-С₈алкил, или R⁴ и R⁵ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членную гетероциклическую группу,

R⁶ обозначает С₁-С₈алкил, С₁-С₈галоалкил или фенил, необязательно замещенный C₁-C₈-алкилом, и

n обозначает 1, 2, 3 или 4,

при условии, что когда Ar¹ обозначает пара-хпорфенил и R¹ обозначает водород, то Ar² не обозначает фенил или пара-нитрофенил.

Понятия, которые применяют в настоящем описании, имеют следующие значения:

"С₁-С₈алкил" в контексте настоящего описания обозначает С₁-С₈алкил с прямой или разветвленной цепью, который может представлять собой, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил с прямой или разветвленной цепью, гексил с прямой или разветвленной цепью, гептил с прямой или разветвленной цепью или октил с прямой или разветвленной цепью. Предпочтительно С₁-С₈алкил обозначает С₁-С₄алкил.

"С₁-С₈алкокси" в контексте настоящего описания обозначает C₁-С₈алкоксигруппу с прямой или разветвленной цепью, которая может обозначать, например, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентокси с прямой или разветвленной цепью, гексилокси с прямой или разветвленной цепью, гептилокси с прямой или разветвленной цепью или октилокси с прямой или разветвленной цепью. Предпочтительно С₁-С₈алкокси обозначает С₁-С₄алкокси.

"С₁-С₈галоалкил" в контексте настоящего описания обозначает С₁-С₈алкил, как он определен выше, замещенный одним или несколькими атомами галогена, предпочтительно одним, двумя или тремя атомами галогена.

"Ацил" в контексте настоящего описания обозначает алкилкарбонил, например С₁-С₈алкилкарбонил, где С₁-С₈алкил может представлять собой одну из указанных выше С₁-С₈алкильных групп, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена; циклоалкилкарбонил, например С₃-С₈циклоалкилкарбонил, где С₃-С₈циклоалкил может представлять собой, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил; 5- или 6-членный гетероциклилкарбонил, несущий в кольце один или два гетероатома, выбранных из группы, включающей азот, кислород и серу, такой как фурилкарбонил или пиридилкарбонил; арилкарбонил, например С₆-С₁₀арилкарбонил, такой как бензоил; или аралкилкарбонил, например С₆-С₁₀арил-С₁-С₄алкилкарбонил, такой как бензилкарбонил или фенилэтилкарбонил. Предпочтительно ацил обозначает С₁-С₄алкилкарбонил.

"Ацилокси" в контексте настоящего описания обозначает алкилкарбонилокси, например С₁-С₈алкилкарбонилокси, где С₁-С₈алкил может представлять собой одну из описанных выше С₁-С₈алкильных групп, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена; циклоалкилкарбонилокси, например С₃-С₈циклоалкилкарбонилокси, где С₃-С₈циклоалкил может обозначать, например, циклопропил, циклобутил, циклопетил, циклогексил, циклогептил или циклооктил; 5- или 6-членную гетероциклилкарбонилоксигруппу, несущую в кольце один или два гетероатома, выбранных из группы, включающей азот, кислород и серу, такую как фурилкарбонилокси или пиридилкарбонилокси; арилкарбонилокси, например С₆-С₁₀арилкарбонилоксигруппу, такую как бензоилокси; или аралкилкарбонилоксигруппу, например С₆-С₁₀арил-С₁-С₄алкилкарбонилоксигруппу, такую как бензилкарбонилокси или фенилэтилкарбонилокси. Предпочтительно ацилокси обозначает C₁-С₄алкилкарбонилокси.

"Галоген" в контексте настоящего описания обозначает фтор, хлор, бром или йод; предпочтительно фтор, хлор или бром.

В Ar¹ фенильная группа может быть замещена одним, двумя или тремя, предпочтительно одним или двумя атомами галогена, которые предпочтительно выбирают из атомов фтора и хлора. Когда в качестве заместителя присутствует один атом галогена, он предпочтительно находится в пара-положении относительно указанной карбонильной группы. Когда в качестве заместителей присутствуют два или три атома галогена, то предпочтительно один из них находится в пара-положении относительно указанной карбонильной группы и по меньшей мере один из остальных находится в орто-положении относительно указанной карбонильной группы.

Если Ar² обозначает замещенный фенил, то он может, например, быть замещен одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью, предпочтительно одним, двумя или тремя, указанными выше заместителями. Ar² может, например, обозначать монозамещенный фенил, заместителем которого предпочтительно является галоген, циано, нитро или С₁-С₄алкоксигруппа, который предпочтительно находится в орто- или мета-положении относительно указанной -СН=СН-группы. В другом варианте Ar² может обозначать, например, дизамещенный фенил, заместители которого предпочтительно выбирают из группы, включающей галоген, циано, гидрокси, нитро, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкил и С₁-С₄галоалкил, особенно предпочтительно заместителями являются два атома галогена (одинаковые или различные атомы галогена), две С₁-С₄алкоксигруппы, две С₁-С₄алкильные группы, две С₁-С₄галоалкильные группы, один галоген и одна цианогруппа, один галоген и одна С₁-С₄алкоксигруппа, один галоген и одна нитрогруппа, один галоген и одна гидроксигруппа, один галоген и один С₁-С₄ галоалкил, одна циано- и одна С₁-С₄алкоксигруппа, одна гидроксигруппа и один С₁-С₄алкил или одна гидрокси- и одна С₁-С₄алкоксигруппа. В другом варианте Ar² может обозначать, например, тризамещенный фенил, заместители которого предпочтительно выбирают из группы, включающей галоген, гидрокси, С₁-С₄алкокси и С₁-С₄алкоксикарбонил, особенно предпочтительно заместителями являются три атома галогена (одинаковые атомы или два или три различных атома галогена) или две С₁-С₄алкоксигруппы и один галоген, гидрокси или С₁-С₄алкоксикарбонил. Еще в одном варианте Ar² может обозначать, например, пентазамещенный фенил, заместителями которого предпочтительно являются атомы галогена, прежде всего фтор. Особенно предпочтительными группами Ar²являются цианфенил, прежде всего мета-цианфенил, и дизамещенный фенил, одним из заместителей которого является С₁-С₄алкоксигруппа, предпочтительно находящаяся в орто-положении относительно -СН=СН-группы, а вторым заместителем, расположенным предпочтительно в пара-положении относительно С₁-С₄алкоксигруппы, является С₁-С₄алкокси, галоген, циано или С₁-С₄алкил.

R¹, который обозначает необязательно замещенный С₁-С₈алкил, предпочтительно представляет собой необязательно замещенный С₁-С₄алкил, прежде всего С₁-С₄алкил или замещенный метил или этил. Когда R¹ замещен циклической органической группой, то последняя может обозначать карбоциклическую или гетероциклическую группу, например С₃-С₁₅карбоциклическую группу или 5-7-членную гетроциклическую группу, несущую один или несколько, предпочтительно один, два или три кольцевых гетероатома, выбранных из группы, включающей азот, кислород и серу. С₃-С₁₅карбоциклическая группа может, например, обозначать циклоалифатическую группу, имеющую 3-8 атомов углерода, предпочтительно С₅- или С₆циклоалкил, такой как циклопентил, метилциклопентил или циклогексил. В другом варианте С₃-С₁₅карбоциклическая группа может обозначать, например, С₁-С₈ароматическую группу, такую как фенил, который может быть незамещенный или замещен С₁-С₈алкилом, С₁-С₈алкоксигруппой, галогеном, цианогруппой, -CON(R⁴)R⁵, -SO₂N(R⁴)R⁵ или C₁-С₈алкилсульфониламиногрупой, где R⁴ и R⁵ имеют указанные выше значения. Гетероциклическая группа может нести в кольце один атом азота, кислорода или серы или может нести два атома азота или один атом кислорода и один или два атома азота, или один атом серы и один или два атома азота. Гетероциклическая группа предпочтительно представляет собой гетероциклическую ароматическую группу, прежде всего 5- или 6- членную гетероциклическую группу, такую как фурил, имидазолил, тиазолил или пиридил. В наиболее предпочтительных соединениях R¹ обозначает С₁-С₄алкил, замещенный гидроксигруппой, фенилом, или 5- или 6- членной гетероциклической ароматической группой, несущей один или два кольцевых гетероатома, выбранных из группы, включающей азот, кислород и серу.

Предпочтительными соединениями формулы I в свободной форме или в форме соли являются соединения, в которых

Ar¹ обозначает фенил, замещенный фтором или хлором в пара-положении относительно указанной карбонильной группы и необязательно дополнительно замещенный галогеном в орто-положении относительно указанной карбонильной группы,

Ar² обозначает фенил, монозамещенный заместителем, выбранным из ряда, включающего галоген, циано, нитро и С₁-С₄алкокси, фенил, замещенный двумя одинаковыми или различными заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкил, C₁-С₄галоалкил и нитро, или фенил, замещенный тремя одинаковыми или различными заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, гидрокси, С₁-С₄алкокси и С₁-С₄алкоксикарбонил,

R¹ обозначает водород, С₁-С₄алкил или С₁-С₄алкил, замещенный гидроксигрупой, С₃-С₈циклоалкилом, фенилом, фенилом, замещенным С₁-С₄алкилсульфониламиногруппой, или 5- или 6-членной гетероциклической ароматической группой, несущей один или несколько кольцевых гетероатомов, выбранных из ряда, включающего азот, кислород и серу, и

n обозначает 1 или 2.

Также предпочтительными соединениями формулы I в свободной форме или в форме соли являются соединения, в которых

Ar¹ обозначает фенил, замещенный фтором или хлором в пара-положении относительно указанной карбонильной группы,

Ar² обозначает фенил, замещенный в орто-положении относительно указанной -СН=СН-группы С₁-С₄алкоксигруппой и замещенный в пара-положении относительно С₁-С₄ алкоксигруппы цианогруппой, галогеном или С₁-С₄алкоксигруппой,

R¹ обозначает С₁-С₄алкил, замещенный гидроксигруппой, фенилом, фенилом, замещенным С₁-С₄алкилсульфониламиногруппой, или 5- или 6-членной гетероциклической ароматической группой, несущей один или два кольцевых гетероатома, выбранных из ряда, включающего азот, кислород и серу, и

n обозначает 1.

Соединения, представленные формулой, обладают способностью образовывать кислотно-аддитивные соли, прежде всего фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли. Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли соединения формулы включают соли неорганических кислот, например галогенводородных кислот, таких как фтористоводородная кислота, соляная кислота, бромистоводородная кислота или йодистоводородная кислота, азотной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты; и органических кислот, например алифатических монокарбоновых кислот, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота, алифатических гидроксикислот, таких как молочная кислота, лимонная кислота, винная кислота или яблочная кислота, дикарбоновых кислот, таких как малеиновая кислота или янтарная кислота, ароматических карбоновых кислот, таких как бензойная кислота, пара-хлорбензойная кислота, дифенилуксусная кислота или трифенилуксусная кислота, ароматических гидроксикислот, таких как орто-гидроксибензойная кислота, пара-гидроксибензойная кислота, 1-гидроксинафталин-2-карбоновая кислота или 3-гидроксинафталин-2-карбоновая кислота, и сульфоновых кислот, таких как метансульфоновая кислота или бензолсульфоновая кислота. Эти соли можно получать из соединений формулы с помощью известных процессов солеобразования.

Соединения формулы, которые содержат кислотные, например, карбоксильные группы, также могут образовывать соли с основаниями, прежде всего с фармацевтически приемлемыми основаниями, которые хорошо известны в данной области; такие соли могут включать соли металлов, прежде всего соли щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, например соли натрия, калия, магния или кальция, или соли аммиака или фармацевтически приемлемых органических аминов или гетероциклических оснований, таких как этаноламины, бензиламины или пиридины. Эти соли можно получать из соединений формулы I с помощью известных процессов солеобразования.

Когда R¹ имеет значение, отличное от водорода, атом углерода, к которому R¹ присоединен в формуле, является асимметричным, и в этом случае соединения существуют в виде индивидуальных оптически активных изомерных форм или их смесей, например в виде рацемических или диастереоизомерных смесей. Под объем изобретения подпадают как индивидуальные оптически активные R- и S-изомеры, так и их смеси, например рацемические или диастереоизомерные смеси.

Конкретными предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения, описанные в примерах, прежде всего в примерах 4, 9, 10, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 28, 29, 30, 37, 38, 40, 42, 43, 44 и 45.

Изобретение относится также к способу получения соединений формулы, предусматривающему

(I) (А) взаимодействие соединения формулы

с соединением формулы

или его образующим амид производным, где Ar¹, Ar², R¹ и n имеют указанные выше значения, или

(Б) взаимодействие соединения формулы III или его образующего амид производного с соединением формулы

где Ar¹, R¹ и n имеют указанные выше значения и Z обозначает твердофазный субстрат, химически связанный с указанным атомом азота, и отщепление образовавшего продукта от субстрата путем замены Z на водород; и

(II) выделение продукта в свободной форме или в форме соли.

Согласно варианту (А) способа, оединение формулы II может находиться в свободной форме или в форме соли. Вариант (А) способа можно осуществлять с помощью известных методов, например путем взаимодействия соединения формулы II с галогенангидридом, прежде всего с хлорангидридом кислоты формулы III, с использованием известных процессов образования амидов. Как правило, соединение формулы II в свободной форме или в форме соли подвергают взаимодействию со свободной карбоновой кислотой формулы III, например, с помощью известных процессов, таких как взаимодействие в присутствии третичного амина и связывающего пептид агента, такого как фосфониевая соль тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетрааметилурония или диизопропилкарбодиимид; эту реакцию осуществляют в инертном органическом растворителе, например, в галогенированном углеводороде, таком как дихлорметан; как правило, температура реакции составляет от 0 до 40°С, предпочтительно представляет собой температуру окружающей среды.

Согласно другому пути осуществления варианта (А) способа соединение формулы II, предпочтительно в форме соли, подвергают взаимодействию с образующим амид производным кислоты формулы III, представляющим собой тиоэфир формулы

где Ar² имеет указанные выше значения. Реакцию можно осуществлять с помощью известных процессов или аналогично методам, описанным в примерах. Ее можно осуществлять в присутствии третичного основания, такого как N-метилморфолин. Реакцию, как правило, осуществляют в органическом растворителе, предпочтительно спирте, таком как этанол. Температура реакции может составлять, например, от 30 до 60°С, как правило, от 40 до 50°С.

Вариант (Б) способа можно осуществлять с помощью известных методов, например, путем взаимодействия связанного с субстратом соединения со свободной кислотой в известных условиях пептидного сочетания, например, в присутствии третичного амина и указанного выше связывающего пептид агента. Реакцию можно осуществлять в инертном органическом растворителе, таком как диметилформамид (ДМФ). Приемлемая температура реакции составляет от 0 до 40°С, например, 15-25°С. Продукт можно отщеплять от субстрата известным методом, например обработкой трифторуксусной кислотой в случае, когда атом N связан с СН₂ бензильной группы в Z.

Соединения формулы III либо поступают в продажу либо их можно получать известными методами. Соединения формулы III A можно получать взаимодействием кислоты формулы III с 2,2'-дибензотиазолилдисульфидом в присутствии трифенилфосфина и третичного основания, такого как N-метилморфолин, например согласно методам, описанным в примерах.

Соединения формулы II можно получать взаимодействием соединения формулы

с соединением формулы

где Ar¹, R¹ и n имеют указанные выше значения, при условии, что когда R¹ содержит реакционноспособную функциональную группу, такую как гидроксигруппа, реакционноспособная группа может присутствовать в защищенной форме, например гидроксигруппа защищена в виде трет-бутоксигруппы, R⁷ обозначает водород или аминозащитную группу, например трет-бутоксикарбонильную группу, и Х обозначает галоген, и если R⁷ обозначает защитную группу путем замены R¹ в продукте водородом, и если R¹ в продукте содержит защищенную функциональную группу путем замены защитной группы водородом. Если R⁷ обозначает водород, реакцию между соединением формулы V и солью соединения формулы VI можно осуществлять согласно процессам, описанным в патенте US 4559349. Если R обозначает защитную группу, реакцию между соединениями формул V и VI можно осуществлять известными методами, например, в присутствии третичного органического основания, такого как триэтиламин или 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (ДБУ), как правило, в инертном растворителе, например, в полярном растворителе, таком как диметилформамид, реакцию, как правило, проводят при 0-40°С, предпочтительно при температуре окружающей среды. Замену защитной группы R⁷ водородом можно осуществлять с помощью известных методов; например, если R⁷ обозначает трет-бутоксикарбонил, обработкой карбоновой кислотой, такой как трифторуксусная кислота. Замену защитной группы в R¹ можно осуществлять с помощью известных методов, например, когда R¹ содержит гидроксигруппу, защищенную простой эфирной группой, такой как трет-бутоксигруппа, обработкой HBr в карбоновой кислоте, такой как уксусная кислота; когда R⁷ представляет собой защитную группу, то такая обработка приводит также к замене R⁷ водородом. Соединения формул V и VI являются известными или их можно получать известными методами.

Если в описании имеется ссылка на защищенные функциональные группы или на защитные группы, то предполагается, что защитные группы можно выбирать в зависимости от природы функциональной группы, например, как описано в "Protective Groups in Organic Synthesis", T.W.Greene и P.G.M.Wuts, John Wiley & Sons Inc, 2-е изд., 1991, где описаны также методы, применяемые для замены защитных групп водородом.

Соединения формулы II можно получать также путем взаимодействия соединения формулы V с соединением формулы

где R¹, R⁷ и n имеют указанные выше значения, и восстановителем, таким как цианборогидрид натрия или триацетоксиборогидрид натрия, например, с использованием известных процессов восстановительного аминирования, как правило, в инертном органическом растворителе, например простом эфире, таком как тетрагидрофуран (ТГФ), температура реакции, как правило, составляет от 0 до 40°С, и если R⁷ обозначает защитную группу путем замены ее на водород. Соединения формулы VII являются известными или их можно получать с помощью известных процессов.

Соединения формулы II, в которых R¹ обозначает гидроксиметил, можно получать также путем взаимодействия соединения формулы V с трет-бутиловым эфиром (R)-4-формил-2,2-диметилоксазолидин-3-карбоновой кислоты формулы

и восстановителем, таким как триацетоксиборогидрид натрия, например, в условиях, описанных выше для взаимодействия соединений формул V и VII, и взаимодействия продукта с реагентом, который может расщеплять оксазолидиновое кольцо, и замены связанной с азотом эфирной группы водородом, например хлористым водородом, в этаноле или диоксане, как это описано ниже в примерах, в этом случае получают соединение формулы II в виде гидрохлорида. Продукт реакции соединений формул V и VIIa, например, для улучшения в случае необходимости энантиомерной чистоты можно перед расщеплением оксазолидинового кольца обрабатывать оптически активной кислотой, такой как ди-О,О-бензоил-L-винная кислота. Соединение формулы VIIa можно получать согласно методу, описанному у A.D.Campbell и др., Synthesis 1707-1709 (1998) или G.Ageno и др., Tetrahedron 51, 8121-8134 (1995).

Соединения формулы II, в которых R обозначает С₁-С₈ алкоксиметил или ацилоксиметил, можно получать с помощью соответствующей этерификации или ацилирования соединений формулы II, в которых R¹ обозначает гидроксиметил.

Соединения формулы IV можно получать взаимодействием соединения формулы V с соединением формулы

где R¹, Z и n имеют указанные выше значения, например, с использованием известных процессов, таких как взаимодействие в инертном органическом растворителе, таком как ДМФ, в присутствии третичного амина, как правило, при температуре от 40 до 60°С. Соединения формулы VIII можно получать взаимодействием соединения формулы

где R¹, Z и n имеют указанные выше значения, с йодом, например, с помощью известных процессов, таких как взаимодействие в инертном органическом растворителе, таком как смесь ТГФ и ацетонитрила, в присутствии триарилфосфина и имидазола, как правило, при температуре от 10 до 40°С. Соединения формулы IX можно получать взаимодействием соединения формулы

где R¹ и n имеют указанные выше значения, с твердофазным субстратом Z, который несет группу, такую как альдегидная группа, вступающую в реакцию с аминогруппой. Такие твердофазные субстраты, включая модифицированные смолы, прежде всего модифицированные полистирольные смолы, имеются в продаже. Соединения формулы Х являются известными или их можно получать известными методами.

Соединения формулы I в свободной форме общепринятыми методами можно превращать в соль, и наоборот, соединения в свободной форме или в форме соли можно получать в форме гидратов или сольватов, содержащих растворитель, который применяют для кристаллизации. Соединения формулы I можно выделять из реакционных смесей и очищать общепринятыми методами. Изомеры, такие как энантиомеры, можно получать общепринятым методом, например, с помощью фракционированной кристаллизации или асимметричного синтеза, из исходных материалов, которые являются соответствующим образом асимметрично замещенными, например, из оптически активных материалов.

Соединения формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, обозначенные далее так же как агенты по изобретению, можно применять в качестве фармацевтических агентов. Таким образом, изобретение относится также к соединению формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, предназначенному для применения в качестве фармацевтического агента. Агенты по изобретению действуют в качестве антагонистов CCR-3-рецептора, ингибируя тем самым воспаление и инфильтрацию и активацию воспалительных клеток, прежде всего эозинофилов, и ингибируя аллергическую реакцию. Ингибирующую активность агентов по изобретению можно продемонстрировать с помощью следующего анализа:

Анализ связывания CCR-3

С помощью этого анализа оценивают воздействие агентов по изобретению на связывание человеческого эотаксина с человеческим CCR-3. Рекомбинантные клетки, экспрессирующие человеческий CCR-3, иммобилизуют с использованием покрытых агглютинином из проростков пшеницы (ППА) поливинилтолуиденовых (ПВТ) SPA-гранул (фирма Amersham) посредством специфического связывания между ППА и углеводными остатками гликопротеинов на поверхности клеток. Меченный с помощью [¹²⁵I] человеческий эотаксин (фирма Amersham) специфично связывается с CCR-3-рецепторами, приводя человеческий [¹²⁵I]-эотаксин в близкий контакт с SPA-гранулами. Испускаемые человеческим [¹²⁵I]-эотаксином альфа-частицы возбуждают благодаря их близкому расположению флуорофор в гранулах и вызывают испускание света. Свободный человеческий [¹²⁵I]-эотаксин в растворе не имеет близкого контакта со сцинтиллятором и поэтому не вызывает испускание света. Следовательно, количество вспышек является мерой того, в какой степени тестируемое соединение ингибирует связывание эотаксина с CCR-3.

Приготовление буфера для анализа: 5,96 г HEPES и 7,0 г хлорида натрия растворяют в дистиллированной воде и добавляют 1 М водный раствор CaCl₃ (1 мл) и 1 М водный раствор MgCl₂ (5 мл). Значение рН доводят до 7,6 с помощью NaOH и конечный объем раствора доводят до 1 л с помощью дистиллированной воды. Затем в растворе растворяют 5 г бычьего сывороточного альбумина и 0,1 г азида натрия и полученный буфер хранят при 4°С. В день применения в 50 мл буфера добавляют таблетку, содержащую смесь ингибиторов протеазы, типа Complete™ (фирмы Boehringer).

Приготовление буфера для гомогенизации: Трис-основание (2,42 г) растворяют в дистиллированной воде, значение рН раствора доводят до 7,6 с помощью соляной кислоты и раствор разбавляют дистиллированной водой до конечного объема 1 л. Полученный буфер хранят при 4°С. В день применения в 50 мл буфера добавляют таблетку, содержащую смесь ингибиторов протеазы типа Complete™.

Получение мембран: конфлюэнтные клетки крысиного базофильного лейкоза (RBL-2H3), стабильно экспрессирующие CCR-3, выделяют из колб для культуры ткани, используя не содержащий фермент буфер для диссоциации клеток, и ресуспендируют в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Клетки центрифугируют (800×g, 5 мин), дебрис ресуспендируют в охлажденном на льду буфере для гомогенизации, используя 1 мл буфера для гомогенизации на 1 г клеток, и инкубируют на льду в течение 30 мин. Клетки гомогенизируют на льду посредством 10 ударов в стеклянной ступке с пестиком. Гомогенат центрифугируют (800 г, 5 мин, 4°С), супернатант еще раз центрифугируют (48000×g, 30 мин, 4°С) и дебрис повторно растворяют в буфере для гомогенизации, содержащем 10 об. % глицерина. Содержание протеина в препарате мембран оценивают методом Брэдфорда (Anal. Biochem., 72:248 (1976)) и аликвоты быстро замораживают и хранят при - 80°С.

Анализ осуществляют в конечном объеме 250 мкл на лунку планшета типа Optiplate (фирма Canberra Packard). В определенные лунки планшета Optiplate добавляют 50 мкл растворов тестируемого соединение в буфере для анализа, содержащем 5% ДМСО (концентрации от 0,01 нМ до 10 мкМ). Для определения общего связывания в определенные другие лунки добавляют 50 мкл буфера для анализа, содержащего 5% ДМСО. Для определения неспецифического связывания в другие выбранные лунки добавляют 50 мкл 100 нМ человеческого эотаксина (фирма R&D Systems) в буфере для анализа, содержащем 5% ДМСО. Во все лунки добавляют по 50 мкл человеческого [¹²⁵I]-эотаксина (фирма Amersham) в буфере для анализа, содержащем 5% ДМСО в концентрации 250 пМ (получая конечную концентрацию 50 пМ на лунку), по 50 мкл ППА-ПВТ SPA-гранул в буфере для анализа (получая конечную концентрацию 1,0 мг гранул на лунку) и по 100 мкл препарата мембран в концентрации 100 мкг протеина в буфере для анализа (получая конечную концентрацию 10 мкг протеина на лунку). Затем планшет инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре. Планшет запечатывают с помощью TopSeal-S (фирма Canberra Packard) согласно инструкциям производителя. Полученные вспышки подсчитывают с помощью устройства Canberra Packard TopCount, учет каждой лунки осуществляют в течение 1 мин. Из графиков зависимости ингибирования от концентрации обычным образом рассчитывают концентрацию тестируемого соединения, при которой связывание ингибируется на 50% (IC₅₀).

Для соединений из приведенных ниже примеров с помощью вышеописанного анализа установлено, что значения IC₅₀ составляют менее 1 мкМ. Например, для соединений из примеров 1, 2, 4, 7, 9, 13, 20, 23, 25, 28, 30, 38, 40, 43 и 44 значения IC₅₀(нМ) составляют 125, 68, 13, 15, 5, 26, 8, 10, 11, 2, 13, 14, 6, 22 и 25 соответственно.

Для большинства соединений из примеров обнаружено избирательное действие в отношении ингибирования связывания с CCR-3 по сравнению с ингибированием связывания с альфа-1 адренергическим рецептором. Ингибирующее действие агентов по изобретению в отношении связывания с альфа-1 адренергическим рецептором можно продемонстрировать с помощью следующего анализа:

Кору головного мозга самцов крыс Sprague-Dawley (175-200 г) отсекают и гомогенизируют в 10 объемах охлажденного на льду 0,32 М раствора сахарозы (содержащего 1 мМ дигидрат MgCl₂ и 1 мМ К₂НРО₄) в стеклянном/тефлоновом гомогенизаторе. Мембраны центрифугируют при 1000×g в течение 15 мин, дебрис отбрасывают и повторяют центрифугирование. Супернатанты объединяют и центрифугируют при 18000×g в течение 15 мин. Дебрис подвергают осмотическому шоку в 10 объемах воды и выдерживают на льду в течение 30 мин. Суспензию центрифугируют при 39000×g в течение 20 мин, ресуспендируют в буфере Кребса-Хенселейта, рН 7,4 (1,17 мМ MgSO₄ (безводный) 4,69 мМ KCl, 0,7 мМ К₂HPO₄ (безводный), 0,11 М NaCl, 11 мМ D-глюкоза и 25 мМ NaHCO₃), содержащем 20 мМ Трис, и выдерживают в течение 2 дней при - 20°С. Затем мембраны подвергают оттаиванию при 20-23°С, трижды промывают буфером Кребса-Хенселейта путем центрифугирования при 18000×g в течение 15 мин, выдерживают в течение ночи при 4°С и вновь трижды промывают. Конечный дебрис ресуспендируют в этом же буфере с помощью стеклянного/тефлонового гомогенизатора из расчета 125 мл/100 мембран. Отбирают образец для определения концентрации протеина (с помощью анализа Брадфорда с использованием гамма-глобулина в качестве стандарта) и оставшиеся аликвоты хранят при - 80°С.

В полученных мембранах анализируют связывания радиолиганда. Анализ проводят в трех повторностях с использованием 96-луночных планшетов, содержащих [¹²⁵I]-НЕАТ (фирма Amersham) (40 пМ, K_d:58,9+18,7 пМ), немеченое тестируемое соединение и мембрану (57,1 мкг/мл). получая конечный объем 250 мкл (буфер для анализа, содержащий 50 мМ Трис-основание и 0,9% (мас/об) NaCl, рН 7,4). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 60 мин, после чего осуществляют быструю вакуумную фильтрацию с использованием 96-луночных фильтрационных планшетов Whatman GF/C. Затем каждый планшет трижды промывают 10 мл охлажденного на льду буфера для анализа с использованием клеточного харвестера фирмы Brandel (Гейтерсбург, штат Мэриленд). После сушки планшетов в течение 3 ч при 50°С в каждую лунку добавляют по 40 мкл сцинтилляциооной жидкости Microscint 20, планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение еще 20 мин и оценивают количественно удержанную радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика типа Packard Topcount NXT.

Маточный растворы тестируемых соединений сначала растворяют в 100% ДМСО и разбавляют буфером для анализа до требуемых концентраций, доводя концентрацию ДМСО до 1 об.%.

Из графиков зависимости ингибирования от концентрации обычным образом рассчитывают концентрацию тестируемого соединения, при которой наблюдается 50%-ное ингибирование (IC₅₀).

С помощью указанного анализа установлено, что для соединений из примеров 1, 2, 4, 7, 9, 13, 20, 23, 25, 28, 30, 38, 40, 43 и 44 значения IC₅₀ (нМ) составляют 210, 221, 94, 48, 58, 53, 89, 131, 387, 72, 121, 1519, 215, 356 и 331.

С учетом их способности ингибировать связывание с CCR-3 агенты по изобретению можно применять для лечения состояний, опосредуемых CCR-3, прежде всего воспалительных или аллергических состояний. Согласно изобретению, лечение может быть симптоматическим или профилактическим.

Таким образом, агенты по изобретению можно применять для лечения воспалительных или обструктивных заболеваний дыхательных путей, что приводит, например, к снижению повреждения ткани, бронхиальной гиперреактивности, к ремоделированию или снижению развития болезни. Воспалительные или обструктивные заболевания дыхательных путей, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают астму, вне зависимости от ее типа или генеза, в том числе как наследственную (неаллергическую) бронхиальную астму, так и приобретенную (аллергическую) бронхиальную астму, слабую астму, астму средней тяжести, тяжелую астму, бронхиальную астму, вызванную физической нагрузкой астму, профессиональную астму и астму, вызванную бактериальной или вирусной инфекцией. Понятие "лечение астмы" относится также к лечению пациентов возраста менее 4 или 5 лет, которые имеют симптомы стридора и в отношении которых поставлен диагноз или может быть поставлен диагноз "страдающий стридором ребенок", т.е. пациентов, относящихся к имеющей большое медицинское значение категории пациентов, которых в настоящее время часто называют астматиками с начальной или ранней стадией астмы. (Для простоты это конкретное астматическое состояние называют "синдромом страдающего стридором ребенка").

Эффективность профилактического лечения астмы можно выявлять по уменьшению частоты или серьезности симптоматических приступов, например острых приступов астмы или приступов бронхостеноза, улучшению функции легких или снижению повышенной реактивности дыхательных путей. Кроме того, ее можно оценивать по уменьшению частоты применения других средств симптоматического лечения, т.е. лечения, предназначенного для ограничения или устранения симптоматических приступов, если они возникают, например частоты применения противовоспалительных средств (например, кортикостероидов) или бронхолитических средств. Профилактическая эффективность в отношении астмы наиболее наглядно проявляется для пациентов, склонных к так называемому "утреннему погружению". "Утреннее погружение" представляет собой астматический синдром, которым страдает определенный процент астматиков, характеризующийся приступом астмы, например, приблизительно м