Система доставки нуклеиновых кислот

Система доставки нуклеиновых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка имеет приоритет предварительных заявок США № 60/345891, поданной 29 октября 2001 г., и № 60/294309, поданной 30 мая 2001 г.

Права государства

Данное изобретение сделано при поддержке правительства США и Национальных институтов здравоохранения на основании грантов 1 R37 CA50286 и 1 R01 CA86312; правительство США имеет определенные права на указанное изобретение.

Область техники

Настоящее изобретение относится к доставке генов и подобных нуклеиновых кислот в сайты-мишени in vivo. В частности, данное изобретение относится к опосредуемой липосомой доставке генов к ангиогенным кровеносным сосудам.

Предпосылки изобретения

Интегрины представляют собой класс клеточных рецепторов, которые, как известно, связывают белки внеклеточного матрикса и таким образом опосредуют межклеточное взаимодействие и взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом, определяемое как клеточная адгезия. Хотя в научной литературе описаны многие интегрины и связывающие интегрин лиганды, биологическая функция многих интегринов все еще слабо изучена. Рецепторы интегрина образуют семейство белков с общими структурными признаками комплексов нековалентных гетеродимерных гликопротеинов, образованных α- и β-субъединицами, Cheresh & Mecham. eds., Integrins: Molecular and Biological Responses to the Extracellular Matrix, Academic Press, Inc., San Diego, CA 92101 (1994), Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759 (1990). В настоящее время продолжаются исследования конкретных функций клеточной адгезии, выполняемых указанными интегринами при взаимодействии клеток в тканях.

Взаимодействие эндотелиальных клеток с матриксом играет определенную роль в процессе ангиогенеза, то есть образования новых кровеносных сосудов. Рецептор клеточной адгезии, известный как α_vβ₃-интегрин, обнаружен на поверхности активированных эндотелиальных клеток, участвующих в ангиогенезе.

Хорошо известно, что ангиогенез необходим для роста злокачественной опухоли и метастазов. При отсутствии ангиогенеза местное развитие опухоли угнетается. Кроме того, известно, что экспрессия специфического маркера ангиогенеза - α_vβ₃-интегрина соответствует степени развития опухоли.

Установлено, что катионные липосомы, содержащие непептидный антагонист интегрина в качестве вещества направленного действия, могут доставлять такие нуклеиновые кислоты, как гены, к ангиогенным кровеносным сосудам. Правильно выбранные нуклеиновые кислоты могут при желании подавлять или усиливать рост кровеносных сосудов и, таким образом, представляют средство для лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение относится к липосомам направленного действия, которые включают непептидный антагонист рецептора интегрина и нуклеиновую кислоту. Указанные липосомы направленного действия пригодны для избирательной доставки in vivo нуклеиновых кислот, таких как гены, антисмысловые олигонуклеотидные последовательности, ДНК, РНК и тому подобные, к заранее определенному сайту-мишени, например, ангиогенному кровеносному сосуду, при системном или местном введении. Выбранные нуклеиновые кислоты могут быть доставлены к ангиогенным кровеносным сосудам с целью опосредования поглощения таких нуклеиновых кислот эндотелиальными клетками сосудов для экспрессии или доставки антисмысловых последовательностей. При этом может достигаться нарушение роста новых кровеносных сосудов. Кроме того, благодаря соответствующему выбору доставляемой нуклеиновой кислоты можно при желании индуцировать рост новых кровеносных сосудов.

В частности, липосома, направленно воздействующая на рецептор α_vβ₃-интегрина, представляет наночастицу размером не более примерно 100 нанометров и является однослойным или многослойным пузырьком, содержащим катионное амфифильное вещество, такое как катионный липид, нейтральный липид, липид направленного действия, имеющий домен, направленно воздействующий на α_vβ₃-интегрин, и гидрофобный домен, а также нуклеиновую кислоту, такую как ген, антисмысловая олигонуклеотидная последовательность, последовательность ДНК, последовательность РНК и тому подобные. Липосома направленного действия может также необязательно включать нейтральный липид. Имеющийся в липиде направленного действия домен направленного действия может быть непосредственно присоединен к гидрофобному домену. Альтернативно домен направленного действия может быть ковалентно связан с гидрофильным связывающим доменом (поверхностный линкер), который в свою очередь ковалентно связан с гидрофобным доменом. Нуклеиновая кислота образует комплекс с катионным амфифильным веществом, присутствующим в липосоме. Домен направленного действия включает непептидный антагонист α_vβ₃-интегрина.

В липосоме направленного действия катионное амфифильное вещество, такое как катионный липид, присутствует в количестве от около 1 до около 50 молярных процентов, и домен направленного действия составляет в липиде направленного действия от около 1 до около 20 молярных процентов в расчете на общее число молей липида в липосоме. Липиды, образующие липосому направленного действия, могут иметь олигомеризуемые и/или полимеризуемые функциональные группы в соответствующих гидрофобных частях, и по крайней мере часть таких липидов, присутствующих в липосоме, может быть сшита друг с другом при помощи таких групп. Катионный липид может также при желании иметь сшиваемые группы. Альтернативно катионный липид может не иметь сшиваемых групп.

Липосомы направленного действия по настоящему изобретению можно использовать для доставки нуклеиновых кислот с целью лечения рака, воспалительных заболеваний, глазных болезней и тому подобных. Такие липосомы направленного действия можно также использовать для доставки генов с целью идентификации мишеней для лечения в кровеносных сосудах.

Липосомы направленного действия по данному изобретению представляют многофункциональные связывающие наночастицы размером не более около 250 нанометров, предпочтительно от около 40 до около 100 нанометров, которые включают катионный липид или цитофектин, образующие комплекс с нуклеиновой кислотой. Предпочтительный липид направленного действия можно представить как L-X-K, где L означает домен направленного действия, например, антагонист рецептора интегрина, такой как антагонист рецептора α_vβ₃-интегрина и т.п., Х означает гидрофильный домен, который служит в качестве поверхностного линкера для гидрофобного домена К. Альтернативно липид направленного действия можно представить как L-K, где домен направленного действия L непосредственно связан с гидрофобным доменом К.

Непептидными антагонистами рецептора интегрина, L, пригодными для достижения целей настоящего изобретения при физиологических значениях рН, являются цвиттерионы, имеющие катионную группу и анионную группу, которые могут взаимодействовать или связываться с рецептором интегрина. Катионная и анионная группы отделены друг от друга спейсерной группой, такой как двухвалентная ароматическая группа. Расстояние между катионной группой и анионной группой в молекуле антагониста рецептора составляет от около 10 до около 100 ангстрем и может быть создано алкоксибензойными кислотами, бициклическими или трициклическими соединениями, спироциклическими соединениями и тому подобными при наличии отделенных друг от друга катионной и анионной групп, предназначенных для взаимодействия с рецептором интегрина при физиологических значения рН. Приемлемые антагонисты рецептора интегрина можно схематически представить следующим образом:

Типичный непептидный антагонист рецептора α_vβ₃-интегрина имеет формулу

где имеется свободная аминогруппа (NH₂), предназначенная для ковалентного связывания антагониста с гидрофобным доменом липосомы при помощи прямой связи или поверхностной линкерной группы.

Другие приемлемые непептидные антагонисты рецептора α_vβ₃-интегрина, пригодные для достижения целей по настоящему изобретению при связывании с гидрофильным доменом липида направленного действия, описаны в патентах США №№ 5561148, 5776973 и 6204280 и в патентных публикациях WO 00/63178, WO 01/10841, WO 01/14337, WO 01/14338, WO 97/45137, WO 98/35949 и WO 00/26212.

Комбинация непептидного антагониста рецептора интегрина L и необязательного поверхностного линкера Х образует молекулу, направленно воздействующую на рецептор α_vβ₃-интегрина, или группу, пригодную для конъюгирования с носителем нуклеиновой кислоты, таким как катионная липосома и тому подобные. Полученную липосому направленного действия затем связывают с заранее определенной нуклеиновой кислотой, например, геном, с образованием комплекса.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 схематически показана липосома направленного действия по настоящему изобретению.

На фиг.2 показана сшитая липосома направленного действия по настоящему изобретению.

На фиг.3 показана другая сшитая липосома направленного действия по настоящему изобретению.

На фиг.4 схематически показаны липосомы направленного действия, циркулирующие системно.

На фиг.5 схематически показаны липосомы направленного действия, скапливающиеся в местах развития кровеносных сосудов.

На фиг.6 и 7 схематически показана доставка ДНК, такой как ген, к клеткам-мишеням.

На фиг.8 схематически показан адгезионный анализ, пригодный для испытания α_vβ₃-антагонистов.

На фиг.9 графически представлены данные, полученные при выполнении адгезионного анализа, показанного на фиг.8, которые свидетельствуют о том, что липосома направленного действия по настоящему изобретению связывается с рецептором α_vβ₃-интегрина.

На фиг.10 графически представлены данные, свидетельствующие об эффективной направленной доставке in vivo гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP)к клеткам, экспрессирующим α_vβ₃-интегрин, при использовании липосомы направленного действия по данному изобретению; приведенные данные показывают, что переносящие ген липосомы направленного действия трансфицируют клетки в зависимости от наличия в них α_vβ₃-интегрина; были использованы клетки меланомы человека М21 и М21L; клетки М21 экспрессируют α_vβ₃-интегрин, в то время как клетки М21L не экспрессируют α_vβ₃-интегрин (отсутствие α_v-интегрина).

На фиг.11 графически представлены данные, демонстрирующие избирательное направленное воздействие in vivo гена люциферазы светляков на клетки сосудистой сети опухоли, экспрессирующей α_vβ₃-интегрин, при использовании липосомы направленного действия по данному изобретению; приведенные данные показывают, что носители гена направленного действия трансфицируют клетки опухоли в зависимости от наличия в них α_vβ₃-интегрина; были использованы клетки меланомы человека М21 и М21L, имплантированные мышам; клетки М21 экспрессируют α_vβ₃-интегрин, в то время как клетки М21L не экспрессируют α_vβ₃-интегрин.

На фиг.12 графически представлены данные, свидетельствующие о подавлении и регрессе роста опухоли in vivo в результате введения липосомы направленного действия, связанной с геном, экспрессирующим мутантный белок Raf, подавляющий ангиогенез.

На фиг.13 графически представлены данные, свидетельствующие о подавлении и регрессе роста опухоли in vivo в результате введения липосомы направленного действия, связанной с геном, экспрессирующим мутантный белок Raf, подавляющий ангиогенез.

На фиг.14 показаны микрофотографии, свидетельствующие о доставке in vivo гена, кодирующего GFP, к ангиогенным сосудам хорионаллантоисной мембраны (САМ) цыпленка при использовании липосомы направленного действия по данному изобретению.

На фиг.15 показаны микрофотографии, свидетельствующие о доставке in vivo к кровеносным сосудам в глазу мыши гена, кодирующего GFP, путем инъекции в стекловидное тело глаза липосомы направленного действия по данному изобретению, связанной с геном.

На фиг.16 показаны микрофотографии, свидетельствующие об апоптозе новых сосудов in vivo благодаря опосредуемой липосомой направленного действия доставке гена, кодирующего мутантный белок Raf, к ангиогенным сосудам в сетчатке мыши.

На фиг.17 показана схема синтеза 1 липосомы направленного действия, на которой подробно рассмотрен синтез главного промежуточного конъюгата трехвалентного липида и антагониста интегрина 12.

На фиг.18 показана схема синтеза 2 липосомы направленного действия, на которой рассмотрено образование наночастиц липосом направленного действия (NP)в результате самоассоциации и полимеризации соответствующих липидов из конъюгата трехвалентного липида и антагониста интегрина 12.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Липосомы направленного действия по настоящему изобретению, показанные на фиг.1-3 и 18, содержат антагонист рецептора интегрина, например антагонист рецептора α_vβ₃-интегрина, связанный с липидом, и носитель нуклеиновой кислоты, например катионное амфифильное вещество, такое как катионный липид. Указанная липосома может также содержать нейтральный или цвиттерионный липид-наполнитель.

Липид направленного действия имеет домен направленного действия, который включает антагонист рецептора α_vβ₃-интегрина, ковалентно связанный с гидрофобным доменом. Домен направленного действия может быть непосредственно связан с гидрофобным доменом либо домен направленного действия может быть связан с гидрофильным доменом, таким как линкерная группа (поверхностный линкер), который в свою очередь связан с гидрофобным доменом.

Антагонисты рецептора интегрина, пригодные для достижения целей по настоящему изобретению, представляют цвиттерионы при физиологических значениях рН и имеют катионную и анионную группы, которые могут взаимодействовать или связываться с рецептором интегрина. Катионная и анионная группы отделены друг от друга спейсерной группой, такой как двухвалентная ароматическая группа. Расстояние между катионной группой и анионной группой в молекуле антагониста рецептора находится в пределах от около 10 до около 100 ангстрем и может быть создано п-алкоксибензойными кислотами, бициклическими или трициклическими соединениями, спироциклическими соединениями и подобными соединениями при наличии отделенных друг от друга катионной и анионной групп, предназначенных для взаимодействия с рецептором интегрина при физиологических значениях рН.

Термин "арил" в значении, используемом в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает углеводородный радикал, содержащий по крайней мере одно ароматическое кольцо с 6 атомами углерода, который дополнительно может включать углеводородные заместители с линейной или разветвленной цепью или циклические углеводородные заместители. Термин "гетероарил" означает радикал, содержащий по крайней мере одно ароматическое углеродное кольцо с гетероатомом, который дополнительно может включать углеводородные заместители с линейной или разветвленной цепью или циклические углеводородные заместители, при этом гетероатом может быть любым элементом, выбираемым из групп, определяемых по номенклатуре IUPAC как группа 15 (азотная группа) и группа 16 (кислородная группа) в периодической таблице, включая ароматические гетероциклические радикалы таких соединений, описанные в издании L.A. Paquette, Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1968), которое включено в данное описание изобретения в качестве ссылки. Указанные арильные и гетероарильные группы могут быть не замещены или замещены.

Термин "гетероциклический" в значении, используемом в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает радикал, содержащий по крайней мере одно углеродное неароматическое кольцо с гетероатомом, который дополнительно может включать углеводородные заместители с линейной или разветвленной цепью или циклические углеводородные заместители, при этом гетероатом может быть любым элементом, выбираемым из групп, определяемых по номенклатуре IUPAC как группа 15 (азотная группа) и группа 16 (кислородная группа) в периодической таблице, включая неароматические гетероциклические радикалы таких соединений, описанные в приведенном выше издании L.A. Paquette, которое включено в данное описание изобретения в качестве ссылки. Гетероциклические группы могут быть не замещены или замещены алкильными группами или реакционноспособными функциональными группами, такими как галогены, аминогруппы, гидроксильные группы, группы карбоновых кислот, группы сульфоновых кислот и тому подобные.

Термин "алкил" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает углеводородную часть, которая может включать линейную или разветвленную цепь или может иметь карбоциклическую кольцевую структуру.

Термин "алкенил" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает алкильную группу, имеющую по крайней мере одну углерод-углеродную двойную связь.

Термин "алкинил" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает алкильную группу, имеющую по крайней мере одну углерод-углеродную тройную связь.

Термин "замещенный" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает замену одного или более атомов водорода в одном из вышеуказанных радикалов алкильной группой, фенильной группой или функциональной группой, такой как гидроксильная, алкоксильная, амино, нитрозо, нитро, азо, азидо, амидо, карбоксильная, оксо, тиоловая, сульфоксильная, сульфонильная, фосфинильная, фосфонильная, фтор-, хлор-, бром-, иодсодержащая и подобные группы, которые описаны в издании R. Panico et al., A Guide To IUPAC Nomenclature of Organic Compounds, Blackwell Science Ltd. (1993), которое включено в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Термин "липосома" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает шарик, стенки которого образованы липидными молекулами, которые могут быть сополимеризованы или не сополимеризованы друг с другом.

Термин "липид" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает любое число групп масел, жиров, жироподобных веществ, которые обычно растворяются в относительно неполярных растворителях, но плохо растворяются в водных растворителях. Липиды образуют один из четырех основных классов соединений, присутствующих в тканях живых организмов, и включают жирные кислоты, нейтральные жиры, такие триацилглицерины, сложные эфиры жирных кислот и мыла, длинноцепочечные (жирные) спирты и воски, сфингоиды и другие длинноцепочечные основания, гликолипиды, фосфолипиды, сфинголипиды, каротины, полипренолы, стеролы и тому подобные, а также терпены и подобные изопреноиды.

Термин "цитофектин" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает катионный липид, пригодный для доставки и экспрессии гена, который состоит из катионной головной группы, присоединенной линкером к гидрофобному домену или части.

Термин "нейтральный" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения для обозначения липидов, означает незаряженные липиды, например, холестерин и тому подобные, а также цвиттерионные липиды, например, диолеоилфосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилхолин и тому подобные.

Термин "холестерил" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает стероидные углеводородные части, выделенные из холестерина или имеющие подобную структуру.

Термин "антагонист рецептора интегрина" в значении, используемом в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, означает непептидное соединение, которое избирательно связывается с рецептором интегрина, например, с α_vβ₃-рецептором, α_vβ₅-рецептором, α_vβ₆-рецептором и тому подобными, и оказывает антагонистическое действие.

Типичное соединение такого α_vβ₃-антагониста выражено формулой

где имеющаяся свободная аминогруппа (NH₂) ковалентно связывает антагонист с гидрофобным доменом липосомы при помощи поверхностной линкерной группы, такой как карбоксильная и/или другая приемлемая активная группа.

Другие типичные непептидные антагонисты α_vβ₃-рецепторов, которые пригодны для достижения целей по настоящему изобретению, будучи связанными прямо или косвенно с гидрофобным доменом липида направленного действия, описаны в патентах США №№ 5561148, 5776973 и 6204280 и в патентных публикациях WO 00/63178, WO 01/10841, WO 01/14337, WO 01/14338, WO 97/45137, WO 98/35949 и WO 00/26212, которые включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. Такие антагонисты α_vβ₃-рецепторов показаны ниже

и подобные антагонисты, описанные в патентной заявке WO 01/14338;

и подобные антагонисты, описанные в патентной заявке WO 01/14337;

и подобные антагонисты, описанные в патентной заявке WO 00/63178;

и подобные антагонисты, описанные в патентной заявке WO 01/10841; при условии, что такие соединения включают или модифицированы с возможностью включения функциональной группы или мостиковой группы, которая может взаимодействовать с поверхностным линкером или гидрофобным доменом с образованием липида направленного действия. Такие модификации хорошо известны в области химии. Например, одна из ароматических частей вышеуказанных соединений может быть химически замещена амино, гидроксильной или тиоловой группой, обеспечивая возможность присоединения к поверхностному линкеру. Альтернативно ароматические группы могут быть замещены карбоновой кислотой и поверхностный линкер может представлять, например, замещающую аминогруппу.

Непептидный антагонист рецептора интегрина ковалентно присоединен к гидрофильному поверхностному линкеру или непосредственно к гидрофобному домену при помощи обычных химических методов, обеспечивающих ковалентную связь антагониста с поверхностным линкером или гидрофобным доменом. Химические методы осуществления реакций, позволяющих получить такие связи, хорошо известны в данной области и включают использование комплементарных функциональных групп в поверхностном линкере или гидрофобном домене и лиганде антагониста интегрина. Комплементарные функциональные группы в поверхностном линкере или гидрофобном домене предпочтительно выбирают в зависимости от функциональных групп, которые имеются в лиганде для образования связи или которые можно ввести в данный лиганд для образования связи. Такие дополнительные функциональные группы также хорошо известны в данной области. Например, осуществление взаимодействия между карбоновой кислотой и первичным или вторичным амином в присутствии приемлемых хорошо известных активирующих агентов приводит к образованию амидной связи, которая может ковалентно связывать лиганд с поверхностным линкером или гидрофобным доменом, осуществление взаимодействия между аминогруппой и группой сульфонилгалогенида приводит к образованию сульфонамидной связи, которая может ковалентно связывать лиганд с поверхностным линкером или гидрофобным доменом; и осуществление взаимодействия между спиртом или фенольной группой и алкил- или арилгалогенидом приводит к образованию простой эфирной связи, которая может ковалентно связывать лиганд антагониста интегрина с поверхностным линкером или гидрофобным доменом.

Альтернативно антагонист рецептора интегрина может включать гидрофобный домен, такой как С₁₈-С₃₀ алкильная группа, С₁₈-С₃₀ алкенильная группа, С₁₈-С₃₀ алкинильная группа, холестерильная группа и тому подобные. Гидрофобный домен, имеющий или не имеющий промежуточный поверхностный линкер, присоединен к антагонисту рецептора интегрина в положении, которое сохраняет возможность взаимодействия с сайтом связывания рецептора, и, в частности, в положении, которое позволяет антагонисту ориентироваться для связывания с сайтом связывания рецептора интегрина. Такие положения и способы синтеза для образования связи хорошо известны в данной области.

Предпочтительные антагонисты рецептора α_vβ₃-интегрина, которые имеют гидрофобный домен или могут быть ковалентно присоединены к гидрофобному домену, выражены формулами (I) и (II)

где в формуле (I) R¹ и R² представляют собой водород или вместе образуют мостиковую 1,2-фениленовую (С₆Н₄) группу или мостиковую этиленовую группу (-СН=СН-); Х означает -С(O)- или ковалентную связь; n равно 1, 2 или 3; Z¹ означает -С(O)-R³; -C(O)OR³ или SO₂R³; и R³ означает фенил, замещенный фенил, пиридил, бензил, замещенный бензил, С₁-С₄ галогеналкил, С₂-С₃₀ алкил, С₂-С₃₀ алкенил, С₂-С₃₀ алкинил или холестерил; и где в формуле (II) R⁴ и R⁵ представляют собой водород или вместе образуют ковалентную связь; Y означает -С(О)- или -СН₂-; Z² означает -С(О)-R⁶, -C(O)OR⁶ или SO₂R⁶; R⁶ означает фенил, замещенный фенил, пиридил, бензил, замещенный бензил, С₁-С₄ галогеналкил, С₂-С₃₀ алкил, С₂-С₃₀ алкенил, С₂-С₃₀ алкинил или холестерил; и Het означает 2-пиридил или 2-имидазолил.

Неограничивающие примеры антагонистов рецептора интегрина формулы (I) включают приведенные ниже соединения Ia, Ib, Ic, Id, Ie и If. Получение указанных соединений описано в публикации РСТ WO 98/35949.

Неограничивающие примеры антагонистов рецептора интегрина формулы (II) включают приведенные ниже соединения IIa, IIb, IIc, IId, IIe и IIf. Получение указанных соединений описано в публикации РСТ WO 00/26212.

Предпочтительные антагонисты рецептора α_vβ₃-интегрина имеют молекулярную массу (MW) от около 200 до около 800 дальтон, более предпочтительно от 450 до около 610 дальтон, если указанные соединения не присоединены ковалентно к гидрофобному домену липида направленного действия.

Антагонист рецептора α_vβ₃-интегрина, ковалентно присоединенный к гидрофобному домену или включающий гидрофобный домен, в сочетании с катионным липидом позволяет получить катионную липосому, которая биологически совместима и по существу неиммуногенна. Биологическая активность липосомы направленного действия может зависеть от валентности, геометрии, состава, размера, гибкости или жесткости и т.д. гидрофильного поверхностного линкера при его наличии и в свою очередь от общей конфигурации липосомы направленного действия, а также от относительной гидрофильности поверхности линкера и подобных факторов. Таким образом, при наличии гидрофильного поверхностного линкера его предпочтительно выбирают с возможностью достижения максимальной биологической активности липосомы направленного действия. Поверхностный линкер можно выбрать с учетом увеличения биологической активности молекулы направленного действия. Поверхностный линкер обычно выбирают из органических молекул с любой структурой, которая ориентирует антагонист в направлении сайта связывания. В этом отношении поверхностный линкер можно рассматривать как "каркас", на котором расположен один или более антагонистов интегрина с достижением требуемой ориентации. Ориентация может представлять, например, расположение антагониста на приемлемом расстоянии от поверхности липосомы для обеспечения эффективного взаимодействия антагониста с активным сайтом рецептора интегрина.

Например, разную ориентацию можно создать, включая в каркасные группы, содержащие моно- и полициклические группы, в том числе арильные и/или гетероарильные группы, или структуры, имеющие одну или более углерод-углеродных множественных связей (алкенильные, алкениленовые, алкинильные или алкиниленовые группы). Другие группы могут также включать олигомеры и полимеры с разветвленными или прямыми цепями. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения жесткость достигается благодаря наличию циклических групп (например, арильной, гетероарильной, циклоалкильной, гетероциклической и т.д.). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения кольцо является шести- или десятичленным кольцом. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения кольцо представляет ароматическое кольцо, такое как, например, фенил или нафтил.

Кристаллическая структура внеклеточной части α_vβ₃-интегрина, связанного с антагонистом интегрина, описана в статье Xiong et al., Science 296: 151-155 (2002). Антагонисты рецептора α_vβ₃-интегрина, используемые при осуществлении настоящего изобретения, имеют структуру, которая взаимодействует с рецептором α_vβ₃-интегрина аналогично взаимодействию, описанному в статье Xiong et al.

Специалист в данной области может легко определить разные гидрофильные свойства поверхностного линкера, а также наличие или отсутствие заряженных частей в липосоме. Например, гидрофобный характер поверхностного линкера, полученного из гексаметилендиамина (Н₂N(CH₂)₆NH₂) или родственных полиаминов, можно сделать более гидрофильным, заменяя алкиленовую группу поли(оксиалкиленовой) группой, такой как поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль) и тому подобные.

Свойства поверхностного линкера можно модифицировать, добавляя или вставляя вспомогательные группы в/на поверхностный линкер, например, для изменения растворимости липосом (в воде, жирах, липидах, биологических жидкостях и т.д.), гидрофобности, гидрофильности, гибкости поверхностного линкера, антигенности, устойчивости и т.д. Например, введение одной или более поли(этиленгликолевых) (PEG) групп в/на поверхностный линкер усиливает гидрофильность или водорастворимость наночастиц липосомы, увеличивает молекулярную массу и размер молекулы и в зависимости от характера поверхностно линкера может также увеличить время удерживания in vivo. Кроме того, PEG может уменьшать антигенность и потенциально увеличивать общую жесткость поверхностного линкера.

Вспомогательные группы, которые могут повысить водорастворимость/гидрофильность липосомы, являются полезными при осуществлении данного изобретения. Таким образом, в объем настоящего изобретения входит применение вспомогательных групп, таких как, например, мелкие структурные единицы этиленгликолей, пропиленгликолей, спиртов, полиолов (например, глицерин, пропоксилат глицерина, сахариды, включая моно-, олигосахариды и т.д.), карбоксилатов (например, мелкие структурные единицы глутаминовой кислоты, акриловой кислоты и т.д.), аминов (например, тетраэтиленпентамин) и тому подобные, для увеличения водорастворимости и/или гидрофильности липосомы по данному изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения вспомогательной группой, используемой для улучшения водорастворимости/гидрофильности, является простой полиэфир. Вспомогательная группа может быть присоединена к поверхностному линкеру у липида направленного действия или может быть присоединена к другим липидам в липосоме, таким как, например, катионный липид или нейтральный липид-наполнитель.

В объем данного изобретения входит также введение липофильных вспомогательных групп в структуру поверхностного линкера для увеличения липофильности и/или гидрофобности описанных липосом. Липофильные группы, которые можно использовать с поверхностными линкерами по данному изобретению, включают приводимые только в качестве примеров незамещенные или замещенные арильные и гетероарильные группы, и могут быть замещены по крайней мере одной группой, делающей возможным ковалентное присоединение указанных групп к поверхностному линкеру. Другие липофильные группы, пригодные для использования с поверхностными линкерами по данному изобретению, включают производные жирных кислот, не образующие двойные слои в водной среде до достижения относительно более высоких концентраций.

Гибкость поверхностного линкера можно изменять путем введения объемных и/или жестких вспомогательных групп. Наличие объемных или жестких групп может препятствовать свободному вращению вокруг связей в поверхностном линкере, связей между поверхностным линкером и вспомогательной(ыми) группой(ами) или связей между поверхностным линкером и функциональными группами. Жесткие группы могут включать, например, группы, конформационная неустойчивость которых ограничена присутствием колец и/или множества связей в группе, в частности арильные, гетероарильные, циклоалкильные, циклоалкенильные и гетероциклические группы. Другие группы, способные придавать жесткость, включают полипептидные группы, такие как олиго- или полипролиновые цепи.

Жесткость можно также придать электростатически. Так, если вспомогательные группы положительно или отрицательно заряжены, аналогично заряженные вспомогательные группы будут стремиться к созданию структуры поверхностного линкера, обеспечивающей максимальное расстояние между всеми одинаковыми зарядами. Энергетические затраты, необходимые для сближения одинаково заряженных групп, будут сохранять конфигурацию поверхностного линкера, в которой одинаково заряженные вспомогательные группы отделены друг от друга. Кроме того, вспомогательные группы, имеющие противоположные заряды, будут притягиваться к противоположно заряженным группам и потенциально могут образовывать межмолекулярные и внутримолекулярные ионные связи. Такой нековалентный механизм будет сохранять конфигурацию поверхностного линкера, способствующую образованию связей между противоположно заряженными группами. В объем настоящего изобретения входит введение дополнительных вспомогательных групп, которые заряжены или альтернативно имеют скрытый заряд при снятии защиты после присоединения к поверхностному линкеру, включая удаление защитных групп в карбоксильной, гидроксильной, тиоловой или аминогруппе путем изменения показателя рН, окисления, восстановления или при помощи других механизмов, известных специалистам в данной области.

Жесткость можно также придать путем внутреннего связывания водорода или гидрофобного разрушения.

Объемные группы могут включать, например, большие атомы, ионы (например, иод, серу, ионы металлов и т.д.) или группы, содержащие большие атомы, полициклические группы, в том числе ароматические группы, неароматические группы и структуры, имеющие одну или более углерод-углеродных множественных связей (т.е. алкены и алкины). Объемные группы могут также включать олигомеры и полимеры с разветвленной или прямой цепью. Предполагается, что разветвленные полимеры придают структуре большую жесткость, чем линейные полимеры с аналогичной молекулярной массой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения жесткость придается за счет присутствия циклических групп (таких как арильные, гетероарильные, циклоалкильные, гетероциклические и т.д.). В других вариантах осуществления изобретения поверхностный линкер включает одно или более шестичленных колец. В некоторых других вариантах осуществления изобретения кольцо представляет арильную группу, такую как, например, фенил или нафтил.

Соответствующий выбор группы поверхностного линкера, обеспечивающей подходящую ориентацию, ограниченное/неограниченное вращение, требу