Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент комплекса протеиназ, пептидаз, -глюканазы, -амилазы и ксиланазы

Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент комплекса протеиназ, пептидаз, -глюканазы, -амилазы и ксиланазы

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию нового штамма Aspergillus oryzae POM-156 - продуцента комплекса протеиназ и пептидаз, α-амилазы, ксиланазы, β-глюканазы; оптимум действия рН 4,5-5,5 с высокой продуктивностью экзогидролаз. Штамм получен селекцией из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза комплекса протеолитических, амилолитических и целлюлолитических ферментов гемицеллюлазного действия при глубинном способе культивирования продуцента.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения комплекса протеиназ и пептидаз, α-амилазы, ксиланазы и β-глюканазы. Протеолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности: спиртовой, мясомолочной, пивоваренной, винодельческой, сельскохозяйственной и других. Это обусловлено тем, что перерабатываемое сельскохозяйственное сырье содержит высокомолекулярные белковые полимеры. Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов протеолитического, амилолитического и целлюлолитического действия связано с интенсификацией биотехнологических процессов производства спирта, пива и т.д. Наличие в комплексе пептидаз, протеиназ, а также β-глюканазы позволяет использовать ферментные препараты для протеолиза микробного белка с целью получения биологически активных пищевых и кормовых добавок. Гидролитические ферменты получают как продукт биосинтетической деятельности грибов или бактерий [1, 2]. Однако использование грибов более предпочтительно, чем бактерий, так они синтезируют сложный комплекс протеаз, в состав которого входят активные пептидазы и протеиназы, а также богатый комплекс сопутствующих ферментов, осуществляющих более эффективный катализ высокомолекулярных микробного, растительного и животного сырья полимеров в кислой и слабокислой зоне рН. В связи с этим селекция новых грибных штаммов для получения комплекса гидролаз актуальна.

Известны штаммы - продуценты грибных протеаз из рода Aspergillus oryzae 251-90, 824-32 [3, 4], при глубинном культивировании которых синтезируются кислые и слабокислые протеазы. Недостатками этих продуцентов являются их низкая продуктивность, сложный состав питательных сред, а также длительный период роста продуцентов.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae 387, регистрационный номер ВКПМ F-683 [2], один из наиболее активных продуцентов протеаз и комплекса других гидролитических ферментов. В глубинной культуре известного штамма Aspergillus oryzae 387 на 42 часа роста протеолитическая активность достигает 11,5 ед. ПС/см³ в зависимости от состава питательной среды.

Недостатком этого штамма является низкий уровень активности протеаз и сопутствующих ферментов в культуральной жидкости (к.ж.) гриба.

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса: протеаз, содержащих активные карбокси- и аминопептидазы и протеиназы, а также сопутствующих ферментов - α-амилазы, β-глюканазы и ксиланазы.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма Aspergillus oryzae РОМ-156, заключается в получении более активного комплекса протеиназ и пептидаз, уровень активности которого в 2,5-3,9 раза превышает аналог, а также сопутствующих ферментов с высокой активностью в культуральной жидкости, превышающей аналог: по β-глюканазе - в 6-10 раз, по α-амилазе - в 1,3-1,4 раза, по ксиланазе - в 1,6-1,9.

Задача решается созданием нового штамма - продуцента комплекса гидролаз путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (5), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах и активному синтезу комплекса протеаз, β-глюканазы, α-амилазы и ксиланазы.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae POM-156 получен путем многоступенчатой селекции и мутагенеза с использованием эффективных химических и физических мутагенов, депонирован в ВКПМ под №F-931.

В результате мутагенеза после неоднократного отбора и рассева вариантов был получен штамм Aspergillus oryzae POM-156 - продуцент комплекса протеаз, α-амилазы, β-глюканазы и ксиланазы, обладающий высокой скоростью роста и продуктивностью комплекса перечисленных ферментов.

Изучали уровни продукции ферментативного комплекса в культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известного штамма в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Общую протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычьего гемоглобина при оптимальных условиях действия протеаз, амилолитическую активность - по ГОСТ 20264.4-89, ксиланазную - по Шомоди-Нельсону, β-глюканазную - глюкозооксидазным методом. Сравнительные показатели уровней ферментативных активностей культуральной жидкости штамма Aspergillus oryzae POM-756 с прототипом представлены в табл.1 и табл.3.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae РОМ-156, обладающий высоким уровнем синтеза комплекса протеаз: пептидаз и протеиназ, β-глюканазы, а также α-амилазы и ксиланазы и сокращенной длительностью процесса культивирования, что позволяет повысить технологичность процесса получения комплекса ферментов при использовании штамма Aspergillus oryzae POM-156. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с сусло-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae POM-156 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусло-агаре образуются колонии диаметром 86-88 мм, поверхность колонии шероховатая, складчатая, профиль колонии плоский, форма колонии округлая, края волнистые, цвет - светло-салатовый, с возрастом цвет колонии темнеет. Цвет с обратной стороны - песочный.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 45-47 мм, цвет колонии коричнево-зеленый, форма колоний округлая, края ровные, белые, отмечается радиальная складчатость.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба септированный, хорошо разветвленный, со вздутиями, конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 4-8 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста 30-32°С, максимальная - 50°С, минимальная - 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae POM-156 использовали для получения комплекса протеаз, β-глюканаз, а также ферментов амилолитического и ксиланолитического действия.

При глубинном культивировании штамма Aspergillus oryzae РОМ-156 в зависимости от условий протеолитическая активность составляет 28,0-39,2 ед. ПС/см³, амилолитическая - 14-17 ед. АС/см³, β-глюканазная - 3,8-4,8 ед. β-ГкС/см³, ксиланазная - 5,6-7,8 ед. КС/см³ (табл.3).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 и штамм 387 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂РО₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 1). Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³ ферментационной питательной среды, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 38 часов. Максимальное накопление ферментов наблюдалось у штамма A.oryzae РОМ-156 к 38 часам культивирования. Уровень активности составлял: по протеазе - 28,0 ед. ПС/см³, по β-глюканазе - 4,1 ед. β-ГкС/см³, по α-амилазе - 14,0 ед. АС/ см³, по ксиланазе - 6,8 ед. КС/ см³ (табл.1). В состав синтезируемого комплекса протеаз входят: сериновая протеиназа - 0,081 ед./см³, карбоксильная - 1,19 ед./см³, металлозависимая - 0,412 ед./см³, лейцинаминопептидаза - 2,3 ед./см³, карбоксипептидаза - 0,79 ед./см³ (табл.2).

Пример 2. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; кукурузные столбики - 1,0 KH₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 2). Условия ферментации, аналогичные примеру 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 39,2 ед. ПС/см³, β-глюканазная - 4,8 β-ГкС/см³, амилолитическая - 17,0 ед. АС/см³, ксиланолитическая - 7,8 ед. КС/см³.

Пример 3. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 4,0; соя - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 3). Условия ферментации, аналогичные примеру 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 32,2 ед. ПС/см³, β-глюканазная - 4,2 β-ГкС/см³, амилолитическая - 14,3 ед. АС/см³, ксиланолитическая - 5,5 ед. КС/см³.

Пример 4. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 4,0; соя - 0,5; солодовые ростки - 1,0; КН₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 4). Условия ферментации, аналогичные примеру 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 31,4 ед. ПС/см³, β-глюканазная - 4,3 β-ГкС/см³, амилолитическая - 14,0 ед. АС/см³, ксиланолитическая - 5,7 ед. КС/см³.

Таблица 1
Сравнительная оценка физиологической активности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов протеаз
Штамм	Длительность культивирования, час	Протеолитическая активность, ед. ПС/см3
ПС	β-ГкС	AC	КС
387	42	11,5	0,4	10,5	4,1
РОМ-156	38	28,0	4,1	14,0	6,8

Таблица 2
Биохимический состав ферментативных комплексов, синтезируемых микромицетом Aspergillus oryzae
Наименование фермента	Штамм A.oryzae
387	POM-56
Общая протеолитическая акт-сть РН-5.5, ед. ПС/см3	11,5	28,0
Протеиназы
Сериновая	0,047	0,081
Карбоксильная	0,603	1,190
Металлозависимая	0,195	0,412
Пептидазы
Лейцинамино-	0,98	2,30
Карбокси-	0,37	0,79

Таблица 3
Влияние питательных сред на ферментативную активность гриба Aspergillus oryzae шт.387 и шт. РОМ-156
Штамм	№ питательной среды	Ферментативная активность
ПС	β-ГкС	AC	КС
ед./см3	% увеличения	ед./см3	% увеличения	ед./см3	% увеличения	ед./см3	% увеличения
387	1234	9,710,19,89,4	----	0,50,80,60,7	----	11,312,310,810,2	----	3,84,23,43,2	----
РОМ-156	1234	30,039,232,231,4	210288228234	3,84,84,24.3	660500600515	15,017,014,314,0	32383237	6,27,85,55,7	63866278

Источники информации

1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - М.: Изд. «Элеватор», 2000.

2. Патент РФ 2208633, кл. С 12 N 1/20, 2001.

3. Зуева Р.В. Физиолого-биохимические исследования экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae - активного продуцента кислой протеиназы. Автореферат канд. диссертации. - М., 1971.

4. А.с. СССР №1440922, кл. С12N 1/14, 1988.

5. Патент РФ 2070921, 1993.

Штамм гриба Aspergillus oryzae РОМ-156, ВКПМ F-931 - продуцент комплекса протеиназ и пептидаз, β-глюканазы, α-амилазы и ксиланазы.