Способ продуцирования микробной трансглутаминазы

Способ продуцирования микробной трансглутаминазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ёОбласть техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новой протеазе, которая эффективно отщепляет проструктурную часть протрансглутаминазы с преобразованием ее в активную форму трансглутаминазы, и к кодирующей ее нуклеиновой кислоте, причем указанная протрансглутаминаза продуцируется актиномицетами.

Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования микробной трансглутаминазы в ее активной форме с использованием указанной протеазы. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу продуцирования нейтральной металлопротеазы.

Уровень техники изобретения

Трансглутаминаза представляет собой фермент, который катализирует реакцию ацильного переноса γ-карбоксиламидных групп на пептидную цепь белка. Когда данный фермент взаимодействует с белком, могут происходить образование перекрестной связи ε-γ-Glu)-Lys и замена Gln на Glu путем дезамидирования. Трансглутаминазы используют для производства гелеобразных пищевых продуктов, таких как желе, йогурт, сыр или гелеобразных косметических средств и других, для улучшения качества мяса и т.д. (публикация заявки на выдачу патента Японии № 1-50382, прошедшая экспертизу) (JP-Kokoku). Более того, трансглутаминаза представляет собой фермент, имеющий высокий уровень применения в промышленности в том плане, что он используется для производства материалов для термостабильных микрокапсул, носителя для иммобилизованных ферментов и т.д.

Ранее были известны трансглутаминазы из животных, которые являются зависимыми от кальция в плане проявления своей активности, и трансглутаминазы из микроорганизмов (микробная(-е) трансглутаминаза(-ы)), которая(-е) здесь и далее также указываются как «MTG»), которые являются не зависимыми от кальция в плане проявления своей активности. В ряду MTG была обнаружена трансглутаминаза из бактерии, принадлежащей к роду Streptoverticillium. Такие бактерии Streptoverticillium включают в себя, например, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum subsp. cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense (здесь и далее может быть сокращенно обозначена как S. mobaraense) IFO 13819 и др. (публикация неоцененной заявки на выдачу патента Японии (JP-Kokai) № 64-27471).

Поскольку данные трансглутаминазы, однако, продуцировались путем очистки из культур, таких как культуры описанных выше микроорганизмов, имели место проблемы в плане количества и эффективности, и тому подобного. Затем, в качестве способа эффективной секреции гетерологичных белков, был разработан способ, в котором в качестве хозяина выбрана коринеформная бактерия, где белок слияния, содержащий трансглутаминазу, присоединяли ниже домена сигнального пептида коринеформной бактерии, и трансглутаминаза эффективно секретировалась с получением ее высокого выхода (WO 01/23591). В данном исследовании описан способ, в котором MTG секретируется в неактивной форме как протрансглутаминаза (здесь и далее указана как «про-MTG»), в которой проструктурная часть присоединена к MTG, и затем проструктурная часть про-MTG отщепляется протеазой с преобразованием ее в трансглутаминазу, имеющую активность, а также способ, в котором активная трансглутаминаза продуцируется непосредственно в культуральную среду в требуемом и достаточном количестве путем совместной экспрессии с SAM-P45, представляющей собой сериновую протеазу, происходящую из актиномицетов, в коринеформной бактерии, продуцирующей про-MTG.

Хотя способ, в котором активная трансглутаминаза непосредственно продуцируется путем совместной экспрессии про-MTG и протеазы, которая позволяет создать проструктурную часть про-MTG в коринеформной бактерии, считается исключительно эффективным способом продуцирования трансглутаминазы, субстратная специфичность SAM-P45 не так строга, и она может расщеплять и приводить к деградации не только проструктурной части про-MTG, но также в некоторой степени и самой трансглутаминазы, поэтому обращение с SAM-P45 может быть непростым. В случаях, когда используется SAM-P45, способ продуцирования трансглутаминазы должен быть строго контролируемым, иначе не будет происходить расщепления продуцируемой трансглутаминазы в культуральной среде.

Таким образом, еще оставалась потребность в протеазе, которая может избирательно отщеплять только проструктурную часть про-MTG и вызывать как можно меньшее избыточное расщепление самой трансглутаминазы для осуществления преимущественного продуцирования активной формы трансглутаминазы.

Известным ферментом, который отщепляет проструктурную часть про-MTG, кроме SAM-P45, является диспаза из Bacillus polymyxa (Eur. J. Biochem., vol. 257, p. 570-576 (1998)). Однако, для отщепления проструктурной части требуется большое количество фермента, и имеется риск избыточного расщепления самой трансглутаминазы. Кроме того, диспаза представляет собой реагент для культуры клеток, поскольку для индустриального применения данный фермент является дорогим.

Сущность изобретения

Еще остается необходимость в протеазе, которая может избирательно отщеплять только проструктурную часть про-MTG, и вызывать как можно меньшее избыточное расщепление самой трансглутаминазы для осуществления преимущественного продуцирования активной формы трансглутаминазы, как указывалось выше. Кроме того, если могли использоваться протеазы, способные избирательно отщеплять только проструктурную часть про-MTG и вызывать как можно меньшее избыточное расщепление самой трансглутаминазы, их полагали предпочтительными для продуцирования активной трансглутаминазы. Более того, если протеазы, подходящие для продуцирования трансглутаминазы, которые могут избирательно отщеплять проструктурную часть про-MTG, могли секретироваться из клетки, полагали, что они являются более предпочтительными, поскольку активная трансглутаминаза могла непосредственно продуцироваться в культуральную среду за счет совместной экспрессии протеаз с про-MTG.

Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление протеазы, которая может использоваться для продуцирования трансглутаминазы и которая избирательно отщепляет проструктурную часть про-MTG.

В частности, целью изобретения является предоставление протеазы, которая избирательно отщепляет проструктурную часть про-MTG, где указанная протеаза может продуцироваться за счет использования коринеформной бактерии в качестве хозяина и может секретироваться из клетки.

Целью изобретения также является предоставление молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную протеазу.

Другой целью изобретения является предоставление способа эффективного продуцирования MTG с использованием указанной протеазы.

Более того, целью изобретения является предоставление способа продуцирования указанной протеазы.

Авторами настоящего изобретения найдена протеаза, которая будет избирательно отщеплять проструктурную часть про-MTG, но будет вызывать как можно меньшее избыточное расщепление самой трансглутаминазы, и затем они смогли выделить и очистить нейтральную металлопротеазу, имеющую такое свойство. Авторами изобретения также получена ДНК, кодирующая указанную протеазу, которую вводили в коринеформную бактерию и затем успешно осуществляли ее секреторную экспрессию с использованием коринеформной бактерии в качестве хозяина. Кроме того, настоящий фермент действительно взаимодействовал с про-MTG с расщеплением проструктурной части и затем получали активную трансглутаминазу. Авторы изобретения осуществляли настоящее изобретение путем идентификации нейтральных металлопротеаз, происходящих из микроорганизмов из других источников, имеющих эквивалентную функцию, которые, как было подтверждено, также могут использоваться в качестве активных MTG.

То есть настоящее изобретение относится к нейтральной металлопротеазе из актиномицетов, имеющей высокую избирательность при отщеплении проструктурной части про-MTG, и к кодирующей ее молекуле нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования активной MTG, включающему отщепление проструктурной части про-MTG нейтральной металлопротеазой.

Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования указанной металлопротеазы, включающему введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную нейтральную металлопротеазу в коринеформную бактерию, культивирование коринеформной бактерии, в которую была введена указанная молекула нуклеиновой кислоты, с обеспечением за счет этого экспрессии указанной нейтральной металлопротеазы и получение указанной металлопротеазы, которая секретируется из клетки.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к нейтральной металлопротеазе SVP35 из актиномицетов, имеющей следующие свойства:

1) Молекулярная масса: около 35000 (измерена путем SDS-PAGE)

2) Оптимальное значение pH: 6,0-8,0, более конкретно 6,5-7,5, в частности, примерно 7,0

3) pH-стабильность: pH 4-10

4) Оптимальная температура: около 45°C

5) Температурная стабильность: стабильна при температуре ниже, чем примерно 50°C

6) Она сильно ингибируется этилендиаминотетрауксусной кислотой, 1,10-фенантролином и фосфорамидоном, которые являются ингибиторами металлопротеаз, и ингибитором субтилизина Streptomyces (SSI) из актиномицетов.

Настоящее изобретение также относится к нейтральной металлопротеазе SVP70, имеющей следующие свойства:

1) Молекулярная масса: около 71000 (измерена путем SDS-PAGE)

2) Оптимальное значение pH: 6,0-8,0, более конкретно 6,5-7,5, в частности, примерно 7,0

3) pH-стабильность: pH 5-10

4) Оптимальная температура: интервал около 50°C-55°С, в частности, примерно 55°С

5) Она испытывает сильное ингибирующее действие этилендиаминотетрауксусной кислоты, 1,10-фенантролина и фосфорамидона, которые являются ингибиторами металлопротеаз, дитиотреитола, который является SH-восстановителем, и ингибитора субтилизина Streptomyces (SSI), происходящего из актиномицетов.

Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную SVP35 или SVP70.

Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования активной MTG, включающему отщепление проструктурной части про-MTG указанной SVP35 или SVP70.

Более того, настоящее изобретение относится к способу продуцирования SVP35 или SVP70, включающему введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную SVP35 или SVP70 в коринеформную бактерию, культивирование коринеформной бактерии, в которую введена указанная молекула нуклеиновой кислоты, и получение SVP35 или SVP70, секретируемых из клеток.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, на котором показана зависимость активности SVP35 и SVP70 от рН.

Фиг.2 представляет собой график, на котором показана pH-стабильность SVP35 и SVP70.

Фиг.3 представляет собой график, на котором показана зависимость активности SVP35 и SVP70 от температуры.

Фиг.4 представляет собой график, на котором показана температурная стабильность SVP35.

На фиг.5 отображены ингибирующая активность различных соединений в отношении активности SVP35 и SVP70.

На фиг.6 отображены последовательные изменения преобразования про-MTG в активную форму MTG, осуществляемые за счет SVP35 и SVP70, в виде относительного изменения количества белка.

Фиг.7 (A) и (B) представляют собой графики, на которых изображено изменение активности трансглутаминазы во времени при взаимодействии про-MTG с SVP70 и SAM-P45, соответственно. (A): добавление SVP70, : добавленное количество 1/200 относительно субстрата, : добавленное количество 1/500 относительно субстрата; (B): добавление SAM-P45, : добавленное количество 1/10 относительно субстрата, : добавленное количество 1/50 относительно субстрата.

Фиг.8 (A) и (B) представляют собой графики, на которых отображено изменение количества белка MTG во времени при взаимодействии про-MTG с SVP70 и SAM-P45, соответственно. (A): добавление SVP70, : добавленное количество 1/200 относительно субстрата, : добавленное количество 1/500 относительно субстрата; (B): добавление SAM-P45, : добавленное количество 1/10 относительно субстрата, : добавленное количество 1/50 относительно субстрата.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

В общем известно, что секреторный белок транслируется в виде препептида или препропептида, и после этого его сигнальный пептид («пре-часть») отщепляется, приводя к преобразованию в зрелый пептид или пропептид, пропептид расщепляется в домене, называемом проструктурой, становясь зрелым пептидом. При использовании здесь данного термина проструктурная часть секреторного белка может просто называться «проструктурой». Кроме того, используемая здесь «сигнальная последовательность» относится к последовательности, которая расположена с N-конца предшественника секреторного белка и она не присутствует во встречающемся в природе зрелом белке, и «сигнальный пептид» относится к пептиду, который отщепляется от такого белка-предшественника. В общем сигнальная последовательность отщепляется протеазой после секреции из клетки.

При использовании здесь данного термина белок, который не содержит сигнальный пептид, но содержит проструктурную часть может называться «пробелок», например «протрансглутаминаза» или «про-MTG». При использовании здесь данного термина проструктурная часть секреторного белка может просто называться «проструктурой» или «проструктурной частью», и данные термины могут использоваться здесь взаимозаменяемо.

Среди протеаз, которые, как считается, могут легко экспрессироваться в коринеформной бактерии, авторы изобретения вначале провели поиск протеазы, имеющей высокую специфичность и избирательность в отношении интересующего субстрата, т.е. протеазы, которая избирательно отщепляет проструктурную часть про-MTG и вызывает как можно меньшее избыточное расщепление самой трансглутаминазы.

Когда MTG секретируется актиномицетами внеклеточно, полагают, что она вначале секретируется в виде про-MTG, с последующим отщеплением проструктурной части про-MTG, что приводит к образованию активной формы MTG (Eur. J. Biochem., vol. 257, p. 570-576 (1998)). В соответствии с этим авторы изобретения ожидали, что в актиномицетах, продуцирующих MTG, существует протеаза, которая отщепляет проструктурную часть про-MTG. Поскольку данная протеаза исходно представляет собой протеазу, которая отщепляет проструктурную часть, ожидается, что данная протеаза имеет высокую избирательность в отношении субстратов и расщепляет только проструктурную часть, при этом она действует на саму MTG в меньшей степени.

Кроме того, структурный ген про-MTG актиномицетов и структурный ген протеазы SAM-P45 могут эффективно экспрессироваться в коринеформной бактерии, и они могут секретироваться внеклеточно. Основываясь на данной информации, было выполнено значимое исследование, направленное на поиск интересующей протеазы из продуцирующей MTG бактерии, которая представляет собой актиномицет, и в результате было выявлено, что продуцирующий MTG штамм Streptoverticillium mobaraense характеризуется высокой избирательностью расщепление проструктурной части про-MTG и продуцирует новые нейтральные металлопротеазы, которые могут использоваться для продуцирования активной MTG. Авторами настоящего изобретения выделены и очищены данные нейтральные металлопротеазы и продемонстрированы их энзимологические характеристики. Более того, авторами изобретения определены аминокислотные последовательности N-концевых частей данных металлопротеаз и получены гены, кодирующие данные металлопротеазы.

Кроме того, авторы изобретения вводили ген данного фермента в коринеформной бактерии, обеспечивая его экспрессию в системе, где применяется коринеформная бактерия в качестве хозяина, и в результате фермент секреции. Более того, фермент действительно взаимодейстовал на про-MTG с проструктурной частью, что приводило к отщеплению проструктурной части с выходом активной трансглутаминазы. Также обнаружили нейтральные металлопротеиназы из микроорганизмов других источников, имеющие сходные функции, которые, как было выявлено, также могут использоваться для продуцирования активной формы MTG.

Здесь и далее будут иллюстрироваться более конкретные варианты осуществления настоящего изобретения.

Нейтральные металлопротеазы по настоящему изобретению могут быть получены с поверхностей культивируемых актиномицетов или из культуральной надосадочной жидкости актиномицетов, включая Streptoverticillium mobaraense, Streptomyces griseus, Streptomyces coelicolor и т.д.

В следующей части вначале описываются впервые обнаруженные нейтральные металлопротеазы Streptoverticillium mobaraense IFO13819.

Культивирование бактерии для получения нейтральной металлопротеазы по настоящему изобретению, например актиномицета, описанного выше, может проводиться по способам, обычно применяемым для культивирования актиномицетов. То есть в качестве среды для культуры может использоваться обычная среда, содержащая обычные источники углерода, источники азота, неорганические ионы и др. Глюкоза, крахмал и другое может использоваться в качестве источников углерода. Пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, соль аммония и другое может необязательно использоваться в качестве источника азота, если это необходимо. Культивирование может проводиться в аэробных условиях, которые надлежащим образом контролируются в пределах интервала рН от pH 5,0 до 8,5 и в температурном интервале от 15 до 37°C. Для продуцирования нейтральных металлопротеаз по настоящему изобретению культивирование предпочтительно продлевают до достижения максимального количества требуемой нейтральной металлопротеазы, и затем его можно прекратить. Хотя подходящий период культивирования зависит от температуры, pH и типа среды, обычно данный период предпочтительно составляет примерно от 1 до 12 суток. После периода культивирования культуру можно разделить на клетки и культуральную надосадочную жидкость путем центрифугирования или подобного способа.

Новые нейтральные металлопротеазы по настоящему изобретению могут быть получены из культуральной надосадочной жидкости, а также из выделенных клеток, в частности с поверхности клеток. Для очистки фермента могут адаптироваться любые способы, которые обычно применяют для очистки фермента, например способ высаливания сульфатом аммония, способ гель-фильтрации, ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография и тому подобное, протеаза может быть очищена более эффективно с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и т.д. Измерение ферментативной активности нейтральной металлопротеазы, полученной таким путем, может осуществляться путем взаимодействия фермента с пептидом, который содержит область, связывающую про-часть протрансглутаминазы и зрелую трансглутаминазу, например, с синтетическим пептидом Glu-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser (SEQ ID NO: 11) (Peptide Institute), в качестве субстрата, и расчета снижения количества субстрата.

Как указано выше, нейтральная металлопротеаза по изобретению, очищенная из выделенных клеток, в частности с поверхности клеток, или из надосадочной жидкости культуры, может анализироваться на предмет N-концевой аминокислотной последовательности на газофазовом аминокислотном секвенаторе для определения частичной аминокислотной последовательности. Более того, могут оцениваться ферментативные свойства (оптимальный pH, pH-стабильность, оптимальная температура, действие ингибитора и т.д.) выделенной и очищенной нейтральной металлопротеазы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нейтральную металлопротеазу, названную SVP35, получали с поверхности клеток Streptoverticillium mobaraense, а нейтральную металлопротеазу, названную SVP70, можно получить из культуральной надосадочной жидкости Streptoverticillium mobaraense.

В одном из осуществлений настоящего изобретения нейтральная металлопротеаза по изобретению представляет собой нейтральную металлопротеазу SVP35, имеющую следующие свойства:

1) Молекулярная масса: около 35000 (измерена путем SDS-PAGE)

2) Оптимальное значение pH: 6,0-8,0, более конкретно 6,5-7,5, в частности, примерно 7,0

3) pH-стабильность: pH 4-10

4) Оптимальная температура: около 45°C

5) Температурная стабильность: стабильна при температуре ниже чем примерно 50°C

6) Ингибиторы: она сильно ингибируется этилендиаминотетрауксусной кислотой, 1,10-фенантролином и фосфорамидоном, которые являются ингибиторами металлопротеаз, и ингибитором субтилизина Streptomyces (SSI), происходящим из актиномицетов.

В другом осуществлении настоящего изобретения нейтральная металлопротеаза по изобретению представляет собой нейтральную металлопротеазу SVP70, имеющую следующие свойства:

1) Молекулярная масса: около 71000 (измерена путем SDS-PAGE)

2) Оптимальное значение pH: 6,0-8,0, более конкретно 6,5-7,5, в частности, примерно 7,0

3) pH-стабильность: pH 5-10

4) Оптимальная температура: интервал около 50°C-55°С, в частности, примерно 55°С

5) Ингибиторы: она сильно ингибируется этилендиаминотетрауксусной кислотой, 1,10-фенантролином и фосфорамидоном, которые являются ингибиторами металлопротеаз, дитиотреитолом, который является SH-восстановителем, и ингибитором субтилизина Streptomyces (SSI), происходящего из актиномицетов.

Когда SVP35 или SVP70 взаимодействует с про-MTG, обе они характеризуются высокой избирательной активностью расщепления в отношении проструктурной части MTG. То есть, поскольку оба фермента характеризуются эффективным преобразованием про-MTG в активную MTG, в то время как активность в отношении деградации, полученной в результате активной MTG, является низкой, оба они являются подходящими ферментами для продуцирования активной MTG с использованием про-MTG в качестве сырого материала. N-концевые аминокислотные последовательности двух новых нейтральных металлопротеаз показаны в SEQ ID NO: 1 для SVP35, и в SEQ ID NO: 2 для SVP70, что выявляет гомологию между данными последовательностями. Поэтому проводился поиск белков, имеющих гомологию в отношении данных протеаз в их N-концевых аминокислотных последовательностей, обнаружили металлопротеазу SGMP II (J. Biochem. Vol. 110, p. 339-344 (1991)) из Streptomyces griseus, а также обнаружили три металлопротеазы (CAB76000, CAB76001, CAB69762 GenBank/EMBL/DDBJ) из Streptomyces coelicolor и т. п. Данные протеазы могут также использоваться тем же способом, что и SVP35 и SVP70, для избирательного расщепления проструктурной части про-MTG, и они могут использоваться для продуцирования активной MTG с использованием про-MTG а качестве сырого материала.

Далее описан способ продуцирования нейтральной металлопротеазы по настоящему изобретению по технологии рекомбинантной ДНК.

Известны некоторые примеры продуцирования полезных белков, включающих в себя ферменты, физиологически активные вещества и тому подобное, с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Преимущество применения способа рекомбинантной ДНК представляет собой возможность массового продуцирования полезных белков, которые в природе встречаются в минимальном количестве.

Для продуцирования нейтральной металлопротеазы по настоящему изобретению, с использованием технологии рекомбинантной ДНК, вначале получали генетическую конструкцию, которая содержит промотор, последовательность, кодирующую надлежащий сигнальный пептид, фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий нейтральную металлопротеазу по изобретению, и регуляторную последовательность (оператор или терминатор, и т.д.), которая необходима для экспрессии гена нейтральной металлопротеазы в коринеформной бактерии, в надлежащем положении, так что они могли бы функционировать. Нейтральная металлопротеаза по изобретению может иметь проструктурную часть на N-конце. Векторы, которые могут использоваться для данной конструкции, конкретно не ограничены и включают в себя любой вектор, который может функционировать в коринеформной бактерии, и они могут автономно реплицироваться, как плазмиды, или интегрироваться в хромосому бактерии. Когда в качестве хозяина используется коринеформная бактерия, в качестве вектора особенно предпочтительны плазмиды, происходящие из коринеформных бактерий. Они включают в себя, например, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984))) pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984), и модифицированные плазмиды, которые обладают генами лекарственной резистентности.

Примеры Corynebacterium, которые могут использоваться в качестве бактерий-хозяев по настоящему изобретению, включают в себя мутантные штаммы, происходящие из штаммов дикого типа, включающих в себя Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, Brevibacterium roseum ATCC13825, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC15990, Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871 и тому подобное, или мутантные штаммы, происходящие от мутантных штаммов данных диких типов.

Мутантные штаммы, которые используются по настоящему изобретению, включают в себя, например, мутантные штаммы, дефективные по способности продуцировать глутамат, штаммы, мутантные по продуцированию аминокислот, таких как лизин и тому подобное, и мутантные штаммы, модифицированные в плане продуцирования других веществ, таких как нуклеиновые кислоты, например инозин. Такие мутантные штаммы могут быть получены путем обработки ультрафиолетовым облучением или химическим мутагеном, таким как N-метил-N'-нитрозогуанидин и тому подобное, и затем выбора штаммов с увеличенной способностью к продуцированию-секреции белков.

В частности, Corynebacterium glutamicum AJ1203 (FERM BP-734) (исходное размещение в банке 26 марта 1984 г.) (в настоящее время National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония), которые выделяли из Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) дикого типа ATCC13869, в виде мутантного штамма, устойчивого к стрептомицину, как ожидается, имеет мутацию в функциональном гене, ассоциированном с секрецией белков, и его способность секретировать-продуцировать гетерологичные белки исключительно высока, составляя по накопленному количеству в 2 или в 3 раза больше по сравнению с родительским штаммом (штаммом дикого типа), в оптимальных условиях культивирования, так что он подходит в качестве бактерии хозяина (см. WO 02/081694). Кроме того, предпочтительно использовать в качестве хозяина штамм, который получали путем модификации данного штамма, так что данный штамм не будет более продуцировать белок клеточной поверхности, поскольку очистка гетерологичных белков, секретируемых в среду, станет проще, что особенно предпочтительно. Такая модификация может проводиться путем введения мутации в ген белка клеточной поверхности на хромосоме или в область регуляции его экспрессии путем мутагенеза или способов рекомбинации генов.

Примеры промоторов из коринеформных бактерий включают в себя промоторы генов белков клеточной поверхности PS1, PS2, и SlpA, промоторы генов биосинтетических систем различных аминокислот, например гена глутаминсинтетазы, гена аспартокиназы в системе биосинтеза лизина, и т.п.

Сигнальный пептид, который применяется по настоящему изобретению, представляет собой сигнальный пептид секреторного белка из коринеформной бактерии, хозяина, и предпочтительно представляет собой сигнальный пептид белка клеточной поверхности из коринеформной бактерии. Белки клеточной поверхности коринеформной бактерии включают в себя PS1 и PS2 из C. glutamicum (JP-Kokai № 6-502548) и SlpA из C. ammoniagenes (JP-Kokai № 10-108675).

Для продуцирования нейтральной металлопротеазы с сильной активностью в плане избирательного расщепления проструктуры про-MTG с использованием технологии рекомбинантной ДНК требуется ДНК, кодирующая такую нейтральную металлопротеиназу.

В одном из осуществлений настоящего изобретения нейтральную металлопротеазу SVP35 продуцируют с использованием технологии рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующая SVP35, может быть получена следующим образом.

Вначале определяют аминокислотную последовательность очищенной SVP35. Для определения такой аминокислотной последовательности может использоваться способ Эдмана (Edman, P., Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)). Для определения аминокислотной последовательности может использоваться газофазовый белковый секвенатор от Shimadzu Co. Ltd. Co. Ltd. и т.п.

Для нейтральной металлопротеазы SVC35 по изобретению путем секвенирования 20 аминокислотных остатков с N-конца обнаружена последовательность, показанная в SEQ ID NO: 1.

Данная информация может использоваться для синтеза подходящего праймера для ПЦР и получения зонда для получения нейтральной металлопротеиназы по настоящему изобретению. Например ген протеазы из актиномицетов, который, как ожидается, характеризуется гомологией на основе результатов поиска гомологии с N-концевой аминокислотной последовательностью, например ген металлопротеазы (GenBank/EMBL/DDBJ CAB76001) из Streptomyces coelicolor, может подвергаться ПЦР с использованием ДНК актиномицетов, полученной по способу Saito and Miura [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)], в качестве матрицы, для амплификации фрагмента гена, кодирующего данную протеазу. Амплифицированный фрагмент может использоваться в качестве зонда.

Затем ДНК актиномицетов, полученную способом Saito and Miura, например хромосомную ДНК Streptoverticillium mobaraense IFO13819, расщепляют различными подходящими ферментами рестрикции, например различными ферментами рестрикции, которые распознают последовательности из 6 оснований. Расщепленную хромосомную ДНК актиномицетов можно анализировать способами, хорошо известными специалистам в данной области, например способом блот-гибридизации по Саузерну, описанным в Molecular Cloning 2nd edition [J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9. 31 (1989)] и т.п., с использованием меченного ³²P ПЦР-продукта, полученного путем описанной выше ПЦР. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нейтральную металлопротеазу по настоящему изобретению или ее часть, может клонироваться путем получения фрагмента, гомологию которого в отношении использованного зонда подтверждали путем блоттинга по Саузерну, и клонирования его в подходящий вектор. Способы, необходимые для такого генного клонирования хорошо известны в данной области (см., например, J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1. 90 (1989)).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЦР проводят с использованием хромосомной ДНК Streptomyces coelicolor A3(2) в качестве матрицы для получения зонда. Далее одну полосу размером примерно 8 тыс.п.н., которая гибридизуется с меченными ³²P зондами, выявляют в продукте расщепления SphI хромосомной ДНК Streptoverticillium mobaraense IFO13819. Таким образом, хромосомную ДНК Streptoverticillium mobaraense IFO13819, полученную описанным выше способом, расщепляют с помощью SphI, фрагмент, примерно равный 8 тыс.п.н., получают посредством электрофореза в агарозном геле, полученный фрагмент вводят в участок SphI в pUC18, и затем его вводят в компетентные клетки Escherichia coli JM109 с образованием библиотеки. Интересующие клоны могут быть получены путем скрининга образованной библиотеки с использованием синтетического олигонуклеотида в качестве зонда по способам гибридизации колоний, описанным в Molecular Cloning 2nd edition (выше), и путем отбора штамма, который несет плазмиду, содержащую генный фрагмент SVP35, клонированный в плазмиду. Плазмиду, полученную из данного штамма, обозначают здесь как pVSV1. Анализируют последовательность нуклеотидов фрагмента, клонированного в pVSV1, предсказывают первичную аминокислотную структуру для подтверждения того, что данный фрагмент кодирует ранее установленную N-концевую аминокислотную последовательность. Таким образом, подтверждают, что полученный ген представляет собой ген, кодирующий SVP35.

Затем можно конструировать рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты для экспрессии нейтральной металлопротеазы по настоящему изобретению путем лигирования генетической конструкции, содержащей ДНК, кодирующую полученную металлопротеазу, с подходящим вектором в зависимости от свойств используемого хозяина. Клетки коринеформной бактерии-хозяина трансформируют рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты. Трансформированные клетки можно культивировать в подходящей среде с получением нейтральной металлопротеазы по настоящему изобретению, секретируемой или накапливаемой в среде и/или в клетке.

Следующим будет описан способ продуцирования активной MTG из про-MTG с использованием нейтральной металлопротеазы.

Нейтральная металлопротеаза, использованная в продуцировании активной MTG, может взаимодействовать с про-MTG в виде фракции, содержащей нейтральную металлопротеазу, полученную из культуральной среды бактерии, продуцирующей нейтральную металлопротеиназу. Также она может использоваться в виде более высокоочищенной нейтральной металлопротеазы с высокой специфичной активностью. Далее, как описаной ниже, может также использоваться нейтральная металлопротеаза, которая может быть получена путем культивирования клетки, трансформированной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, которая может быть получена путем соединения ДНК, кодирующей нейтральной металлопротеазы, имеющей высокую избирательную активность отщепления проструктурной части про-MTG.

Про-MTG, используемая для продуцирования MTG, может быть фракцией, содержащей про-MTG, полученной из культуральной среды продуцирующей про-MTG бактерии. Также может использоваться более высокоочищенная про-MTG. Взаимодействие можно проводить в условиях, в которых количество добавленной металлопротеазы, добавленной к про-MTG, составляет от 1/10 до 1/500 по массе, в которых температура взаимодействия подобрана в интервале от 15 до 50°C и интервал pH составляет от pH 5,0 до 9.

Кроме того, генетическая конструкция, которая получена как описано выше и которая содержит ДНК, кодирующую нейтральную металлопротеазу по настоящему изобретению, может вводиться в микроорганизм, содержащий генетическую конструкцию, кодирующую про-MTG, в частности в коринеформную бактерию, для продуцирования в одной бактериальной клетке и про-MTG, и нейтральной металлопротеазы по настоящему изобретению, притом, что про-MTG может преобразовываться в зрелую MTG в указанных выше условиях. Более подробный способ эффективного продуцирования про-MTG клетках коринеформной бактерии, генетическая конструкция, используемая для такого способа, и коринеформная бактерия, в которую вводят данную генетическую конструкцию, описаны, например, в WO 01/23591. Более конкретно, например, коринеформная бактерия, которая может эффективно осуществлять внеклеточную секрецию белка про-MTG, может быть получена введением генетической конструкции в коринеформную бактерию, где генетическая конструкция получена путем соединения последовательности, содержащей последовательность, кодирующую про-MTG, которая расположена ниже (в положении даунстрим) последовательности, кодирующей домен сигнального пептида коринеформной бактерии, в частности домен сигнального пептида белка клеточной поверхности, с соответствующим промотором ниже его. Сигнальный пептид, промотор и хозяин, которые могут использоваться для данной цели, могут быть выбраны из сигнальных пептидов, промоторов и хозяев, подходящих для экспрессии нейтральной металлопротеазы по настоящему изобретению, как указано выше. Сочетание векторов, которые совместимы в одной клетке, также известно специалистам в данной области. Таким образом, зрелую MTG можно получить путем введения подходящей генетической экспрессирующей конструкции, содержащей ДНК, кодирующую нейтральную металлопротеазу по настоящему изобретению, указанную выше, в коринеформную бактерию, продуцирующую про-MTG, или наоборот, путем введения подходящей генетической экспрессирующей конструкции, кодирующей про-MTG, в коринеформную бактерию, продуцирующую нейтральную металлопротеазу по настоящему изобретению, позволяя таким путем генетическим конструкциям, которые могут экспрессировать про-MTG и нейтральную металлопротеазу по настоящему изобретению, сосуществовать в одной и той же бактерии и путем поддержания