Способ получения дипептида (варианты)

Способ получения дипептида (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к удобному и экономичному способу получения дипептида без применения сложного способа синтеза, и, более конкретно, оно относится к гену пептидообразующего фермента, пептидообразующему ферменту и способу получения дипептида с использованием фермента.

Предшествующий уровень техники

Дипептиды используются в области фармацевтических препаратов и функциональных продуктов питания, а также в других различных областях. Например, L-аланил-L-глутамин используется в качестве компонента не содержащей сыворотки среды и применяется в качестве инфузионных компонентов, поскольку он обладает большей стабильностью и более высокой растворимостью, чем L-глутамин.

Химические способы синтеза, которые обычно известны как способы получения дипептидов, необязательно являются простыми. Известные примеры таких способов включают способ, в котором используется N-бензилоксикарбонилаланин (далее, "Z-аланин") и защищенный L-глутамин (см. Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739 (1961), Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966 (1962)), способ, в котором используется Z-аланин и защищенный метиловый эфир L-γ-глутаминовой кислоты (Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200 (1964)), способ, в котором используется эфир Z-аланина и незащищенная глутаминовая кислота (Выложенная публикация заявки на патент Японии No. H1-96194), и способ, в котором в качестве исходного вещества используется 2-замещенный пропионилгалогенид и в качестве промежуточного продукта синтезируют производное N-(2-замещенный)пропионилглутамина (Выложенная публикация заявки на патент Японии No. H6-234715).

Однако во всех таких способах требуется введение и удаление защитной группы или синтез промежуточного соединения, так что такие способы получения не являются достаточно удовлетворительными с точки зрения промышленного производства. Известные примеры типичных способов получения дипептидов с использованием ферментов включают реакцию конденсации с использованием N-защищенного, C-незащищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного, C-защищенного аминного компонента (реакция 1), и реакцию замещения с использованием N-защищенного, C-защищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного, C-защищенного аминного компонента (реакция 2). Примером реакции 1 является способ получения метилового эфира Z-аспартилфенилаланина из Z-аспарагиновой кислоты и метилового эфира фенилаланина (Выложенная публикация заявки на патент Японии No. S53-92729), тогда как примером реакции 2 является способ получения ацетилфенилаланиллейцинамида из этилового эфира ацетилфенилаланина и лейцинамида (Biochemical J., 163, 531 (1977)). Имеется весьма ограниченное число примеров научных публикаций, в которых описываются способы с использованием N-незащищенных, C-защищенных карбоксильных компонентов. Пример реакции замещения с использованием N-незащищенного, C-защищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного, C-защищенного аминного компонента (реакция 3) описан в патенте WO 90/01555, и примером такой реакции является способ получения амида аргиниллейцина из этилового эфира аргинина и амида лейцина. Пример реакции замещения с использованием N-незащищенного, C-защищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного, C-незащищенного аминного компонента (реакция 4) описан в патенте EP 278787A, и примером такой реакции является способ получения тирозилаланина из этилового эфира тирозина и аланина. Естественно, к числу способов, которые могут служить в качестве наименее дорогих, относятся те, которые попадают в диапазон реакции 4, когда число защитных групп в используемых компонентах является минимальным.

Однако фермент, использованный в примере предшествующего уровня техники для реакции 4 (Patent EP 278787A), представляет собой относительно дорогой препарат карбоксипептидазы, полученный из плесневых грибов и растений, и получаемые дипептиды содержали аминокислоты с относительно высокой степенью гидрофобности. Для реакции 4 отсутствуют известные способы, в которых используются ферменты бактериального или дрожжевого происхождения, и не известен способ получения аланилглутамина или аланиласпарагина высокой гидрофильности. При таких обстоятельствах существует необходимость разработки способа получения таких пептидов в промышленном масштабе и при низкой стоимости.

С другой стороны, пролиниминопептидаза представляет собой фермент, который катализирует реакцию, в результате которой N-концевой пролин отщепляется от пептида, содержащего на своем N-конце пролин, и известно, что данный фермент существует во многих видах организмов. Например, известно, что он существует в высших животных, таких как морские свинки (мозг) (J. Biol. Chem., 258, 6147-6154 (1983)), крысы (мозг и почки) (Eur. J. Biochem., 190, 509-515 (1990)), в высших растениях, например в абрикосовых косточках (J. Biochem., 92, 413-421 (1982)), ротовой полости спирохет, таких как Trichoderma denticola (Infect. Immun., 64, 702-708 (1996), нитевидных грибах, таких как Penicillium species (выложенная публикация заявки на патент Японии No. H1-215288), Basidiomycetes, таких как грибы шитаки (выложенная публикация заявки на патент Японии No. S58-36387), Actinomycetes, таких как Streptomyces plicatus (Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1250-1255 (1992), и бактериях, таких как Corynebacterium variabilis (J. Appl. Microbiol., 90, 449-456 (2001)).

Кроме того, сообщалось о клонировании и последовательности оснований генов пролиниминопептидаз Arthrobacter nicotiana (FEMS Microbiol. Lett., 78, 191-197 (1999)), Escherichia coli (публикация выложенной заявки на патент Японии No. H2-113887), Flavobacterium meningosepticum (Arch. Biochem. Biophys., 336, 35-41 (1996)), Hafnia alvei (J. Biochem., 119, 468-474 (1996)), Lactobacillus delbrueckii (Microbiology, 140, 527-535 (1994)), Bacillus coagulans (J. Bacteriol., 174, 7919-1925 (1994)), Aeromonas sobria (J. Biochem., 116, 818-825 (1994)), Xanthomonas campestris (публикация выложенной заявки на патент Японии No. H9-121860), Neisseria gonorrhoeae (Mol. Microbiol., 9, 1203-1211 (1993), Propionibacterium freundenreichii (Appl. Environ. Microbiol., 64, 4736-4742 (1998)), Serratia marcescens (J. Biochem., 122, 601-605 (1997)) и Thermoplasma acidophilum (FEBS Lett., 398, 101-105 (1996)).

Кроме того, в результате анализа полных геномов микроорганизмов недавно было сообщено о последовательностях оснований, которые, как прогнозируется, кодируют пролиниминопептидазу в многочисленных видах организмов. Например, опубликована последовательность оснований полного генома Pseudomonasaeruginosa (Nature, 406, 959 (2000)), и в нем была выявлена последовательность оснований, которая, как предполагается, кодирует пролиниминопептидазу.

С другой стороны, было установлено, что дипептид, содержащий пролин, образуется, когда эфир L-пролина или DL-пролина и альфа-аминокислота взаимодействуют в присутствии пролиниминопептидазы (Выложенная публикация заявки на патент Японии No. H3-13391). Однако, хотя пролиниминопептидаза представляет собой фермент, который катализирует реакцию с отщеплением N-концевого пролина от пептида, содержащего на своем N-конце пролин, и, естественно, можно было бы рассматривать получение пролиламинокислоты из эфира пролина и аминокислоты, синтез пептида из аминокислоты и эфира аминокислоты, отличающейся от пролина, с использованием пролиниминопептидазы совершенно не известен. Конечно, синтез L-аланил-L-глутамина из гидрохлорида этилового эфира L-аланина и L-глутамина также ранее не был известен. Кроме того, хотя частичная последовательность оснований пролиниминопептидазы Pseudomonas putida штамма ATCC 12633 описана (AF032970), какого бы то ни было исследования ее активности, включая ее выявление, не проводилось.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения дипептида промышленно выгодным и простым путем с использованием дешевого исходного материала и источника фермента, который можно дешево восполнять (такого как микробная культура, клетки микроорганизмов или обработанный продукт клеток микроорганизмов).

В результате интенсивного научного исследования с вышеуказанной целью авторы настоящего изобретения установили, что пролиниминопептидаза обладает способностью продуцировать пептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты. Кроме того, авторы настоящего изобретения также клонировали и экспрессировали ген данного фермента и четко продемонстрировали широкую субстратную специфичность фермента в отношении продуцирования пептида с использованием очищенных рекомбинантных ферментов, что привело к осуществлению настоящего изобретения.

Данное изобретение относится к способу получения дипептида, включающему обеспечение воздействия белка, обладающего пролиниминопептидазной активностью, на эфир L-аминокислоты и L-аминокислоту с образованием дипептида, где белок, обладающий пролиниминопептидазной активностью, происходит из микроорганизма, принадлежащего к роду Pseudomonas.

Предпочтительно, белок, обладающий пролиниминопептидазной активностью, происходит из Pseudomonas putida.

В предпочтительном осуществлении способа эфир L-аминокислоты представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из эфира L-аланина, эфира глицина, эфира L-валина, эфира L-изолейцина, эфира L-метионина, эфира L-фенилаланина, эфира L-серина, эфира L-треонина, эфира L-глутамина, эфира L-тирозина, эфира L-аргинина, α-эфира L-аспарагиновой кислоты, β-эфира L-аспарагиновой кислоты, эфира L-лейцина, эфира L-аспарагина, эфира L-лизина, α,β-диметилового эфира L-аспарагиновой кислоты и γ-эфира L-глутамина. L-аминокислота представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из L-глутамина, L-аспарагина, глицина, L-аланина, L-лейцина, L-метионина, L-пролина, L-фенилаланина, L-триптофана, L-серина, L-треонина, L-тирозина, L-лизина, L-аргинина, L-гистидина и L-глутаминовой кислоты.

Данное изобретение также относится к способу получения дипептида, включающему получение дипептида из эфира аминокислоты и аминокислоты с использованием культуры микроорганизма, принадлежащего к роду Pseudomonas и обладающего способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты, клеток микроорганизмов, выделенных из культуры, или обработанного продукта микроорганизма.

В предпочтительном осуществлении способа эфир L-аминокислоты представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из эфира L-аланина, эфира глицина, эфира L-валина, эфира L-изолейцина, эфира L-метионина, эфира L-фенилаланина, эфира L-серина, эфира L-треонина, эфира L-глутамина, эфира L-тирозина, эфира L-аргинина, α-эфира L-аспарагиновой кислоты, β-эфира L-аспарагиновой кислоты, эфира L-лейцина, эфира L-аспарагина, эфира L-лизина, α,β-диметилового эфира L-аспарагиновой кислоты и γ-эфира L-глутамина. L-аминокислота представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из L-глутамина, L-аспарагина, глицина, L-аланина, L-лейцина, L-метионина, L-пролина, L-фенилаланина, L-триптофана, L-серина, L-треонина, L-тирозина, L-лизина, L-аргинина, L-гистидина и L-глутаминовой кислоты.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к следующим объектам.

[1] Белок (A) или (B):

(A) белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 списка последовательностей,

(B) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, которая включает замещение, удаление, вставку, добавление или перестановку одной или множества аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 списка последовательностей, и обладающий продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью.

[2] Белок (C) или (D):

(C) белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15 списка последовательностей,

(D) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, которая включает замещение, удаление, вставку, добавление или перестановку одной или множества аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15 списка последовательностей, и обладающий продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью.

[3] Белок (E) или (F):

(E) белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17 списка последовательностей,

(F) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, которая включает замещение, удаление, вставку, добавление или перестановку одной или множества аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17 списка последовательностей, и обладающий продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью.

[4] ДНК (a) или (b):

(a) ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 57-1295 в последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей,

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 57-1295 в последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей, и кодирует белок, обладающий продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью.

[5] ДНК (c) или (d):

(c) ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 486-1496 в последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 14 списка последовательностей,

(d) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 486-1496 в последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 14 списка последовательностей, и кодирует белок, обладающий продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью.

[6] ДНК (e) или (f):

(e) ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 311-1279 в последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 16 списка последовательностей,

(f) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 311-1279 в последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 16 списка последовательностей, и кодирует белок, обладающий продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью.

[7] ДНК по любому из вышеуказанных пунктов [4]-[6], где жесткие условия представляют собой условия, при которых промывку проводят при 60°C и концентрации соли, эквивалентной 1 × SSC и 0,1% SDS.

[8] Рекомбинантная ДНК, включающая введенную в нее ДНК по любому из вышеуказанных пунктов [4]-[7].

[9] Трансформированная клетка, включающая введенную в нее ДНК по любому из вышеуказанных пунктов [4]-[7] таким образом, что ДНК способна экспрессировать кодируемый ею белок.

[10] Способ получения образующего дипептид фермента, включающий культивирование трансформированных клеток по пункту [9] в среде и накопление белка, обладающего продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью в среде и/или в трансформированных клетках.

[11] Способ получения дипептида, включающий получение дипептида из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты с использованием белка, обладающего продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью, который продуцируется в трансформированных клетках по пункту [9] выше.

[12] Способ получения дипептида по вышеуказанному пункту [11], где эфир L-аминокислоты представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из эфира L-аланина, эфира глицина, эфира L-валина, эфира L-изолейцина, эфира L-метионина, эфира L-фенилаланина, эфира L-серина, эфира L-треонина, эфира L-глутамина, эфира L-тирозина, эфира L-аргинина, α-эфира L-аспарагиновой кислоты, β-эфира L-аспарагиновой кислоты, эфира L-лейцина, эфира L-аспарагина, эфира L-лизина, α,β-диметилового эфира L-аспарагиновой кислоты и γ-эфира L-глутамина.

[13] Способ получения дипептида по указанному выше пункту [11] или [12], где L-аминокислота представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из L-глутамина, L-аспарагина, глицина, L-аланина, L-лейцина, L-метионина, L-пролина, L-фенилаланина, L-триптофана, L-серина, L-треонина, L-тирозина, L-лизина, L-аргинина, L-гистидина и L-глутаминовой кислоты.

[14] Способ получения дипептида, включающий предоставление белку, обладающему пролиниминопептидазной активностью, возможности реагировать с эфиром L-аминокислоты и L-аминокислотой с образованием дипептида.

[15] Способ получения дипептида по вышеуказанному пункту [14], где белок, обладающий пролиниминопептидазной активностью, происходит из микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium, Pseudomonas или Bacillus.

[16] Способ получения дипептида по вышеуказанному пункту [14], где белок, обладающий пролиниминопептидазной активностью, происходит из любого из Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida или Bacillus coagulans.

[17] Способ получения дипептида по любому из вышеуказанных пунктов [14]-[16], где эфир L-аминокислоты представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из эфира L-аланина, эфира глицина, эфира L-валина, эфира L-изолейцина, эфира L-метионина, эфира L-фенилаланина, эфира L-серина, эфира L-треонина, эфира L-глутамина, эфира L-тирозина, эфира L-аргинина, α-эфира L-аспарагиновой кислоты, β-эфира L-аспарагиновой кислоты, эфира L-лейцина, эфира L-аспарагина, эфира L-лизина, α,β-диметилового эфира L-аспарагиновой кислоты и γ-эфира L-глутамина.

[18] Способ получения дипептида по любому из пунктов [14]-[17] выше, где L-аминокислота представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из L-глутамина, L-аспарагина, глицина, L-аланина, L-лейцина, L-метионина, L-пролина, L-фенилаланина, L-триптофана, L-серина, L-треонина, L-тирозина, L-лизина, L-аргинина, L-гистидина и L-глутаминовой кислоты.

[19] Способ получения дипептида, включающий получение дипептида из эфира аминокислоты и аминокислоты с использованием культуры микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium, Pseudomonas или Bacillus и обладающего способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты, клеток микроорганизмов, выделенных из культуры, или обработанного продукта микроорганизма.

[20] Способ получения дипептида по вышеуказанному пункту [19], где эфир L-аминокислоты представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из эфира L-аланина, эфира глицина, эфира L-валина, эфира L-изолейцина, эфира L-метионина, эфира L-фенилаланина, эфира L-серина, эфира L-треонина, эфира L-глутамина, эфира L-тирозина, эфира L-аргинина, α-эфира L-аспарагиновой кислоты, β-эфира L-аспарагиновой кислоты, эфира L-лейцина, эфира L-аспарагина, эфира L-лизина, α,β-диметилового эфира L-аспарагиновой кислоты и γ-эфира L-глутамина.

[21] Способ получения дипептида по вышеуказанному пункту [19], где L-аминокислота представляет собой один или несколько представителей, выбранных из группы, состоящей из L-глутамина, L-аспарагина, глицина, L-аланина, L-лейцина, L-метионина, L-пролина, L-фенилаланина, L-триптофана, L-серина, L-треонина, L-тирозина, L-лизина, L-аргинина, L-гистидина и L-глутаминовой кислоты.

Другие цели, отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения более конкретно указаны или станут очевидными из следующего подробного описания изобретения, при его рассмотрении в сочетании с прилагающимся чертежом.

Краткое описание чертежа

Чертеж представляет собой график, иллюстрирующий дипептид-продуцирующую активность при добавлении ингибитора.

Наилучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к новому белку, обладающему продуцирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью, ДНК, кодирующей данный белок, и способу получения дипептида с их использованием. Реакция, по которой происходит образование дипептида в способе получения дипептида по настоящему изобретению, показана далее на реакционной схеме. Как иллюстрируют следующие химические формулы, термин «дипептид», как он использован в данном описании, относится к пептидному полимеру, имеющему одну дипептидную связь.

R₁-CH(NH₂)-COOR+H₂N-CH(COOH)-R₂→R₁-CH(NH₂)-CONH-CH(COOH)-R₂+ROH

(где R представляет собой замещенную или незамещенную углеводородную цепь, R₁ представляет собой боковую цепь эфира аминокислоты, и R₂ представляет собой боковую цепь аминокислоты.)

Эфиры аминокислот представляют собой соединения, которые имеют невысокую стоимость. Способ по настоящему изобретению, в котором исходные вещества в виде эфира аминокислоты и незащищенной аминокислоты взаимодействуют в водном растворе с использованием бактерий, дрожжей и так далее в качестве источника фермента, представляет собой новый способ получения дипептида и дает возможность дешево получать дипептиды, полезные для использования в фармацевтических препаратах и функциональных продуктах питания.

Далее настоящее изобретение будет описано подробно в следующем порядке:

[I] Микроорганизмы, обладающие способность продуцировать дипептиды из эфиров L-аминокислот и L-аминокислот.

[II] Выделение ДНК, кодирующей белок, обладающий продуцирующей пептид активностью.

[III] Свойства продуцирующего пептид фермента.

[IV] Способ получения дипептида.

[I] Микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать дипептиды из эфиров L-аминокислот и L-аминокислот.

Микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать дипептиды из эфиров L-аминокислот и L-аминокислот, можно использовать без каких-либо особых ограничений в качестве микроорганизма, используемого по настоящему изобретению. Примеры микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать дипептиды из эфиров L-аминокислот и L-аминокислот, включают виды Bacillus, виды Corynebacterium и виды Pseudomonas, конкретные примеры которых указаны ниже.

Bacillus subtilis ATCC 6633

Bacillus coagulans EK01 (J. Bacteriol. 174, 7919-7925 (1992))

Corynebacterium glutamicum ATCC 13286

Pseudomonas putida AJ-2402 FERM BP-8101

Pseudomonas putida ATCC 12633

Pseudomonas putida AJ-2048 FERM BP-8123

Перечисленные выше штаммы микроорганизмов, которые указаны под ATCC номерами, депонированы в Американской коллекции типовых культур (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110), и субкультуры могут быть предоставлены при ссылке на каждый номер.

Перечисленные выше штаммы микроорганизмов, которые указаны под FERM номерами, депонированы в независимой административной корпорации, Международный депозитарий патентных организмов Национального института передовой промышленной науки и технологии (International Patent Organism Depositary of the National Institute for Advanced Industrial Science and Technology) (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония), и им были присвоены депозитные номера. Штамму Pseudomonas putida AJ-2402, который был депонирован в независимой административной корпорации, Международный депозитарий патентных организмов Национального института передовой промышленной науки и технологии, 1 октября 2001, присвоен депозитный номер FERM P-18544, контроль данного штамма позднее был передан на международное депонирование 1 июля 2002, и ему был присвоен депозитный номер FERM BP-8101. Отметим, что FERM BP-8101 (AJ-2402) был идентифицирован как указанный выше Pseudomonas putida на основании последующего классификационного эксперимента. Кроме того, штамм AJ-2048 Pseudomonas putida был депонирован в независимой административной корпорации, Международный депозитарий патентных организмов Национального института передовой промышленной науки и технологии 22 июля 2002, и ему был присвоен депозитный номер FERM BP-8123.

Штамм FERM BP-8101 Pseudomonas putida представляет собой подвижную аконидальную палочку, которая была идентифицирована как бактерия, принадлежащая к роду Pseudomonas на основании таких свойств, как принадлежность к грамотрицательной палочке (0,7 до 0,8 × 1,5 до 2,0 микрометров (мкм)), которая не образует спор, является подвижной, образует круглые блестящие колонии кремового цвета с полностью гладкой или волнистой границей, растет при 30°C и является каталаза-положительной, оксидаза-положительной и отрицательной по OF-тесту (глюкоза). Более того, он был идентифицирован как Pseudomonas putida на основании таких физиологических свойств как то, что он является отрицательным в отношении нитратного восстановления, отрицательным в отношении продуцирования индола, отрицательным в отношении кислотного продуцирования из глюкозы, аргининдигидролаза-положительным, уреаза-отрицательным, отрицательным в отношении эскулинового гидролиза, отрицательным в отношении желатинового гидролиза, β-галактозидаза-отрицательным, положительным в отношении ассимиляции глюкозы, отрицательным в отношении ассимиляции L-арабинозы, положительным в отношении ассимиляции D-маннозы, положительным в отношении ассимиляции D-маннита, отрицательным в отношении ассимиляции N-ацетил-D-глюкозамина, отрицательным в отношении ассимиляции мальтозы, положительным в отношении ассимиляции глюконата калия, положительным в отношении ассимиляции н-каприновой кислоты, отрицательным в отношении ассимиляции адипиновой кислоты, положительным в отношении ассимиляции dl-яблочной кислоты, положительным в отношении ассимиляции цитрата натрия, положительным в отношении ассимиляции фенилацетата, оксидаза-положительным, положительным в отношении продуцирования флуорохрома на агаровой среде King's B, положительным в отношении продуцирования левана из сахарозы и слабо ассимилирующим сорбит.

В качестве данных микроорганизмов можно использовать дикие штаммы или мутантные штаммы, а также можно использовать рекомбинантные штаммы и тому подобные, полученные слиянием клеток, генетическими манипуляциями или другими генетическими способами.

Для получения клеток данных микроорганизмов микроорганизмы можно культивировать и выращивать в подходящей среде. Не имеется особенного ограничения для среды, используемой в этих целях до тех пор, пока она позволяет микроорганизмам расти. Данная среда может представлять собой обычную среду, содержащую обычные источники углерода, источники азота, источники фосфора, источники серы, неорганические ионы и органические источники питания при необходимости.

Например, можно использовать любой источник углерода до тех пор, пока вышеуказанные микроорганизмы могут его использовать, и конкретные примеры такого источника, который можно использовать, включают сахара, такие как глюкоза, фруктоза, мальтоза и амилоза, спирты, такие как сорбит, этанол и глицерин, органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота, уксусная кислота и пропионовая кислота и их соли, углеводороды, такие как парафин, и их смеси.

Примеры источников азота, которые могут использоваться, включают соли аммония неорганических кислот, такие как сульфат аммония и хлорид аммония, соли аммония органических кислот, такие как фумарат аммония и цитрат аммония, нитраты, такие как нитрат натрия и нитрат калия, органические азотсодержащие соединения, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и кукурузный крепкий солод, а также их смеси.

Кроме того, источники питания, используемые в обычных средах, такие как неорганические соли, редкие металлы и витамины, также можно смешивать подходящим образом и использовать.

Не имеется особенного ограничения к условиям культивирования, и культивирование можно проводить, например, в течение примерно от 12 до 48 часов при контролировании подходящим образом рН и температуры в диапазоне рН от 5 до 8 и диапазоне температуры от 15 до 40°C в аэробных условиях.

[II] Выделение ДНК, кодирующей белок, обладающей активностью продуцирующего пептид фермента.

[II-1] Выделение ДНК.

Авторы настоящего изобретения выделили и определили последовательность ДНК по настоящему изобретению, которая кодирует белок, обладающий синтезирующей дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты активностью. ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 57-1295 в последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей, была выделена из штамма ATCC 13286 Corynebacterium glutamicum. Кроме того, ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 486-1496 в последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14 списка последовательностей, была выделена из штамма ATCC 12633 Pseudomonas putida. Помимо этого, ДНК с последовательностью оснований, состоящей из оснований с номерами 311-1279 в последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16 списка последовательностей, была выделена из штамма FERM BP-8123 Pseudomonas putida. Отметим, что в настоящем описании выражения «последовательность оснований, представленная в SEQ ID NO: 4», «последовательность оснований, представленная в SEQ ID NO: 14» и «последовательность оснований, представленная в SEQ ID NO: 16» относятся к CDS частям, если специально не указано другого.

Показан пример выделения ДНК. Во-первых, первоначально определяют аминокислотную последовательность очищенного продуцирующего пептид фермента. Аминокислотная последовательность может быть определена с использованием способа Эдмана (Edman) (смотри Edman, P., Acta Chem. Scand., 4, 227 (1950)). Кроме того, аминокислотная последовательность также может быть определена с использованием секвенатора, производимого Applied Biosystems. Аминокислотную последовательность определяют для N-концевого участка или примерно от 10 до 30 остатков пептида, полученного обработкой лизилэндопептидазой и так далее для очищенного пептидообразующего фермента; и на основании определенной аминокислотной последовательности может быть выведена последовательность оснований ДНК, которая ее кодирует. Для выведения последовательности оснований ДНК используются универсальные кодоны.

Затем синтезируют молекулу ДНК из примерно 30 пар оснований на основании выведенной последовательности оснований. Способ синтеза молекулы ДНК описан в Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981). Кроме того, молекула ДНК может быть синтезирована с использованием секвенатора, производимого Applied Biosystems. Затем ДНК, которая кодирует пептидообразующий фермент, может быть амплифицирована из хромосомной ДНК с помощью метода ПЦР при использовании молекулы ДНК в качестве праймера. Однако, поскольку ДНК, которая была амплифицирована с использованием метода ПЦР, не содержит полноразмерную ДНК, которая кодирует пептидообразующий фермент, полноразмерную ДНК, кодирующую пептидообразующий фермент, выделяют из библиотеки хромосомных генов клеток различных микроорганизмов, таких как Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida или Bacillus subtilis, с использованием ДНК, амплифицированной методом ПЦР, в качестве зонда.

Альтернативно, в том случае, когда известна часть последовательности оснований гена, полноразмерная ДНК, которая кодирует пептидообразующий фермент, может быть выделена из библиотеки хромосомных генов с использованием в качестве зонда ДНК, которая имеет известную последовательность.

Кроме того, в том случае, когда последовательность оснований гена гомологична известной последовательности, полноразмерная ДНК, которая кодирует пептидообразующий фермент, может быть выделена из библиотеки хромосомных генов с использованием в качестве зонда ДНК, которая имеет известную последовательность.

Методика метода ПЦР описана, например, White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989). Способ получения хромосомной ДНК, так же как и способ выделения целевой молекулы ДНК из библиотеки генов с использованием молекулы ДНК в качестве зонда, описаны в Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989).

Способ определения последовательности оснований выделенной ДНК, которая кодирует пептидообразующий фермент, описана в A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985). Кроме того, последовательность оснований также может быть определена с использованием ДНК-секвенатора (Applied Biosystems). ДНК, которые кодируют пептидообразующие ферменты, выделенные таким образом из штамма ATCC 13286 Corynebacterium glutamicum, штамма ATCC 12633 Pseudomonas putida и штамма FERM BP-8123 Pseudomonas putida, представлены в последовательностях SEQ ID NO: 4, 14 и 16 соответственно.

ДНК, которые можно использовать в настоящем изобретении, представляют собой не только ДНК, определенные последовательностями SEQ ID NO: 4, 14 и 16. Например, в случае ДНК SEQ ID NO: 4, выделенной из штамма ATCC 13286 Corynebacterium glutamicum ниже, даже та ДНК, которая была получена внесением искусственной мутации в ДНК, которая кодирует пептидообразующий фермент и может быть выделена из хромосомной ДНК штамма ATCC 13286 Corynebacterium glutamicum, также представляет собой ДНК по настоящему изобретению, если она кодирует пептидообразующий фермент. Часто используемым способом для искусственного мутирования ДНК является способ сайт-направленного мутагенеза, описанный в Methods in Enzymol., 154 (1987).

Кроме того, ДНК, имеющая последовательность оснований, которая гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей, и кодирующая белок, обладающий пептидообразующей активностью, также может быть использована в качестве ДНК по настоящему изобретению.

Кроме того ДНК, по существу идентичная ДНК по настоящему изобретению, также может быть получена выделением ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с зондом, полученным на основе ДНК, состоящей из CDS, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей, и кодирует белок, обладающий активностью пептидообразующего фермента. Зонд может быть получен в соответствии с разработанными способами на основе, например, последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей. Дополнительно, способ, в котором целевую ДНК выделяют с использованием зонда и отбора ДНК, которая гибридизуется с ним, также может быть осуществлен в соответствии с разработанными способами. Например, ДНК-зонд может быть получен амплификацией последовательности оснований, клонированной в плазмидном или фаговом векторе, и экстрагированием последовательности оснований, желаемой для использования в качестве зонда, путем расщепления с помощью фермента рестрикции. Положение, в котором последовательность расщепляют, может быть отрегулировано в соответствии с ДНК-мишенью.

Термин «жесткие условия», используемый в данном описании, относится к условиям, при которых образуется так называемый специфический гибрид, тогда как неспецифические гибриды не образуются. Хотя трудно четко определить данные условия, примеры таких условий включают условия, при которых ДНК, имеющая высокую степень гомологии, такая как ДНК, имеющая 50% гомологии или более, предпочтительно 80% или более, и более предпочтительно 90% или более, гибридизуется, тогда как ДНК, имеющая низкую степень гомологии не гибридизуется; или условия, при которых ДНК гибридизуется при 60°C и концентрации соли, эквивалентной 1×SSC и 0,1% SDS, которые представляют собой условия промывки при стандартной гибридизации по Саузерну, предпочтительно при 60°C и концентрации соли, эквивалентной 0,1 × SSC и 0,1% SDS, и более предпочтительно при 65°С и концентрации соли, эквивалентной 0,1×SSC и 0,1% SDS. Активность пептидообразующего фермента является такой, как объяснялось ранее. Однако в случае последовательности оснований, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью оснований, комплементарной последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей, предпочтительно сохраняется 10% или более и предпочтительно 50% или более ферментативной активности белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей при условиях 50°C и pH 8.

Более того, белок, по существу идентичный пептидообразующему ферменту, кодированному ДНК, представленной в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей, также можно использовать в настоящем изобретении. Таким образом, ДНК, которая кодирует «белок, имеющий аминокислотную последовательность, включающую замещение, удаление, вставку, добавление или перестановку местами одной или множества аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5 списка последовательностей, и обладающий катализирующей реакцию активностью пептидообразующего фермента, который продуцирует дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты», также может использоваться в настоящем изобретении. Термин «множество» относится к такому диапазону аминокислотных остатков, которое существенно не затрагивает трехмерную структуру белка или активность пептидообразующего фермента, и более конкретно, имеет величину от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 30 и более предпочтительно от 2 до 10. В дополнение, активность пептидообразующего фермента является такой, как объяснено ранее. Однако в случае аминокислотной последовательности, вкл