Высококонцентрированные композиции антител и белков

Высококонцентрированные композиции антител и белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к высококонцентрированным композициям антител, которые являются особенно подходящими для подкожного введения. Кроме того, изобретение относится к стабильным высококонцентрированным (например, ≥100 мг/мл белка) жидким композициям.

Описание предшествующего уровня техники

Существует значительная потребность в высококонцентрированных жидких композициях антител. Однако с высококонцентрированными композициями белков связаны некоторые проблемы. Одной проблемой является нестабильность вследствие образования частиц. В случае восстановленных лиофилизированных препаратов с получением жидких композиций эта проблема может быть преодолена путем использования поверхностно-активных веществ (например, полисорбата), но поверхностно-активные вещества непригодны для жидких композиций, так как они делают затруднительной последующую обработку. Кроме того, поверхностно-активные вещества в дальнейшем не уменьшают повышенную вязкость, обусловленную многочисленными межмолекулярными взаимодействиями вследствие макромолекулярной природы антител.

Хотя было показано, что поверхностно-активные вещества значительно снижают степень образования частиц белков, они не решают проблему повышенной вязкости, которая затрудняет манипуляцию и введение концентрированных композиций антител. Антитела имеют тенденцию к образованию вязких растворов при высокой концентрации вследствие их макромолекулярной природы и способности к межмолекулярным взаимодействиям. Кроме того, в качестве стабилизаторов часто используют большие количества фармацевтически приемлемых сахаров. Такие сахара могут усиливать межмолекулярные взаимодействия, повышая тем самым вязкость композиции. Композиции с высокой вязкостью трудны в получении, ими трудно наполнять шприц и подкожно вводить. Применение силы при манипулировании вязкими композициями приводит к избыточному образованию пены, что может приводить к денатурации и инактивации активных биологических веществ. Удовлетворительное решение этой проблемы отсутствует.

Хотя известный уровень техники указывает на многочисленные примеры эксципиентов, которые могут быть подходящим образом использованы для создания фармацевтических композиций, очень немногие белки могут быть успешно получены с концентрацией около 100 мг/мл и очень немногие способы для такого получения были описаны.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что аргинин, в частности аргинин-HCl, является особенно подходящим для высококонцентрированных жидких композиций белков или антител.

Стабильные изотонические лиофилизированные композиции белков описаны в публикации РСТ WO 97/04801, опубликованной 13 февраля 1997 года, полное описание которой приведено здесь в качестве ссылки. Описанные лиофилизированные композиции могут быть восстановлены с получением высококонцентрированных белковых жидких композиций без видимой потери стабильности. Однако возможные проблемы, связанные с высокой вязкостью этих восстановленных композиций, не решаются. Агрегацию белков ранее снижали добавлением сахаров, но тем самым могли разительно повысить вязкость и осмолярность, делая посредством этого непрактичными обработку и использование.

Авторы публикации РСТ заявки WO02/30463, опубликованной 18 апреля 2002 года, описывают композиции с высокой концентрацией белка, но низкой вязкостью, что достигается: 1) посредством низкого рН (около 4,0-5,3); 2) посредством высокого рН (около 6,5-12,0) или 3) увеличением общей ионной силы композиции путем добавления солей или буферов. Однако хотя увеличение ионной силы действительно снижает вязкость композиции (например, с использованием NaCl), такое увеличение также может приводить к увеличенной мутности раствора, которая часто связана с образованием белковых частиц (например, агрегацией). Таким образом, оптимальная высококонцентрированная белковая композиция должна преодолеть проблемы стабильности, вязкости, осмолярности и мутности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к высококонцентрированным композициям белков и антител, которые являются стабильными и имеют низкую вязкость и мутность.

В частности, настоящее изобретение относится к высококонцентрированным композициям антител низкой вязкости, содержащим белок или антитело (100-260 мг/мл), гистидин (10-100 мМ), аргинин-HCl (50-200 мМ) и полисорбат (0,01%-0,1%), имеющим рН 5,5-7,0, вязкость 50 сСт или менее и осмолярность 200 мОсм/кг-450 мОсм/кг. Альтернативно белок или антитело в этих композициях может быть в диапазоне 120-260 мг/мл, альтернативно 150-260 мг/мл, альтернативно 180-260 мг/мл, альтернативно 200-260 мг/мл белка или антитела. Альтернативно концентрация аргинина-HCl находится в диапазоне 100-200 мМ, альтернативно 150-200 мМ, альтернативно 180-200 мМ.

Альтернативно настоящее изобретение относится к высококонцентрированным композициям антител низкой мутности, содержащим антитело (40-150 мг/мл), гистидин (10-100 мМ), сахар (например, трегалозу или сахарозу, 20-350 мМ) и полисорбат (0,01%-0,1%).

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей высокие концентрации высокомолекулярных белков, таких как антитела или иммуноглобулины. Эти антитела могут быть, например, антителами, направленными против конкретно заданного антигена. В конкретном аспекте этим антигеном является IgE (например, rhuMAbE-25 и rhuMAbE-26, описанные в патенте США 6329509 и WO 99/01556). Альтернативно анти-IgE-антителом может быть антитело CGP-5101 (Hu-901), описанное Corne et al., J. Clin. Invest. 99(5): 879-887 (1997), WO 92/17207, и АТТС Deposit Nos. BRL-10706 и 11130, 11131, 11132, 11133. Альтернативно антиген может включать в себя: белки CD CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 и CD40; члены семейства HER, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; 2С4, 4D5, PSCA, LDP-2, молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и интегрин αv/β3, в том числе его α- и β-субъединица (например, анти-CD11а-, анти-CD18- или анти-CD11β-антитела); факторы роста, такие как VEGF; антигены групп крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl, CTLA-4 и белок С.

Композиции по настоящему изобретению могут быть фармацевтическими композициями. В конкретном аспекте композиция доставляется подкожно.

Еще в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактического или терапевтического, нарушения, лечение которого может осуществляться белком или антителом композиции, который предусматривает введение описанных здесь композиций, содержащих терапевтически эффективное количество белка или антитела. Такие композиции могут использоваться, в частности, для подкожного введения. В конкретном аспекте нарушением является IgE-опосредованное нарушение. Еще в одном конкретном аспекте IgE-опосредованным нарушением является аллергический ринит, астма (например, аллергическая астма и неаллергическая астма), атопический дерматит, аллергическая гастроэнтеропатия, гиперчувствительность (например, анафилаксия, крапивница, пищевые аллергии и т.д.), аллергический бронхо-легочный аспергиллез, паразитарные заболевания, интестициальный цистит, гипер-IgE-синдром, атаксия-телеангиэктазия, синдром Вискотта-Олдрича, алимфоплазия вилочковой железы, IgE-миелома и реакция трансплантат против хозяина.

Еще в одном из вариантов осуществления изобретение относится к изделию, включающему в себя контейнер, содержащий композицию, описанную здесь. В одном из аспектов, изделие является заранее наполненным шприцом. В другом конкретном аспекте заранее наполненный шприц дополнительно находится в инъекционном устройстве. В другом конкретном аспекте инъекционным устройством является шприц для самоинъекции.

Краткое описание графического материала

Фигура 1. Гидрофобная хроматография расщепленного пепсином моноклонального анти-IgE-антитела. Образцы готовили при разных рН и в разных буферах: (•) 20 мМ ацетат, (Δ) 20 мМ сукцинат, (▴) 20 мМ Na₂НРО₄, () 20 мМ К₂РО₄ и (*) 20 мМ Трис-буфер. Образцы хранили при 30^оС в течение 6 месяцев.

Фигура 2. Гель-фильтрационная хроматография моноклонального анти-IgE-антитела, которое хранили при 40^оС в течение 6 месяцев. Образцы готовили при разных рН и в разных буферах: (▪) 20 мМ глутамат, (•) 20 мМ ацетат, (Δ) 20 мМ сукцинат, (□) 20 мМ гистидин, (▴) 20 мМ Na₂НРО₄, (▾) 20 мМ К₂РО₄ и (*) 20 мМ Трис-буфер.

Фигура 3. Активность моноклонального анти-IgE-антитела, которое хранили при 30^оС в течение 6 месяцев. Образцы готовили при разных рН и в различных буферах: (•) 20 мМ ацетат, (Δ) 20 мМ сукцинат, (□) 20 мМ гистидин, (▴) 20 мМ Na₂НРО₄, (▾) 20 мМ К₂РО₄ и (*) 20 мМ Трис-буфер.

Фигура 4. Эффект полисорбата 20 на мутность подвергнутого стрессу моноклонального IgE-антитела. Образцы содержат 100 мг/мл антитела, 20 мМ сукцината, 192 мМ трегалозы и различные количества полисорбата 20 при рН 6,0. Концентрации полисорбата равны (▪) 0, (▴) 0,01%, (•) 0,02% и (Δ) 0,05%.

Фигура 5. Мутность моноклонального анти-IgE-антитела при ˜150 мг/мл с различными эксципиентами (▴) CaCl₂, (▿) MgCl₂ и (Δ) аргинин-HCl.

Фигура 6. Мутность моноклонального анти-IgE-антитела при ˜150 мг/мл с различными эксципиентами. Образцы хранили при (▴) -70^оС, (▪) 2-8^оС, (Δ) 15^оС, (□) 30^оС и (▿) 40^оС.

Фигура 7. Анализы с использованием гиброфобной хроматографии расщепленного папаином моноклонального анти-IgE-антитела. Образцы готовили при ˜150 мг/мл с различными эксципиентами и хранили при (▾) -70^оС, (▪) 2-8^оС, (▴) 15^оС, (Δ) 30^оС и (□) 40^оС.

Фигура 8. Гель-фильтрационная хроматография моноклонального анти-IgE-антитела при ˜150 мг/мл в (▪) 200 мМ аргинине-HCl, 23 мМ гистидине, рН 6,0; (▴) 182 мМ аргинине-HCl, 20 мМ гистидине, рН 6,0, (•)182 мМ аргинине-HCl, 20 мМ гистидине, 91 мМ сахарозе, рН 6,0, (□) 50 мМ MgCl₂, 27 мг/мл трегалозе, 0,01% ацетате, (Δ) 50 мМ MgCl₂, 30 мМ MgAc₂, 0,01% ацетате и (ξ) 50 мМ MgCl₂, 45 мМ MgAc₂, 0,01% ацетате. Образцы хранили при 30^оС в течение 6 месяцев.

Фигура 9. Анализы с использованием гидрофобной хроматографии расщепленного папаином моноклонального анти-IgE-антитела. Образцы готовили в (▪) 200 мМ аргинине-HCl, 23 мМ гистидине; (▴) 182 мМ аргинине-HCl, 20 мМ гистидине, (•) 182 мМ аргинине-HCl, 20 мМ гистидине, 91 мМ сахарозе, (□) 50 мМ MgCl₂, 27 мг/мл трегалозе, 0,01% ацетате, (Δ) 50 мМ MgCl₂, 30 мМ MgAc₂, 0,01% ацетате и (о) 50 мМ MgCl₂, 45 мМ MgAc₂, 0,01% ацетате. Образцы хранили при 30^оС в течение 6 месяцев.

Фигура 10. Показано сравнение полноразмерных последовательностей вариабельной и константной областей анти-IgE-антител Е25, Е26 и Hu-901. Район CDR Hu-901 подчеркнут. Для Е25 и Е26 районы CDR, определенные согласно Chotia, показаны жирным шрифтом, тогда как районы CDR, определенные согласно Kabat, заключены в скобки. На фигуре 10А показана последовательность легких цепей Е25, Е26 и Hu-901 (SEQ ID NO:1-3), тогда как на фигуре 10В показана последовательности тяжелых цепей Е25, Е26 и Hu-901 (SEQ ID NO:4-6).

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

I. Определения

Под «белком» понимают последовательность аминокислот, у которых длина цепи является достаточной для образования более высоких уровней третичной и/или вторичной структуры. Таким образом, белки отличаются от «пептидов», которые также являются молекулами, построенными на основе аминокислот, которые не имеют такой структуры. Обычно белок, как используют здесь, имеет молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 15-20 кД, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 кД.

Примеры белков, охватываемые настоящим определением, включают в себя белки млекопитающих, такие как, например, гормон роста, в том числе гормон роста человека и бычий гормон роста; высвобождающий гормон роста фактор; паратиреоидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; α-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда; факторы против свертывания, такие как Протеин С; предсердный натриуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа- или тканеспецифический активатор плазминогена (t-PA, например, Activase®, TNKase®, Retevase®); бомбазин; тромбин; фактор-α и фактор-β некроза опухоли; энкефалиназа; RANTES (регулируемый при активации, нормально экспрессируемый и секретируемый Т-клетками); воспалительный белок макрофагов человека (MIP-1-α); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; ингибирующее вещество клеток Мюллера; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ДНКазу; ингибин; активин; васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; интегрин; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как происходящий из кости нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервов, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фибробластный фактор роста, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-α и TGF-β, в том числе TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста I и II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (IGF-I головного мозга); белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; дифференцировочные CD-белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин (ЕРО); тромбопоэтин (ТРО); остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; морфогенетический костный белок (ВМР); интерферон, такой как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF), например M-CSF, GM-CSF и G-CSF); интерлейкины (IL), например IL-1-IL-10; супероксиддисмутазу; рецепторы Т-клеток; белки наружной мембраны; ускоряющий разложение фактор (DAF); вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки вируса СПИДа; транспортные белки; рецепторы «домашнего инстинкта»; адрессины; регуляторные белки; иммуноадгезины;, антитела и биологически активные фрагменты или варианты любых из вышеперечисленных полипептидов.

Белок, который получают в виде композиции, является предпочтительно по существу чистым и желательно по существу гомогенным (т.е. не содержащим примесных белков). «По существу чистый» белок означает композицию, содержащую по меньшей мере приблизительно 90 мас.% этого белка в расчете на общую массу этой композиции, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95 мас.%. «По существу гомогенный» белок обозначает композицию, содержащую по меньшей мере приблизительно 99 мас.% белка в расчете на общую массу этой композиции.

В некоторых вариантах осуществления этим белком является антитело. Это антитело может связываться, например, с любой из вышеупомянутых молекул. Примеры молекулярных мишеней для антител, охватываемых данным изобретением, включают в себя IgG, белки CD CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 и CD40; члены семейства рецепторов HER, такие как рецептор EGF, HER2, рецептор HER2, HER3 или HER4; 2с4, 4D5, PSCA, LDP-2, молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и интегрин αv/β3, в том числе его α- и β-субъединицы (например, анти-CD11а-, анти-CD18- или анти-CD11β-антитела); факторы роста, такие как VEGF; антигены групп крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl, CTLA-4 и белок С.

Термин «антитело» в данном контексте включает в себя моноклональные антитела (в том числе полноразмерные антитела, которые имеют Fc-район иммуноглобулина), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Термин «иммуноглобулин» (Ig) используется здесь взаимозаменяемо с термином «антитело».

Основной единицей из 4 цепей антитела является гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. IgM-антитело состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц вместе с дополнительным полипептидом, названным J-цепью, и содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, тогда как IgA-антитела содержат 2-5 основных содержащих 4 цепи единиц, которые могут полимеризоваться с образованием поливалентных ансамблей в комбинации с J-цепью. В случае IgG единица из 4 цепей имеет обычно массу приблизительно 150000 дальтон. Каждая L-цепь связана с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две Н-цепи связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая Н- и L-цепь имеет также расположенные с регулярными интервалами внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая Н-цепь имеет N-конец, вариабельный домен (V_H), за которым следуют три константных домена (C_H) для каждой из α- и γ-цепей и 4 С_Н-домена для изотипов μ и ε. Каждая L-цепь имеет N-конец, вариабельный домен (V_L), за которым следует константный домен на ее другом конце. V_L выравнен с V_H, а C_L выравнен с первым константным доменом тяжелой цепи (С_Н1). Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаривание V_H и V_L вместе образует единый антигенсвязывающий сайт. В отношении структуры и свойств различных классов антител см., например, Basic and Clinical Immunology, 8^th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolv (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.

L-цепь любого вида позвоночных животных может быть отнесена к одному из двух явно различных типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (СН) иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Имеются пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющих тяжелые цепи, названные α, δ, ε, γ и μ соответственно. Классы γ и μ дополнительно подразделены на подклассы на основании относительно малых различий в последовательности и функции СН, например, люди экспрессируют следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

Термин "вариабельные" относится к тому факту, что некоторые сегменты вариабельных доменов сильно различаются по последовательности среди антител. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена во всей протяженности вариабельных доменов. Вместо этого V-районы состоят из относительно инвариантных отрезков, называемых каркасными районами (FR) из приблизительно 15-30 аминокислотных остатков, разделенных более короткими районами чрезвычайной вариабельности, называемых «гипервариабельными районами» и иногда «определяющими комплементарность районами» (CDR), которые имеют (каждый) длину приблизительно 9-12 аминокислотных остатков. Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей содержат четыре FR, в значительной степени принимающих конфигурации β-складки, соединенных тремя гипервариабельными районами, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие ее часть, эту β-складчатую структуру. Гипервариабельные районы в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости посредством FR и с гипервариабельными районами из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

Термин «гипервариабельный район» (также известный как определяющие комплементарность районы» или CDR) относится в данном контексте к аминокислотным остаткам антитела, которые находятся (обычно три или четыре коротких района чрезвычайной вариабельности последовательности) в домене V-области иммуноглобулина, которые образуют антигенсвязывающий сайт и являются основными детерминантами специфичности к антигену. Имеются по меньшей мере два способа идентификации этих CDR-остатков: (1) подход на основе перекрестно-видовой вариабельности последовательностей (т.е. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MS (1991)); и (2) подход на основе кристаллографических исследований комплексов антиген-антитело (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Однако до той степени, что способы идентификации двух остатков определяют районы перекрывания, но не идентичные районы, они могут комбинироваться для определения гибридных CDR.

Термин «моноклональное антитело» в применении здесь относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие эту популяцию, являются идентичными за исключением возможных природно встречающихся мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризаций, амидирований), которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленными против единственного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают в себя различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на данном антигене. Кроме их специфичности моноклональные антитела имеют преимущество, заключающееся в том, что они синтезируются гибридомной культурой, не загрязненной другими иммуноглобулинами. Определение "моноклональное" указывает на характер антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител и не должно рассматриваться как требующее получения этого антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые должны быть использованы в соответствии с данным изобретением, могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела в данном описании особо включают в себя «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной относительно соответствующих последовательностей в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная цепь (цепи) является (являются) идентичными с гомологами соответствующих последовательностей в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, пока они обнаруживают желаемую биологическую активность (патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Интересующие здесь химерные антитела включают в себя «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, происходящие из примата не человека (например, Old World Monkey, Ape etc.), и последовательности константной области человека.

"Интактным" антителом является антитело, которое содержит антигенсвязывающий сайт, а также CL и по меньшей мере домены тяжелой цепи С_Н1, С_Н2 и С_Н3. Эти константные домены могут быть константными доменами природной последовательности (например, константными доменами природной последовательности человека) или их вариантной аминокислотной последовательностью. Предпочтительно интактное антитело имеет одну или несколько эффекторных функций.

«Фрагмент антитела» содержит часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий и/или вариабельный район интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела, линейные антитела (см. патент США 5641870, Пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Расщепление папаином антител давало два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, названных «Fab»-фрагментами, и оставшийся «Fc»-фрагмент, (кристаллический фрагмент) - обозначение, отражающее способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из полной L-цепи вместе с доменом вариабельной области Н-цепи (V_H) и первым константным доменом одной тяжелой цепи (С_Н1). Каждый Fab-фрагмент является моновалентным в отношении связывания антигена, т.е. он имеет единственный антигенсвязывающий сайт. Обработка пепсином антитела дает единственный большой фрагмент F(ab')₂, который приближенно соответствует двум связанным дисульфидной связью Fab-фрагментам, имеющим разную антигенсвязывающую активность, и все еще способен перекрестно связывать антиген. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они имеют несколько дополнительных остатков на карбокси-конце домена С_Н1, включающих в себя один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH обозначает здесь Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиоловую группу. Фрагменты F(ab')₂ антитела исходно были получены в виде пары Fab'-фрагментов, которые имеют между ними шарнирные цистеины. Известны также и другие химические связывания фрагментов антител.

Fc-фрагмент содержит карбоксиконцевые части обеих Н-цепей, удерживаемые вместе дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-районе, районе, который также узнается Fc-рецепторами (FcR), обнаруживаемыми на определенных типах клеток.

«Fv» является минимальным фрагментом антител, который содержит полный сайт узнавания антигена и связывания антигена. Этот фрагмент состоит из димера домена вариабельной области одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в прочной нековалентной связи. Из укладки этих двух доменов образуются шесть гипервариабельных петель (3 петли из каждой из Н- и L-цепи), которые обеспечивают аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антигенсвязывающую специфичность этому антителу. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфических в отношении антигена) способен узнавать и связывать антиген, хотя и при более низкой аффинности, чем полный сайт связывания.

"Одноцепочечные Fv", также сокращаемые как "sFv" или "scFv", являются фрагментами антител, которые содержат V_H- и V_L-домены антитела, соединенные в единую полипептидную цепь. Предпочтительно полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между V_H- и V_L-доменами, который позволяет sFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В отношении обзора по sFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к малым фрагментам антител, полученным конструированием sFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (приблизительно 5-10 остатков) между V_H- и V_L-доменами таким образом, что получают межцепочечное, а не внутрицепочечное спаривание V_L-доменов. Биспецифические диатела являются гетеродимерами двух "перекрестных" sFv-фрагментов, в которых V_H- и V_L-домены двух антител присутствуют на различных полипептидных цепях. Диатела описаны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Антитело, которое «специфически связывается с» конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде или является «специфическим в отношении» конкретного полипептида или эпитопа на конкретном полипептиде, является антителом, которое связывается с этим конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без существенного связывания с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.

Термин «твердая фаза» описывает неводный матрикс, к которому может прикрепляться антитело данного изобретения. Примеры твердых фаз, включенных в этот термин, включают в себя твердые фазы, образованные частично или полностью из стекла (например, стекла с регулируемыми порами), полисахариды (например, агарозу), полиакриламиды, полистирол, поливиниловый спирт и силиконы. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от контекста твердая фаза может быть лункой планшета для анализа; в других вариантах осуществления она является колонкой для очистки (например, колонкой для аффинной хроматографии). Этот термин включает в себя также прерывистую твердую фазу дискретных частиц, таких как частицы, описанные в патенте США № 4275149.

"Гуманизированные" формы антител не человека (например, мышиных антител) являются химерными иммуноглобулинами, цепями иммуноглобулинов или их фрагментами (такими как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другими антигенсвязывающими субпоследовательностями антител) в основном последовательностей человека, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина не человека. В большинстве случаев гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельной области (также называемой CDR) реципиента заменены остатками из гипервариабельной области вида не человека (донорного антитела), такого как мышь, крыса или кролик, имеющей желаемую специфичность, аффинность и потенциал. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками не человека. Кроме того, «гуманизированные антитела» в данном контексте могут также содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в донорном антителе. Эти модификации производят для дополнительного усовершенствования и оптимизации действия антитела. Гуманизированное антитело оптимально будет также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно часть константной области иммуноглобулина человека. В отношении дополнительных деталей, см. Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

«Зависимое от вида антитело», например антитело млекопитающего против человеческого IgE, является антителом, которое имеет более сильную аффинность связывания в отношении антигена из первого вида млекопитающего, чем в отношении гомолога этого антигена из второго вида млекопитающего. Обычно зависимое от вида антитела «связывается специфически» с антигеном человека (т.е. имеет величину аффинности связывания (Kd) не более, чем приблизительно 1·10^-7 М, альтернативно не более, чем приблизительно 1·10^-8 М, альтернативно не более, чем 1·10^-9 М), но имеет связывающую аффинность в отношении гомолога этого антигена из второго вида млекопитающего не человека, которая является по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 500 раз или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз более слабой, чем его аффинность связывания в отношении антигена не человека. Зависимое от вида антитело может быть любым из разнообразных типов антител, определенных выше, но предпочтительно оно является гуманизированным или человеческим антителом.

«Эффекторные функции» антитела обозначают биологические функции, относимые к Fc-району (Fc-району нативной последовательности или Fc-району аминокислотной последовательности варианта) антитела и варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают в себя: связывание С1q и комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецепторов В-клеток) и активацию В-клеток.

«Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность» или ADCC является формой цитотоксичности, в которой секретируемые Ig, связанные на рецепторах Fc (FcR), представленные на некоторых цитотоксических клетках для специфического связывания с несущей антиген клеткой-мишенью, затем убивают клетку-мишень цитотоксинами. Эти антитела «вооружают» цитотоксические клетки и являются необходимыми для уничтожения клетки-мишени по этому механизму. Первичные клетки для опосредования ADCC, НК-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия Fc на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Для оценки активности ADCC интересующей молекулы может быть выполнен анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-убийцы (НК-клетки). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, такой как модель, описанная в Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).

«Рецептор Fc» или "FcR" обозначает рецептор, который связывается с Fc-районом антитела. Предпочтительным FcR является нативная последовательность FcR человека. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывается с IgG-антителом (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов, FcγRII-рецепторы включают в себя FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые различаются прежде всего в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный мотив активации (ITAM) на основе тирозина в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный мотив ингибирования (ITIM) на основе тирозина в его цитоплазматическом домене (см. M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). FcR рассмотрены в обзоре Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994) и de HAAS et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, в том числе FcR, которые будут идентифицированы в будущем, также включены в термин «FcR», используемый здесь. Этот термин включает в себя также неонатальный рецептор, FcRn, который является ответственным за перенос материнских IgG в плод. Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Klim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994).

«Эффекторные клетки человека» являются лейкоцитами, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно эти клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-убийцы (NK-клетки), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, причем предпочтительными являются PBMC и MNK-клетки. Эти эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, например, крови.

«Комплементзависимая цитотоксичность» (CDC) обозначает лизис клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента начинается связыванием первого компонента системы комплемента (С1q) с антителами (подходящего подкласса), которые связываются с их соответствующим антигеном. Для оценки активации комплемента может выполняться CDC-анализ, например, описанный в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

«Выделенные» в применении для описания разнообразных полипептидов и описанных здесь антител означает полипептид или антитело, которые были идентифицированы, отделены и/или извлечены из компонента среды их получения. Предпочтительно выделенный полипептид не связан со всеми другими компонентами среды его получения. Загрязняющими компонентами среды его получения, такими как компоненты, происходящие из рекомбинантных клеток, являются вещества, которые обычно мешают диагностическим или терапевтическим применениям для этого полипептида и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые