Способы идентификации опухолей, восприимчивых к лечению антителами против erbb2

Способы идентификации опухолей, восприимчивых к лечению антителами против erbb2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам идентификации опухоли, восприимчивой к лечению антителами против HER2, а также к способам лечения субъектов, имеющих такие опухоли.

Уровень техники

Члены семейства рецепторов тирозинкиназ ErbB являются важными медиаторами роста, дифференцировки и выживания клеток. Указанное семейство рецепторов состоит из четырех отдельных членов, включающих в себя рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR или ErbB1), HER2 (ErbB2 или р185^neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2).

Рецептор EGFR, кодируемый геном erbB1, встречается в злокачественных новообразованиях человека. В частности, повышенная экспрессия EGFR обнаружена в раковых опухолях молочной железы, мочевого пузыря, легкого, головы, шеи и желудка, а также в глиобластомах. Повышенная экспрессия рецепторов EGFR часто взаимосвязана с повышенным продуцированием лиганда EGFR, трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), теми же опухолевыми клетками, в результате чего происходит активация данного рецептора по аутокринному пути стимуляции. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). Кроме того, в научной литературе описан белок, относящийся к рецептору эпидермального фактора роста (ERRP), где клонированный фрагмент кДНК, содержащий 1583 пар оснований, на 90-95% гомологичен последовательности EGFR мыши и усеченной последовательности EGFR крысы (патент США № 6399743 и публикация патента США № 2003/0096373). Моноклональные антитела против EGFR или его лигандов, TGF-α и EGF, признаны терапевтическими средствами, пригодными для лечения таких злокачественных новообразований. См., например, приведенную выше публикацию Baselga and Mendelsohn; Masui et al., Cancer Research, 44:1002-1007 (1984); и Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995).

Второй член семейства ErbB, p185neu, первоначально был идентифицирован в качестве продукта трансформирующего гена в нейробластомах крыс, подвергнутых химическому воздействию. Активированная форма протоонкогена neu возникает в результате точковой мутации (замена валина глутаминовой кислотой) в трансмембранной области кодированного белка. Амплификация гомолога рецептора neu (HER2) человека обнаружена в раковых опухолях молочной железы и яичника и может служить основанием для плохого прогноза (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989) и патент США № 4968603). До настоящего времени в научной литературе не сообщалось о точковой мутации, аналогичной вышеуказанной мутации в протоонкогене neu, для опухолей человека. Сверхэкспрессия ErbB2 (часто, но не всегда возникающая вследствие амплификации гена) была обнаружена также в других карциномах, включая карциномы желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря. См. публикации King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J.Cancer, 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathiobiology, 59:46-52 (1991) и McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). ErbB2 может быть сверхэкспрессирован в раковой опухоли предстательной железы (Gu et al., Cancer Lett., 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer, 79:2162-70 (1997) и Sadasivan et al., J. Urol., 150:126-31 (1993)). Сверхэкспрессия ErbB2 может вызвать рост опухоли вследствие лиганд-независимой активации ErbB2 или гомодимеров ErbB2.

В научной литературе описаны антитела против p185neu крысы и белковых продуктов ErbB2 человека. Дребин с коллегами создали антитела против генного продукта neu крыс, p185neu. См., например, публикации Drebin et al., Cell, 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991) и WO 94/22478. В публикации Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) указано, что смеси антител, взаимодействующих с двумя разными областями p185neu, оказывают синергическое противоопухолевое действие на neu-трансформированные клетки NIH-3T3, имплантированные "голым" мышам. См. также патент США № 5824311, выданный 20 октября 1998 г.

В публикации Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9(3):1165-1172 (1989) описано создание панели антител против ErbB2, которые были исследованы с использованием линии опухолевых клеток молочной железы человека SK-BR-3. Пролиферацию клеток SK-BR-3 под воздействием указанных антител определяли методом окрашивания монослоев кристаллическим фиолетовым через 72 часа. В результате выполнения данного анализа было установлено, что максимальное ингибирование достигалось при использовании антитела, получившего название 4D5, которое подавляло пролиферацию клеток на 56%. Другие антитела в данной панели уменьшали пролиферацию клеток в меньшей степени при выполнении указанного анализа. Далее было обнаружено, что антитело 4D5 повышает чувствительность линий опухолевых клеток молочной железы, сверхэкспрессирующих ErbB2, к цитотоксическому действию TNF-α. См. также патент США № 5677171, выданный 14 октября 1997 г. Антитела против ErbB2, рассмотренные в публикации Hudziak et al., далее описаны в публикациях in Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro, 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2):979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al,. Cancer Research, 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research., 56:1457-1465 (1996) и Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997).

Рекомбинантный гуманизированный вариант антитела 4D5 против ErbB2 (huMAb 4D5-8, rhuMAb HER2 или HERCEPTIN®; патент США № 5821337), является клинически активным у субъектов, имеющих метастатические раковые опухоли молочной железы, сверхэкспрессирующие ErbB2, которые были подвергнуты интенсивной противораковой терапии (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996)). Препарат HERCEPTIN® был разрешен к продаже Управлением по контролю за продуктами и лекарствами 25 сентября 1998 г. для лечения субъектов, имеющих метастатические раковые опухоли молочной железы, сверхэкспрессирующие ErbB2. Однако не все опухоли, сверхэкспрессирующие ErbB2, являются восприимчивыми к лечению препаратом HERCEPTIN®. (Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001)). Кроме того, данные доклинических исследований позволяют предположить, что HERCEPTIN® может быть терапевтически эффективен при лечении немелкоклеточного рака легкого (NSCLC). Белок HER2 сверхэкспрессирован в 20-66% удаленных опухолей NSCLC, при этом во многих исследованиях было установлено, что наличие указанного белка может служить основанием для плохого прогноза у субъекта (Azzoli, C.G. et al., Semin. Oncol., 29(Suppl 4):59-65 (2002)).

Другие антитела против ErbB2, обладающие разными свойствами, описаны в публикациях Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992); патент США № 5783186 и Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997). Моноклональное антитело 2С4 описано в заявке на патент WO 01/00245, которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Установлено, что антитело 2С4 разрушает димеры, образуемые HER2 с другими членами семейства рецепторов ErbB (WO 01/00245).

Исследование гомологии позволило идентифицировать два других члена семейства рецепторов ErbB, в частности ErbB3 (патенты США №№ 5183884 и 5480968, а также публикация Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989)) и ErbB4 (заявка на европейский патент № 599274; публикации Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) и Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Оба указанных рецептора характеризуются повышенной экспрессией по меньшей мере в некоторых линиях раковых клеток молочной железы.

Рецепторы ErbB обычно встречаются в клетках в разных комбинациях, при этом считается, что гетеродимеризация увеличивает спектр реакций клеток на разные лиганды ErbB (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment, 35:115-132 (1995)). Однако до сих пор полностью не понят механизм агрегации указанных рецепторов и его влияние на передачу сигналов (Brennan, P.J. et al., Oncogene, 19:6093-6101 (2000)). Рецептор EGFR связывается шестью разными лигандами, такими как эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), амфирегулин, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), бетацеллулин и эпирегулин (Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). Семейство белков герегулина, образующихся в результате поочередного сплайсинга одного гена, представляет собой лиганды для ErbB3 и ErbB4. Семейство герегулинов включает альфа-, бета- и гамма-герегулины (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); патент США № 5641869 и Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)); факторы дифференцировки neu (NDF); глиальные факторы роста (GGF); активность, индуцирующая рецептор ацетилхолина (ARIA); фактор сенсорных и двигательных нейронов (SMDF). См. публикации Groenen et al., Growrh Factors, 11:235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell. Neurosci., 7:247-262 (1996) и Lee et al., Pharm. Rev., 47:51-85 (1995). Недавно были идентифицированы три дополнительных лиганда ErbB, а именно нейрегулин-2 (NRG-2), который, как указывают, связывается с ErbB3 или ErbB4 (Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997) и Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); нейрегулин-3, который связывается с ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94(18):9562-7 (1997)), и нейрегулин-4, который связывается с ErbB4 (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)). HB-EGF, бетацеллулин и эпирегулин также связываются с ErbB4.

Хотя EGF и TGFα не связываются с ErbB2, EGF стимулирует образование гетеродимера между EGFR и ErbB2, что активирует EGFR и вызывает трансфосфорилирование ErbB2 в гетеродимере. Димеризация и/или трансфосфорилирование, по-видимому, активируют тирозинкиназу ErbB2. См. приведенную выше публикацию Earp et al. Аналогичным образом герегулин не связывается с ErbB2, но при коэкспрессии ErbB3 с ErbB2 образуется активный комплекс передачи сигнала (Nagy et al., Cytometry, 32:120-31 (1998). Антитела против ErbB2 могут разрушать указанный комплекс (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). ErbB3 не содержит тирозинкиназы, поэтому ему необходимо образовать гетеродимер предпочтительно с ErbB2, чтобы приобрести способность трансдукции сигнала (Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1995)). Кроме того, сродство ErbB3 к герегулину (HRG) достигает более высокой степени при коэкспрессии с ErbB2. См. также публикации Levi et al., Journal of Neuroscience, 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1431-1435 (1995) и Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) для ознакомления с белковым комплексом ErbB2-ErbB3. ErbB2 действительно является предпочтительным партнером для образования гетеродимера как с EGFR, так и с ErbB3 (Graus-Porta et al., см. выше). ErbB4, подобно ErbB3, образует активный комплекс передачи сигнала с ErbB2 (Carraway and Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)). Лиганд-зависимая гетеродимеризация ErbB2 с EGFR или ErbB3 может стимулировать рост опухолей, экспрессирующих ErbB2.

Экспрессия рецепторов ErbB и герегулина и фосфорилирование HER2 были исследованы в образцах опухоли, полученных у субъектов с первичным раком молочной железы, и карциноме мочевого пузыря (Esteva et al., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow et al., Clin. Cancer Res., 7:1957-1962 (2001). Корреляция между активной передачей сигнала Her2/neu, клинической патологией и прогнозом у субъекта в отношении рака молочной железы описана в публикациях Thor et al., J. Clin. Oncology, 18:3230-3239 (2000) и DiGiovanna et al., Cancer Res., 62:6667-6673 (2002).

Сущность изобретения

Одним объектом настоящего изобретения является способ идентификации опухоли, восприимчивой к лечению антителами против HER2. Антитело против HER2 предпочтительно блокирует активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В одном варианте осуществления изобретения указанное антитело является моноклональным антителом 2С4, более предпочтительно rhuMAb 2C4.

Полученный образец опухоли исследуют на наличие белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4. Опухоль, в которой обнаружен указанный комплекс, считается восприимчивой к лечению антителом против HER2.

В одном варианте осуществления изобретения комплекс обнаруживают методом иммунопреципитации любых белковых комплексов, содержащих HER2, при помощи антитела против HER2. Затем образовавшие иммунопреципитат комплексы вводят в соприкосновение с антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против HER3, антител против НER1 и антител против HER4, и определяют любое связывание. Комплекс HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 считается обнаруженным, если установлено, что антитела против HER3, и/или HER1, и/или HER4 связываются с образовавшими иммунопреципитат комплексами.

В другом варианте осуществления изобретения наличие белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 определяют, осуществляя контактирование образца опухоли с антителом против HER2, содержащим первый флуорофор. Образец опухоли затем вводят в соприкосновение с антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против HER3, и/или HER1, и/или HER4, причем указанное антитело содержит второй флуорофор. Затем измеряют перенос резонансной энергии флуоресценции, чтобы определить пространственную близость первого и второго флуорофоров. Белковый комплекс HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 обнаруживают в том случае, если первый и второй флуорофоры находятся в непосредственной близости друг от друга.

В другом варианте осуществления изобретения наличие комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 определяют путем осуществления контактирования образца опухоли с первым связывающим соединением. Первое связывающее соединение содержит часть, связывающуюся с первой мишенью, которая специфически связывается с HER2. Часть, связывающаяся с первой мишенью, предпочтительно является антителом против HER2 или фрагментом указанного антитела. Первое связывающее соединение далее содержит детектируемую часть, которая связана с первым связывающим доменом при помощи расщепляемого линкера.

Образец опухоли вводят в соприкосновение со вторым связывающим соединением. Второе связывающее соединение предпочтительно содержит часть, связывающуюся со второй мишенью, которая специфически связывается с HER3, или HER1, или HER4 и предпочтительно не связывается с HER2. В другом варианте осуществления изобретения второе связывающее соединение связывается с HER3 или HER1 и не связывается с HER2 или HER4. В другом варианте осуществления изобретения часть, связывающаяся со второй мишенью, является антителом против HER3, или HER1 или HER4 или фрагментом указанного антитела. В результате активации второе связывающее соединение способно расщеплять расщепляемый линкер в первом связывающем соединении, в результате чего образуется свободная детектируемая часть, если первое связывающее соединение и второе связывающее соединение находятся в непосредственной близости друг от друга. Наличие белкового комплекса HER2/HER3, или HER2/HER1, или HER2/HER4 определяют по присутствию свободной детектируемой части. В одном варианте осуществления изобретения наличие свободной детектируемой части определяют методом капиллярного электрофореза.

В другом варианте осуществления изобретения первое связывающее соединение содержит домен, связывающийся с первой мишенью, который специфически связывается с HER1, или HER3, или HER4, и второе связывающее соединение содержит домен, связывающийся со второй мишенью, который специфически связывается с HER2.

В другом варианте осуществления изобретения наличие белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и активацию HER2 определяют путем измерения фосфорилирования рецептора ErbB, например, методом иммунопреципитации белка HER2 с последующим выполнением иммунологического анализа фосфотирозина методом вестерн-блоттинга.

Образец опухоли, предназначенный для анализа на наличие белковых комплексов HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4, предпочтительно получают у субъекта, имеющего данную опухоль. Такой образец можно получить, например, при помощи биопсии. В другом варианте осуществления изобретения образец получают путем выделения циркулирующих опухолевых клеток субъекта. В другом варианте осуществления изобретения указанный образец получают во время хирургического удаления опухоли у субъекта.

В другом варианте осуществления изобретения образец опухоли получают у млекопитающего, не являющегося субъектом, у которого первоначально возникла данная опухоль. Такой образец предпочтительно получают у мыши или другого грызуна. Указанная опухоль более предпочтительно является ксенотрансплантированной опухолью. Ксенотрансплантированную опухоль предпочтительно продуцируют путем трансплантации фрагмента опухоли человека мыши или другому грызуну.

В другом варианте осуществления изобретения опухоль является опухолью легкого, более предпочтительно опухолью немелкоклеточного рака легкого. В другом варианте осуществления изобретения опухоль является опухолью молочной железы.

Другим объектом данного изобретения является способ идентификации опухолевых клеток, восприимчивых к воздействию антитела, ингибирующего связывание HER2 с другим членом семейства рецепторов ErbB, который включает в себя стадии (а) получения биологического образца, содержащего HER2-положительные опухолевые клетки, и (b) обнаружение фосфорилирования рецептора ErbB в данном биологическом образце, которое свидетельствует о том, что указанные опухолевые клетки чувствительны к воздействию данного антитела. В одном варианте осуществления изобретения обнаруживают фосфорилирование рецептора ErbB2 (HER2).

Как указывалось выше, другим членом, связанным с HER2, является HER3, HER1 и/или HER4, в частности HER2 и/или HER1. Данный способ может дополнительно включать в себя стадию определения наличия белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 вышеописанными методами.

Другим объектом данного изобретения является способ прогнозирования реакции субъекта, у которого обнаружена HER2-положительная опухоль, на лечение антителом, ингибирующим связывание HER2 с другим членом семейства рецепторов ErbB, путем обнаружения образования белковых комплексов HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилирования рецептора ErbB в биологическом образце, содержащем HER2-положительные опухолевые клетки, который был получен у данного субъекта. Наличие таких белковых комплексов и/или фосфорилирования свидетельствует о том, что данный субъект, по-видимому, восприимчив к лечению указанным антителом. В одном варианте осуществления изобретения обнаружение фосфорилирования рецептора ErbB (HER2) указывает на вероятную восприимчивость субъекта к лечению антителом.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу идентификации субъекта, восприимчивого к лечению антителом против HER2, путем обнаружения фосфорилирования рецептора ErbB в циркулирующих опухолевых клетках субъекта. Наличие такого фосфорилирования показывает, что данный субъект, по-видимому, восприимчив к лечению антителом против HER2. В одном варианте осуществления изобретения обнаруживают фосфорилирование ErbB2 (HER2). В другом варианте осуществления изобретения нуждающийся [в лечении] субъект является человеком. В другом варианте осуществления изобретения данный способ включает в себя лечение субъекта антителом против HER2, предпочтительно антителом rhuMAb 2C4.

Другим объектом данного изобретения является изделие, включающее в себя емкость, содержащую антитело, связывающееся с HER2, и инструкции по введению указанного антитела субъекту, имеющему опухоль. Данная опухоль предпочтительно содержит гетеродимеры HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4.

В одном варианте осуществления изобретения в указанной емкости находится антитело, блокирующее активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В другом варианте осуществления изобретения в указанной емкости находится моноклональное антитело 2С4, более предпочтительно антитело rhuMAb 2C4.

Другим объектом данного изобретения является способ лечения субъекта, который включает в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, связывающегося с HER2. Указанный субъект предпочтительно имеет опухоль, содержащую гетеродимеры HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4.

В одном варианте осуществления изобретения данное антитело блокирует активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В другом варианте осуществления изобретения данное антитело является моноклональным антителом 2С4, более предпочтительно антителом rhuMAb 2C4.

Другим объектом данного изобретения является способ лечения субъекта, который включает в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, связывающегося с HER2. Указанный субъект предпочтительно имеет опухоль, которая, как известно, содержит фосфорилированный рецептор ErbB.

В одном варианте осуществления изобретения фосфорилированным рецептором ErbB является HER2. В другом варианте осуществления изобретения указанное антитело блокирует активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В еще одном варианте осуществления изобретения данное антитело является моноклональным антителом 2С3, более предпочтительно антителом rhuMAb 2C4.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А и 1В показаны сравнительные анализы первичной структуры аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи (VL) (фиг.1А) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) (фиг.1В) моноклонального антитела 2С4 мыши (соответственно SEQ ID NO:1 и 2); VL- и VH-области варианта 574 гуманизированного антитела 2С4 (соответственно SEQ ID NO:3 и 4) и консенсусные остовы VL- и VH-областей человека (hum κ1, подгруппа I легкой цепи каппа; humIII, подгруппа III тяжелой цепи) (соответственно SEQ ID NO:5 и 6). Звездочками отмечены различия между вариантом 574 гуманизированного антитела 2С4 и моноклональным антителом 2С4 мыши или между вариантом 574 гуманизированного антитела 2С4 и остовом антитела человека. В скобках указаны гипервариабельные участки (CDR).

На фиг.2А и 2В показано действие моноклонального антитела 2С4, антитела препарата HERCEPTIN® или антитела против EGFR на герегулин-зависимое (HRG) связывание ErbB2 с ErbB3 в клетках MCF7, экспрессирующих ErbB2 на низком/нормальном уровне (фиг.2А), и в клетках SK-BR-3, экспрессирующих ErbB2 на высоком уровне (фиг.2В); см. приведенный ниже пример 2.

На фиг.3 показан иммуноблот, свидетельствующий о наличии гетеродимеров HER1/HER2 и HER2/HER3 в белковых экстрактах, полученных из ксенотрансплантированных эксплантатов немелкоклеточного рака легкого.

На фиг.4 показан иммуноблот, свидетельствующий о наличии фосфорилирования HER2 в белковых экстрактах, полученных из ксенотрансплантированных эксплантатов немелкоклеточного рака легкого (NSCLC).

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления изобретения

Настоящее изобретение частично основано на результатах экспериментальных исследований, которые показывают, что восприимчивость к антителу против HЕR2 rhuMAb 2C4 соотносится с наличием гетеродимеров HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилированием рецептора ErbB в опухолевых клетках. Таким образом, опухоль можно идентифицировать по восприимчивости к воздействию антитела против HER2, в частности антитела против HER2, обладающего одной или несколькими биологическими активностями антитела 2С4 против HER2, при наличии гетеродимеров HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилирования рецептора ErbB. Гетеродимеры HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилирование рецептора ErbB можно обнаружить любым методом, известным в данной области. После обнаружения специфических опухолей и типов опухолей, которые восприимчивы к лечению антителами против HER2, можно выявить субъектов, которые, по-видимому, могут получить пользу от такого лечения. Кроме того, можно выявить субъектов, которым, вероятно, не поможет лечение моноклональным антителом 2С4.

Определение терминов

Термин "рецептор ErbB" означает рецептор, представляющий собой белок тирозинкиназы, который относится к семейству рецепторов ErbB и включает в себя рецепторы EGFR (ErbB1), ERRP, ErbB2, ErbB3 и ErbB4 и другие члены указанного семейства, которые будут идентифицированы в будущем. Рецептор ErbB обычно имеет внеклеточную область, которая может связываться с лигандом ErbB; липофильную трансмембранную область; консервативную внутриклеточную область тирозинкиназы и карбоксиконцевую сигнальную область, содержащую несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Рецептор ErbB может представлять собой рецептор ErbB, имеющий "нативную последовательность" или "вариант аминокислотной последовательности". Рецептор ErbB предпочтительно является рецептором ErbB человека с нативной последовательностью. Соответственно, "член семейства рецепторов ErbB" представляет собой EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 и ErbB4 или любой другой рецептор ErbB, который известен в настоящее время или будет идентифицирован в будущем. Предпочтительным членом указанного семейства рецепторов является EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 или ErbB4.

Термины "ErbB1", "рецептор эпидермального фактора роста", "EGFR" и "HER1" являются взаимозаменяемыми в данном описании изобретения и означают рецептор EGFR, описанный, например, в публикации Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem., 56:881-914 (1987), и его естественные мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, описанный в публикации Humphrey et al., PNAS (USA), 87:4207-4211 (1990)). Термин еrbB1 означает ген, кодирующий белковый продукт EGFR. Антитела против НER1 описаны, например, в публикации Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys., 252: 549-560 (1987) и в заявке WO 95/25167.

Термины "ERRP", "белок, родственный рецептору EGF", "EGFR-родственный белок" и "белок, родственный рецептору эпидермального фактора роста" являются взаимозаменяемыми в данном описании изобретения и означают белок ERRP, описанный, например, в патенте США № 6399743 и публикации патента США № 2003/0096373.

Термины "ErbB2" и "HER2" являются взаимозаменяемыми в данном описании изобретения и означают белок НER2 человека, описанный, например, в публикациях Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) и Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986) (номер доступа в банке генов Х03363). Термин "еrbB2" означает ген, кодирующий рецептор ErbB2 человека, и "neu" означает ген, кодирующий рецептор p185neu крысы. Предпочтительный рецептор ErbB2 является рецептором ErbB2 человека с нативной последовательностью.

Термин "ErbB3" и "HER3" означают полипептид рецептора, описанный, например, в патентах США №№ 5183884 и 5480968, а также в публикации Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989). Антитела против ErbB3 известны в данной области и описаны, например, в патентах США №№ 5183884, 5480968 и в заявке WO 97/35885.

Термин "ErbB4" и "HER4" означают полипептид рецептора, описанный, например, в заявке на европейский патент № 599274; публикациях Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) и Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), и его изоформы, описанные, например, в заявке WO 99/19488, опубликованной 22 апреля 1999 г. Антитела против HER4 описаны, например, в заявке WO 02/18444.

Антитела к рецепторам ErbB можно приобрести коммерческим путем в ряде компаний, в том числе, например, в компании Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA.

Термин "лиганд ErbB" означает полипептид, который связывается с рецептором ErbB и/или активирует указанный рецептор. Лиганд ErbB может быть лигандом ErbB человека с нативной последовательностью, таким как эпидермальный фактор роста (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem., 247:7612-7621 (1972); трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science, 223:1079-1082 (1984)); амфирегулин, известный также как аутокринный фактор роста шванома или кератиноцита (Shoyab et al., Science, 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990) и Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557 (1991)); бетацеллюлин (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993) и Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); эпирегулин (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995) и Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); герегулин (см. ниже); нейрегулин-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); нейрегулин-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9562-9567 (1997)); нейрегулин-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) или крипто (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). Лиганды ErbB, связывающиеся с EGFR, включают в себя EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллюлин, HB-EGF и эпирегулин. Лиганды ErbB, связывающиеся с ErbB3, включают в себя герегулины. Лиганды ErbB, способные связываться с ErbB4, включают в себя бетацеллюлин, эпирегулин, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 и герегулины. Лиганд ErbB может быть также синтетическим лигандом ErbB. Синтетический лиганд может быть специфичным к определенному рецептору ErbB или может узнавать конкретные комплексы рецептора ErbB. Примером синтетического лиганда является синтетический герегулин/бирегулин химеры egf (см., например, публикацию Jones et al., FEBS Letters, 447:227-231 (1999), которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки).

Термин "герегулин" (HRG) в используемом здесь значении означает полипептид, кодируемый генным продуктом герегулина, который описан в патенте США № 5641869 или публикации Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Примеры герегулинов включают в себя герегулин-α, герегулин-β1, герегулин-β2 и герегулин-β3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992) и патент США № 5641869); фактор дифференцировки neu (NDF) (Peles et al., Cell, 69:205-216 (1992)); активность, индуцирующую рецептор ацетилхолина (ARIA) (Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993)); глиальные факторы роста (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); фактор сенсорных и двигательных нейронов (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)); γ-герегулин (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). Указанный термин означает биологически активные фрагменты и/или варианты аминокислотных последовательностей полипептида HRG с нативной последовательностью, такие как фрагмент EGF-подобной области (например, HRGβ1177-244).

Термин "гетероолигомер ErbB" означает нековалентно связанный олигомер, содержащий по меньшей мере два разных рецептора ErbB. Термин "димер ErbB" означает нековалентно связанный олигомер, содержащий два разных рецептора ErbB. Такие комплексы могут образовываться в том случае, когда клетка, экспрессирующая два или больше рецепторов ErbB, подвергается воздействию лиганда ErbB. Олигомеры ErbB, в частности димеры ErbB, можно выделить путем иммунопреципитации и подвергнуть анализу методом SDS-PAGE, описанным в публикации Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Примеры таких гетероолигомеров ErbB включают комплексы EGFR-ErbB2 (определяемый также как HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) и ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Кроме того, гетероолигомер ErbB может содержать два или больше рецепторов ErbB2, объединенных с другим рецептором ErbB, таким как ErbB3, ErbB4 или EGFR (ErbB1). В состав гетероолигомера могут входить другие белки, такие как субъединица рецептора цитокина (например, gp130).

Термин "активация лигандом рецептора ErbB" означает трансдукцию сигнала (например, вызываемое внутриклеточной областью киназы фосфорилирование остатков тирозина рецептора ErbB или полипептидного субстрата), опосредуемую связыванием лиганда ErbB с гетероолигомером ErbB, содержащим представляющий интерес рецептор ErbB. Указанный процесс обычно включает связывание лиганда ErbB с гетероолигомером ErbB, активирующим область киназы одного или нескольких рецепторов ErbB в гетероолигомере, в результате чего происходит фосфорилирование остатков тирозина в одном или нескольких рецепторах ErbB и/или фосфорилирование остатков тирозина в дополнительных полипептидах субстрата. Активацию рецептора ErbB можно количественно определить при помощи разных анализов фосфорилирования тирозина.

Термин полипептид с "нативной последовательностью" означает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и естественный полипептид (например, рецептор ErbB или лиганд ErbB). Такие полипептиды с нативной последовательностью можно получить из природного источника или создать рекомбинантными или синтетическими методами. Таким образом, полипептид с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность естественного полипептида человека, полипептида мыши или полипептида млекопитающего любого другого вида.

Термин "вариант аминокислотной последовательности" означает полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, отличающиеся в некоторой степени от полипептида с нативной последовательностью. Варианты аминокислотной последовательности обычно по меньшей мере примерно на 70% гомологичны по меньшей мере одному домену связывания рецептора нативного лиганда ErbB или по меньшей мере одному домену связывания лиганда нативного рецептора ErbB, причем указанные домены предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% гомологичны доменам связывания такого рецептора или лиганда. Варианты аминокислотной последовательности включают замены, делеции и/или инсерции в определенных положениях нативной аминокислотной последовательности.

Термин "гомология" означает выраженное в процентах число остатков варианта аминокислотной последовательности, которые являются идентичными после выполнения сравнительного анализа первичной структуры и при необходимости заполнения разрывов для достижения максимальной процентной гомологии. Методы и компьютерные программы, предназначенные для выполнения сравнительного анализа первичной структуры, хорошо известны в данной области. Одной такой компьютерной программой является "Align 2", созданная в компании Genentech, Inc., которая была зарегистрирована с документацией пользователя в Ведомстве по охране авторского права США, Вашингтон, округ Колумбия 20559, 10 декабря 1991 г.

Термин "антитело" использован в данном описании изобретения в самом широком значении, в определение которого, в частности, входят интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, если они обладают требуемой биологической активностью.

Термин "моноклональное антитело" в используемом здесь значении означает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, то есть из популяции отдельных антител, которые идентичны друг другу, за исключением возможных естественных мутаций, присутствующих в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленно воздействуя на один антигенный сайт. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо специфичности преимуществом моноклональных антител является то, что они могут быть синтезированы, не будучи загрязненными другими антителами. Термин "моноклональный" определяет характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, поэтому для его получения не нужно использовать какой-либо конкретный метод. Например, моноклональные антитела, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением, можно получить методом создания гибридом, который впервые был описан в публикации Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" можно также выделить из библиотек фаговых антител при помощи методов, описанных в публикациях Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела в используемом здесь значении включают, в частности, "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или относящихся к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, выделенных из другого вида или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они обладают требуемой биологической активностью (патент США № 4816567 и публикация Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес в данном описании изобретения, включают "приматизированные" антитела, содержащие антиген-связывающие последовательности вариабельной области, выделенные у примата, отличного от человека (например, низшие узконосые обезьяны, человекообразные обезьяны и т.д.), и последовательности константных областей человека.

Термин "фрагменты антитела" означает часть интактного антитела, предпочтительно содержащую антиген-связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты; ди-антитела; линейные антитела; одноцепочечные антитела и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.

"Интактное" антитело является таким антителом, которое содержит антиген-связывающую вариабельную область, а также константную область легкой цепи (CL) и константные области тяжелой цепи СН1, СН2 и СН3. Константные области могут быть константными областями нативной последовательности (например, константными областями нативной последовательности человека) или вариантом аминокислотной последовательности. Интактное антитело предпочтительно выполняет одну или несколько эффекторных функций.

"Эффекторные функции" антител