Штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae для применения в пивоваренной промышленности

Штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae для применения в пивоваренной промышленности

Реферат

Изобретение относится к промышленной микробиологии, в частности к получению штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающего улучшенными технологическими свойствами для пивоваренной промышленности.

Известно множество штаммов пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, применяемых в пивоварении. В мире существует несколько коллекций пивоваренных дрожжей, наиболее известными из которых являются UK National Collection of Yeast Culturies (NCYC) http://www.ifr.bbsrc.ac.uk/ncyc/, VTT Biotechnology www.vtt.fi, Hefebank Weihnstephan www.hefebank-weihenstephan.de, Cara Technology www.cara-online.com, Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ ФГУП ГосНИИГенетика) www.genetika.ru.

Одним из широко используемых в пивоваренной промышленности является штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2945 ин-та Пищевой биотехнологии, раса «Голландская», хранящийся во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (прототип).

Указанный штамм обладает способностью эффективно утилизировать моно-, ди- и трисахариды пивного сусла, с образованием этилового спирта, характеризуется низким содержанием эфиров и высших спиртов в готовом продукте, обладает высокой способностью к редукции диацетила и пентандиона и хорошими флокулирующими свойствами.

Недостатком штамма является достаточно высокое содержание серосодержащих соединений в пиве, полученном с использованием этого штамма. Изменением технологических режимов не удается эффективно понизить уровень синтеза серных соединений и улучшить органолептические свойства конечного продукта.

В ходе брожения дрожжей в пивном сусле образуется сероводород. В повышенной концентрации неприятный запах и токсичность этого соединения приводит к непригодности пива для потребителя. Количество сероводорода зависит от особенностей метаболизма штамма, от состава пивного сусла и от условий брожения, поэтому получение штамма, способного сбраживать пивное сусло в стандартных условиях с низким образованием серосодержащих соединений является важной задачей для пивоваренной промышленности.

Технической задачей изобретения является расширение ассортимента штаммов, пригодных для применения в пивоваренной промышленности.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194, обладающий высокими технологическими характеристиками (в том числе повышенной степенью сбраживания сахаров пивного сусла) и позволяющий получить продукт (пиво) с улучшенными органолептическими свойствами.

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194 представляет собой гибрид двух штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae В7х12В-В72. Один из родительских штаммов В7 является прототрофом, второй родительский штамм 12В-В72 - ауксотроф по гистидину МАТа his4. Оба штамма получены из коллекции лаборатории молекулярной генетики Санкт-Петербургского Института Ядерной Физики им. Константинова. На основе прототрофного штамма В7 были выделены клоны, дефектные по митахондриальной ДНК и неспособные расти на среде с этиловым спиртом в качестве единственного источника углерода.

Штамм ВКПМ Y-3194 получен с использованием селективной системы отбора гибридов ауксотрофного штамма и прототрофного штамма, неспособного расти на минимальной среде с этанолом. Селекцию гибридов проводили по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях и эффективно сбраживать моно-, ди- и трисахариды сусла с образованием большого количества этилового спирта) и хорошие органолептические свойства (приятный вкус и аромат конечного продукта брожения).

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (Москва, 117545, 1-ый Дорожный проезд, 1) и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3194.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании на полной среде YEPD (мас.%: глюкоза - 2; пептон - 2; дрожжевой экстракт - 1; агар -2,0, вода - остальное), сусле-агаре (мас.%: сусло -11; агар - 2, вода - остальное) и минимальной среде (мас.%: BYNB - 0,67; глюкоза - 2; агар -2,0, вода - остальное) при 29±1°С в течение 96 часов образуются колонии светло-кремовые, гладкие с ровным краем.

При микроскопировании клетки неподвижные, крупные правильной овальной формы с округлыми концами. Клетки образуют по одной почке. Клетки в среднем крупнее, чем у подобных штаммов пивоваренных дрожжей.

Увеличенный размер клеток штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194 по сравнению со штаммами других пивных дрожжей является морфологическим признаком данной культуры. Увеличенные размеры объекта, полученные в результате селекционного отбора, часто свидетельствуют о повышенной плоидности. Документирование результатов микроскопирования с помощью микроскопа Axioskop 2 МОТ проводили с помощью видеокамеры Axiocam фирмы Zeiss. Измерения проводили с помощью программы Axiovision (Zeiss).

Физиолого-биохимические признаки

Мезофил, рост возможен в интервале 10-40°С, оптимальная для роста и спорообразования температура 29±1°С, однако, устойчив к повышенной температуре и способен к росту при 37°С.

Оптимальный диапазон рН 4,7-5,5.

Факультативный аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания на шейкере INOVA 200 об./мин.

Имеет повышенный уровень устойчивости к меди (способен к росту на среде с концентрацией меди 305 мг/л), что является его индивидуальной характеристикой и важно при проведении микробиологических тестов на выявление заражения посторонними дрожжами в процессе пивоварения.

Обладает повышенной устойчивостью к этанолу, что также является важной характеристикой для штамма, используемого в пивоварении.

Отношение к источникам углеводов.

Для определения видовой принадлежности культуры Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194 использовали Api 20С AUX системы для идентификации дрожжевых грибов фирмы Bio Merieux.

Полоска (стрип) API 20С AUX состоит из 20 лунок, содержащих высушенные субстраты, которые позволяют провести 19 ассимиляционных тестов. Лунки заливают полужидкой минимальной средой, при этом дрожжевые грибы показывают признаки роста только на тех субстратах, которые они способны использовать в качестве единственного источника углерода. Реакции учитывают путем сравнения характера роста с контролем через 24, 48 и 96 часов, идентификацию проводят, используя компьютерную программу для идентификации APILAB plus. V3.2.2.

Дрожжи ВКПМ Y-3194 утилизировали глюкозу, галактозу, глицерин, а-метил-D-глюкозид, мальтозу, сахарозу, трегалозу, раффинозу.

Отрицательные результаты теста были выявлены на: 2-кето-Д-глюканате, L-арабинозе, D-ксилозе, адоните, ксилите, инозите, сорбите, N-ацетил-D-глюкозамине, целлобиозе, лактозе, мелицитозе.

При проведении кариотипирования генетического материала штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194 показано, что в его кариотипе имеются диморфные хромосомы.

Штамм хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде YEPD, при температуре 4±2°С 1 год.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Исследование действительной степени сбраживания пивного сусла штаммом ВКПМ Y-3194 и его способности к образованию этанола.

Посевную культуру Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194 выращивают 48 часов при 24°С в пробирке со скошенным агаром, затем асептично переносят смыв клеток с поверхности агара в две 1 л колбы с 250 мл 12%-ного сусла и выращивают при периодическом перемешивании (5 мин через 2 часа) при 24°С в течение 24 час.

Выращенную культуру инокулируют в две 5 л колбы с 1,5 л 12%-ного сусла и снова выращивают 24 часа при периодическом перемешивании (5 мин через 2 часа) при 24°С.

Культуру из обеих колб переносят в колбу Карлсберга с 18 л 12%-ного сусла, выращивают 24 часа при комнатной температуре и передают на минипивзавод для дальнейшего культивирования.

Культивирование штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194 осуществляют на минипивзаводе Berplan Harter GMBH в 500 л цилиндроконическом танке с 120 л 12%-ного сусла при температуре 14°С.

Для дальнейшего анализа через определенные промежутки времени асептично отбирают пробы объемом 200 мл.

Действительную степень сбраживания (RDF - real degree of fermentation in %) и концентрацию этанола в продукте определяют с помощью алколайзера фирмы AntonPaar.

В качестве контрольного штамма используют штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2945 (прототип).

Результаты возрастания действительной степени сбраживания сусла штаммом ВКПМ Y-3194 по сравнению с контрольным штаммом приведены в табл.1. Из представленных результатов видно, что штамм ВКПМ Y-3194 быстрее сбраживает пивное сусло, т.е. является более технологичным.

Таблица 1
Сравнение действительной степени сбраживания контрольного штамма и штамма ВКПМ Y-3194
Время (ч)	Действительная степень сбраживания % (контрольный штамм) RDF%	Действительная степень сбраживания % (штамм ВКПМ Y-3194) RDF%
2	10	13
19	14	29
87	27	39
109	34	44,5
133	39	49
157	44	52
181	48	56,6
205	-	60
253	-	64
277	62	65

В табл.2 представлена информация о количестве этанола, образующемся при культивировании указанных штаммов. Из приведенных результатов следует, что штамм ВКПМ Y-3194 образует этанол с большей скоростью.

Таблица 2
Образование этанола при культивировании контрольного штамма и штамма ВКПМ Y-3194
Время (ч)	% этанола v/v (контрольный штамм)	% этанола v/v (штамм ВКПМ Y-3194)
2	0,85	1
19	1,21	2,16
87	2,24	2,9
109	2,82	3,3
133	3,25	3,6
157	3,67	3,9
181	4,02	4,2
205	-	4,5
253	_-	4,79

Высокое образование этанола в результате эффективного сбраживания субстрата является важнейшим технологическим свойством штамма при производстве пива (Dragone G., Silva D.P., de Almeida e Silva J.B., de Almeida Lima U. Improvement of the ethanol productivity in a high gravity brewing at pilot plant scale/ Biotechnology Letters 25: 1171-1174, 2003).

Пример 2. Исследование способности штамма ВКПМ Y-3194 к редукции диацетила.

Во время брожения образуются альдегиды и кетоны, оказывающие нежелательное влияние на аромат пива. Вицинальные дикетоны 2,3-бутадион (диацетил) и 2,3-пентандион придают пиву нежелательную «маслянистую ноту», поэтому способность к быстрой редукции диацетила важна для штамма, используемого в пивоваренной промышленности

Культивирование проводят по примеру 1. Концентрацию диацетила определяют методом газовой хроматографии на хроматографе Shumadzu.

Данные представлены в табл.3.

Из таблицы 3 видно, что штамм Y-3194 редуцирует диацетил на трое суток быстрее. Это технологическое свойство штамма имеет большое значение для производства пива в промышленном масштабе, так как позволяет увеличить мощность предприятия за счет сокращения продолжительности цикла производства.

Таблица 3
Скорость редукции диацетила при культивировании контрольного штамма и штамма ВКПМ Y- 3104
Время (ч)	Концентрация диацетила (мг/л) (контрольный штамм)	Концентрация диацетила (мг/л) (штамм ВКПМ Y-3194)
2	-	-
19		-
87	-	250
109	-	252
133	-	291
157	-	210
181	-	205
253	-	95
277	-	57
304	120	-
328	90	-
352	61	-

Кроме того, концентрация диацетила в конечном продукте, произведенном с использованием штамма ВКПМ Y-3194 меньше, чем в продукте, полученном при использовании контрольного штамма, что очень важно, так как наличие диацетила в пиве является существенным органолептическим дефектом (Petersen Е.Е., Margaritis F., Stewart R.J., Pilkington P.H., Mensour N.A. The effects of wort valine concentration on the total diacetyl profile and levels late in batch fermentations with brewing yeast Saccharomyces carlsbergensis. /Y.Am. Soc. Brew. Chem. 62(4): 131-139, 2004).

Пример 3. Исследование образования серосодержащих соединений штаммом ВКПМ Y-3194.

Культивирование проводят по примеру 1. Содержание сероводорода определяют с помощью газовой хроматографии. Отбор проб производят в герметично закрывающуюся стеклянную банку Simax. Концентрацию сероводорода определяют на газовом хроматографе фирмы Shumadzu. Результаты, приведенные в табл.4, показывают, что при культивировании штамма ВКПМ Y-3194 образуются небольшие концентрации сероводорода, а следовательно, пиво, полученное с его использованием, обладает лучшими органолептическими свойствами (Duan W., Roddick F. A., Higgins V., Rogers P.J. A partial analysis of H₂S and SO₂ formation by brewing yeast in response to sulfur-containing amino acids and ammonium ions. / J. Am. Soc. Brew. Chem. 62(1):35-41, 2004).

Таблица 4
Динамика образования сероводорода при культивировании штамма ВКПМ Y-3194
Время (час)	Концентрация сероводорода (мкг/л) (штамм ВКПМ Y-3194)*
18	-
89	5
113	2,8
137	2
163	-
187	-
216	1,8

*) Испытания проводили в цилиндроконическом танке номер 69.

Пример 4. Исследование синтеза эфиров и высших спиртов.

При культивировании дрожжей в культуральной жидкости образуются альдегиды, спирты, кислоты и, в ходе реакции между спиртами и кислотами, эфиры. Для формирования аромата пива существенно, чтобы количество этих соединений было невысоким, так как они негативно влияют на аромат и вкус пива.

Культивирование проводят по примеру 1. Содержание высших спиртов, альдегидов и эфиров, оказывающих наибольшее влияние на аромат и вкус пива, определяют с помощью газовой хроматографии. Результаты представлены в табл.5.

Из представленных данных видно, что при брожении штамма ВКПМ Y-3194 соединения, негативно изменяющие органолептические свойства пива, образуются в небольших концентрациях, т.е. пиво, произведенное с использованием штамма ВКПМ Y-3194, обладает пониженным содержанием тестируемых компонентов и имеет индивидуальный профиль ароматности.

Таблица 5
Содержание эфиров, альдегидов и высших спиртов в пиве, произведенном с использованием контрольного штамма и штамма ВКПМ Y-3194
	Концентрация альдегидов (мг/л)	Концентрация эфиров (мг/л)	Концентрация спиртов (мг/л)
ВКПМ Y-3194	2,2	13,1	93

Пример 5. Дегустационная оценка органолептических свойств пива.

Органолептическая оценка пива, произведенного с использованием штамма ВКПМ Y-3194, проведенная дегустационной комиссией показала, что пиво обладает пониженным содержанием сероорганических компонентов и имеет индивидуальный ароматический профиль.

Таким образом, получен штамм Saccharomyces cerevisiae штамм ВКПМ Y-3194, имеющий следующие характерные особенности:

- оптимальный рост на производственных средах в условиях глубинной ферментации;

- быстрое и эффективное сбраживание моно-, ди- и трисахаридов пивного сусла с образованием большого количества этанола;

- пониженное содержание диацетила в конечном продукте;

- пониженное образование серосодержащих соединений;

- пониженный синтез альдегидов, эфиров и высших спиртов

Пиво, полученное с использованием штамма ВКПМ Y-3194, имеет улучшенные органолептические свойства: сбалансированный вкус и тонкий аромат, а также обладает высокой органолептической стабильностью.

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3194 для применения в пивоваренной промышленности.