Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к новым производным гиалуроновой кислоты, которые могут быть использованы в медицине и фармакологии. Описываются производные гиалуроновой кислоты общей формулы

, где R=ОН или R1 и соотношение R1:OH изменяется от 8:92 до 100:0

, , , ,

, , ,

, ,

, , ,

обладающие пониженной биодеградируемостью по сравнению с природной гиалуроновой кислотой. 3 ил., 1 табл.

Реферат

Изобретение относится к новым химическим веществам, а именно к производным гиалуроновой кислоты, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии.

Гиалуроновая кислота (ГК) относится к классу гликозаминогликанов - гетерополисахаридов линейного строения, является основным веществом внеклеточного матрикса, выполняет важные функции в живых организмах и состоит из повторяющихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина:

Высокомолекулярная ГК (М˜106 Да) входит в состав вискоэластичных гелей "Provisk" (Швеция) и "Healon" (Канада), применяющихся в офтальмохирургии при операциях экстракции катаракты, является действующим веществом в пленках "Seprafilm" для предупреждения спаечной болезни брюшины. Гидрогель на основе комплексной соли ГК с хлоридом железа (III) (0.5% FeCl3) предложен в качестве барьерного материала (фирма "Этикон") и предназначается для профилактики спаечной болезни в абдоминальной хирургии. Низкомолекулярной ГК пропитывают салфетки "Гиаплюс" (г. Тула), используемые для лечения ожоговой болезни. Лекарственное средство "Куриозин" (Гедеон Рихтер, Венгрия), представляющее собой цинковую соль ГК, используется для лечения трофических язв и угрей, препарат "Цистистат" восстанавливает функции слизистой оболочки мочевого пузыря при интерстициальном цистите, препараты "Sinvisc", "Viscorneal-Ortho" и др. предназначаются для внутрисуставного введения и применяются для лечения артритов различной этиологии. ГК является также компонентом косметических кремов и тоников для стимуляции роста волос.

В последние годы проявляется большой интерес к получению и исследованию биологических свойств химически модифицированной ГК. Химическая модификация может придать ГК дополнительные медикаментозные свойства, можно также ожидать значительного изменения физико-химических и биологических свойств модифицированной ГК (биодоступность, биодеградируемость), существенного расширения областей применения производных ГК как самостоятельных лекарственных препаратов, так и в качестве адъювантов (в качестве систем доставки лекарственных средств).

Пониженная биодеградируемость может быть полезной функцией производных ГК, поскольку целью химической модификации полимеров чаще всего является пролонгирование терапевтического действия ковалентно связанных с полимерной матрицей лекарств. Известны некоторые производные ГК, биодеградируемость которых под действием субстратспецифичного фермента гиалуронидазы является значительно более низкой, чем природной ГК. Низкая биодеградируемость достигалась кросс-сшивкой молекул ГК дигидразидами или тригидразидами различного строения в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) [Vercruysse K.P., Marecak D.M., Marecak J.F., Prestwich G.D. // Bioconj. Chem. 1997. V. 8(5). P. 686-694; Prestwich G.D., Marecak D.M., Marecak J.F., Vercruysse K.P., Ziebell M.R. // J.Controll. Rel. 1998. V.53. P.99]. Реакцией с триметилсилилдиазометаном получена ГК, в которой карбоксильные группы полностью метилированы. Такая этерифицированная ГК не деполимеризуется под действием гиалуронидазы или гиалуронангидролазы, но является субстратом для хондротин-ACI лиазы из Flavobacterium heparinium и хондротин-ACII лиазы из Arthrobacter aurescens [К. Hirano, S. Sakai, T. Ishikawa, F.Y. Avci, R.J. Linhardt, T.Toida // Carbohydr. Res. 2005. V.430 (14), 2297-2304].

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются структурные аналоги ГК, полученные взаимодействием ГК с фармакозначимыми аминами в присутствии КДИ в качестве конденсирующего реагента [Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Вахрушева Е.С. и др. // Биоорг. химия. 2005. Т.31. №1. С.90-95; Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. 2007. 110 С. (www.anrb.ru/ink, диссер. совет)]. Практически все полученные этим способом конъюгаты ГК наряду с амидными группами содержат звенья с изоуреидокарбонильными группами, образовавшимися в результате присоединения КДИ к карбоксигруппам ГК, и растворимость конъюгатов в воде сильно зависит от содержания этих звеньев. Ферментативная биодеградируемость конъюгатов ГК под действием гиалуронидазы зависит как от природы, так и от содержания модифицированных звеньев. Биодеградируемость конъюгатов ГК с содержанием остатков фармакозначимых аминов до 30% сохраняется на уровне природной ГК, с дальнейшим увеличением конверсии карбоксигрупп биодеградируемость снижается. Значительное снижение биодеградируемости наблюдается только для конъюгатов, содержащих значительное количество уреидных звеньев и обладающих, вследствие этого, ограниченной растворимостью в воде (например, конъюгаты ГК с таурином, ГК со стрептоцидом).

Задачей предлагаемого изобретения является получение обладающих пониженной биодеградируемостью производных гиалуроновой кислоты (ГК). Это достигается следующим образом. ГК селективно окисляют по первичным гидроксигруппам в системе 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1-оксил радикал (TEMPO)-NaBr-NaClO-H2O (pH 10.2, 0°С), получая в составе окисленной ГК (ГКох) звенья N-ацетил-D-глюкозаминуроновой кислоты [Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo М. // Carbohydr. Res. 2000. V.327. P.455-461]. Затем в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) конъюгацией собственных и введенных в результате окисления карбоксигрупп ГК с фармакозначимыми первичными аминами получают целевые конъюгаты с варьируемым (в зависимости от соотношения реагентов) содержанием соответствующего фармакофора (схема). Следует отметить, что при использовании ГКох удается увеличить фармакологическую нагрузку на молекулу полисахарида - вплоть до ˜100% конверсии карбоксигрупп в амидные (в расчете на моносахаридное звено), причем во всех конъюгатах практически отсутствуют продукты присоединения КДИ по карбоксигруппам ГКох, то есть звенья с уреидокарбонильными группами. Растворимость в воде хорошая.

Схема

,

где R=OH и R1 в конъюгатах, и содержащие R1 сооставляет 8-100% мольн. в расчете на моносахаридное зерно, n=100-150

, , , ,

, , ,

, , ,

, , ,

Реакцию ГКох с аминами проводят в присутствии КДИ при различных соотношениях реагентов в водной среде (рН 4.7-4.8) при комнатной температуре в течение 20-30 мин. В качестве соединений, содержащих аминогруппу, используют n- (1) и о-аминофенолы (2), n-аминобензойную (3), антраниловую (4), 4- (5) и 5-аминосалициловые (6) кислоты, этиловый эфир n-аминобензойной кислоты (анестезин) (7), β-диэтиламиноэтиловый эфир n-аминобензойной кислоты (новокаин) (8), гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид) (9), 2-аминоэтансульфоновую кислоту (таурин) (10), 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон-5 (4-аминоантипирин) (11), а также сульфаниламидные препараты, содержащие свободную аминогруппу, такие как n-аминобензолсульфамид (стрептоцид) (12), n-аминобензолсульфацетамид-натрий (сульфацил-натрий) (13) и др. Для модификации ГКох можно применять α-аминокислоты (глицин, лизин и др.) или их эфиры, различные диамины (гидразин, этилендиамин, гексаметилендиамин) и дигидразиды, например дигидразид адипиновой кислоты. В зависимости от соотношения реагентов (от ГКох:амин:КДИ=1:0.12:0.25 до ГКох:амин:КДИ=1:1.5:1.5, в расчете на моносахаридное звено ГКох) получают конъюгаты с различным содержанием остатков амина R1 - от 8 до ˜100% мольн. в расчете на моносахаридное звено ГКох.

Содержание остатков амина R1 (т.е. конверсию карбоксильных групп ГКох в амидные) определяют по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии, используя интегральные интенсивности характеристических сигналов протонов остатков конъюгированных с ГКох соответствующих аминов по отношению к интенсивности сигнала метильных протонов ацетамидной группы в области 2 м.д. как внутреннему стандарту.

Спектры 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР регистрируют для растворов в D2O на спектрометре Bruker АМХ-300 (рабочая частота для 1Н-ЯМР-300.13 МГц), в качестве внутреннего стандарта используют натриевую соль 3-(триметилсилил)-1-пропансульфоновой кислоты. УФ-спектры получают на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводят с помощью рН-метра «рН-340».

ГКох и ее конъюгаты, как определено после инкубации с ферментом гиалуронидазой, проявляют более низкую биодеградируемость по сравнению с немодифицированной ГК.

Биодеградируемость ГКох и ее производных (в сравнении с природной ГК) оценивают по разработанной авторами методике, которая заключается в следующем: 0.01 ммоль соответствующего образца помещают в центрифужную пробирку V=10 мл, растворяют в 1 мл буфера (30 мМ лимонная кислота/150 мМ Na2HPO4/150 мМ NaCl; pH 6.3), затем добавляют 3 ед. гиалуронидазы (препарат Лидаза) в 0.1 мл того же буфера, инкубируют при 37°С в течение 20 ч. По окончании ферментативной реакции в каждую пробирку добавляют 4 мл охлажденной до 0°С смеси метанол/диэтиловый эфир (3:1) и выдерживают при 0°С в течение 1 ч для полноты осаждения полимера, не подвергшегося ферментативному расщеплению. Выпавшие осадки отделяют центрифугированием, супернатанты, содержащие не осаждающиеся смесью MeOH/Et2O (3:1) низкомолекулярные продукты ферментативной деградации, помещают в стеклянные стаканы и упаривают досуха. Каждый высушенный образец растворяют в аликвоте воды V=5 мл, отбирают пробу и спектрофотометрически анализируют содержание уроновых кислот карбазоловым методом по Дише, λ=530 нм [Методы химии углеводов: Пер. с англ. М.: Мир, 1967. Под редакцией Н.А. Кочеткова]. За показатель биодеградируемости принимают величину оптической плотности раствора хромофора (при λ=530 нм) испытуемого образца, рассчитанную в % от оптической плотности раствора хромофора природной ГК, которую принимают за 100%. Результаты оформляют в виде диаграмм (рис.1а-в), на которых биодеградируемость природной ГК принимают 100%-ной.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конъюгат ГКох с n-аминофенолом, R1=8%.

а) ГК селективно окисляют по первичным гидроксигруппам в системе 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1 -оксил радикал (TEMPO)-NaBr-NaClO-H2O (рН 10.2) [Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo M. // Carbohydr. Res. 2000. V.327. P.455-461]. Условия реакции окисления ГК: рН 10.2, 0°С, TEMPO = 0.027 ммоль, NaBr = 0.5 ммоль, ГК = 2.5 ммоль в 200 мл воды, и 4 мл 13%-го водного раствора гипохлорита натрия (NaClO). Окисленный продукт из водного раствора выделяют осаждением в метанол. Осадок отделяют центрифугированием, промывают метанолом, диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении и температуре не выше 60°С. Получают водорастворимый порошок белого цвета. Количественное определение уроновых кислот в ГКох по стандартной методике реакции Дише показывает, что хромофор, поглощающий при 530 нм, образует только D-глюкуроновая кислота. Содержание D-глюкуроновой кислоты составляет 45.2% масс. (теоретически рассчитано - 44.4% масс.),

13С NMR ГКох (D2О): δ 177.5, 177.2, 176.4 (С=O), 105.3, 102.8, 83.7, 82.8, 78.7, 78.2, 75.9, 74.7, 69.9, 56.6, 24.9 (СН3CONH). Как видно из спектра 13С ЯМР, вместо двух синглетов атомов углерода СООН-группы D-глюкуроновой кислоты и СН3CONH-группы, в области 176-178 м.д. наблюдается третий синглет, отвечающий атому углерода вновь образовавшейся СООН-группы. При этом сигнал атома углерода CH2OH-групп в области 62-63 м.д. отсутствует, что свидетельствует о полной трансформации первичных гидроксигрупп ГК в карбоксильные (схема). Как видно из рис.1.а, при используемых условиях ферментативной обработки ГКох не является субстратом для гиалуронидазы.

б) К смеси 60 мг (˜0.3 ммоль СООН-групп) ГКох и 3.7 мг (0.036 ммоль) n-аминофенола (1) в 15 мл Н2О добавляют 0.1 н. NaOH до рН 4.7-4.8, затем при интенсивном перемешивании и температуре 20-22°С вносят 10.8 мг (0.056 ммоль) карбодиимида (соотношение реагентов ГКох:n-аминофенол:КДИ=1:0.12:0.25 в расчете на одну карбоксигруппу ГКох), поддерживая рН 4.7-4.8 титрованием 0.1 н. HCl. Через 0.5 ч к охлажденной до 0°С реакционной смеси последовательно добавляют 0.1 н. NaOH (до рН 7-8), 2-3 мл насыщенного раствора NaCl и 45 мл охлажденного метанола. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл 6% NaCl, добавляют 30 мл метанола. Вновь выпавший осадок центрифугируют, промывают метанолом (10×3 мл), затем эфиром (10×3 мл) и сушат при температуре ≤60°С и пониженном давлении. Получают ˜60 мг конъюгата в виде белого порошка, растворимого в воде. Содержание остатков R1 (или конверсия карбоксигрупп ГКох в амидные) в конъюгате ГКох с n-аминофенолом составляет 8% в расчете на моносахаридное звено ГКох. Аналогично ГКох этот конъюгат не является субстратом для гиалуронидазы.

Пример 2. Конъюгаты ГКох с n-аминофенолом, R1=25-100%.

Конъюгаты ГКох с содержанием остатков n-аминофенола 25% (табл.), 27%, 30%, 37%, 46% и 100% получают аналогично примеру 1, при этом используют другие соотношения реагентов. При соотношении ГКох:n-аминофенол:КДИ=1:0.5:0.38 получают конъюгат с содержанием R1=25%, 1:0.5:0.45 - R1=27%, 1:0.5:0.5 - R1=30%, 1:0.6:0.75 - R1=37%, 1:1:0.75 -Rl=46% и при 1:1.5:1.5 - Rl˜100%.

С увеличением содержания остатков n-аминофенола биодеградируемость конъюгатов возрастает по сравнению с ГКох, но уровня природной ГК не достигает (рис.1а). Биодеградируемость конъюгата с содержанием R1˜100% не приводится, поскольку в цитратном буфере (рН 6.5) он не растворяется.

Пример 3. Конъюгаты ГКох с аминами 2-13 синтезируют аналогично примерам 1 и 2. В таблице приведены характеристики конъюгатов, полученных при соотношении ГКох:2-13:КДИ=1:0.5:0.38. Значения биодеградируемости соответствующих конъюгатов 2а-13а зависят от природы амина и значительно меньше биодеградируемости природной ПС (рис.1б).

Таблица
КонъюгатСодержание R1 (% в расчете на моносахаридное звено) в конъюгатах, полученных при соотношении ГКох:1-13:КДИ=1:0.5:0.38Характеристичекие сигналы остатков аминов в 1Н ЯМР-спектрах конъюгатов, δ, м.д.
257.41, 7.39, 7.00, 6.98
357.59, 7.57, 7.28, 7.26, 7.09, 7.06
368.04, 7.70
198.31, 8.02, 8.00, 7.64, 7.58, 7.33
307.89, 7.86, 7.25, 7.16, 7.11, 7.08
237.98, 7.59, 7.56, 7.05, 7.02
318.12, 7.71
308.11, 7.74
358.80, 7.90
10а23*-
11а357.68, 7.52, 7.49
12а308.01, 7.98, 7.84, 7.81
13а208.01, 7.99, 7.83, 7.81
* Определено элементным анализом на S.

Для конъюгатов ГКОХ с 4-аминоантипирином с содержанием R1=10-90% также приведена зависимость биодеградируемости от содержания остатков амина (рис. 1в).

Производные гиалуроновой кислоты общей формулы:

где R=OH и R1 в конъюгатах, n=100-150

, , , ,

, , ,

, , ,

, , ,

где содержание R1 составляет 8-100% в расчете на моносахаридное звено, полученные взаимодействием окисленной гиалуроновой кислоты с соответствующим фармакозначимым первичным амином, обладающие пониженной биодеградируемостью.