Органические соединения

Органические соединения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим агонист сфингозин-1 -фосфатного рецептора. Сфингозин-1-фосфат (ниже в настоящем описании обозначен как «S1P») представляет собой встречающийся в естественных условиях сывороточный липид. В настоящее время известно 8 рецепторов S1P, а именно S1P1 - S1P8. Агонисты рецептора S1P обладают способностями ускорять хоминг лимфоцитов.

Агонисты рецептора S1P представляют собой иммуномодуляторы, которые вызывают лимфопению, обусловленную перераспределением, предпочтительно обратимым, лимфоцитов из кровотока во вторичную лимфатическую ткань, что приводит к генерализованной иммуносупрессии. Нестимулированные клетки подвергаются разрушению, происходит стимуляция миграции CD4- и CD8-T-клеток и В-клеток из кровотока в лимфатические узлы (ЛУ) и пейеровы бляшки (БП), в результате чего ингибируется инфильтрация клеток в трансплантированные органы.

Различные известные агонисты рецептора S1P обладают структурным сходством, что вызывает связанные с этим проблемы при создании требуемого препарата. Прежде всего существует необходимость в создании содержащего агонист рецептора S1P препарата, хорошо приспособленного для орального введения в твердой форме, например в форме таблетки или капсулы.

В соответствии с этим в настоящем изобретении предложена твердая фармацевтическая композиция для орального введения, содержащая агонист рецептора S1P и сахарный спирт.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что твердые композиции, содержащие сахарный спирт, позволяют создавать препараты, наиболее хорошо приспособленные для орального введения агонистов рецептора S1P. Композиции представляют собой удобное средство для системного введения агонистов рецептора S1P, не имеют недостатков, присущих жидким препаратам для инъекции или для орального применения, и обладают хорошими физико-химическими свойствами и способностью к хранению. Прежде всего, композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут характеризоваться высоким уровнем однородности распределения агониста рецептора S1P в композиции, а также высокой стабильностью. Композиции, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать на высокоскоростном автоматическом оборудовании и тем самым не требуется осуществлять капсуляцию вручную.

Агонисты рецептора S1P как правило представляют собой аналоги сфингозина, такие как 2-замещенные 2-аминопропан-1,3-диольные или 2-аминопропанольные производные. Примерами пригодных агонистов рецептора S1P являются, например, соединения, описанные в ЕР 627406 А1, например соединение формулы I

в которой R₁ обозначает прямую или разветвленную (С₁₂-С₂₂)-углеродную цепь,

- причем указанная цепь может нести связь или гетероатом, выбранные из двойной связи, тройной связи, О, S, NR₆, где R₆ обозначает Н, алкил, аралкил, ацил или алкоксикарбонил, и карбонила, и/или

- может иметь в качестве заместителя алкоксигруппу, алкенилоксигруппу, алкинилоксигруппу, аралкилоксигруппу, ацил, алкиламиногруппу, алкилтиогруппу, ациламиногруппу, алкоксикарбонил, алкоксикарбониламиногруппу, ацилоксигруппу, алкилкарбамоил, нитрогруппу, галоген, аминогруппу, гидроксииминогруппу, гидроксигруппу или карбоксигруппу; или

R₁ обозначает

- фенилалкил, в котором алкил обозначает прямую или разветвленную (С₆-С₂₀)-углеродную цепь; или

- фенилалкил, в котором алкил обозначает прямую или разветвленную (С₁-С₃₀)-углеродную цепь, где фенилалкил замещен

- прямой или разветвленной (С₆-С20)-углеродной цепью, необязательно замещенной галогеном,

- С₆-С₂₀алкоксигруппой с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенной галогеном,

- С₆-С₂₀алкенилоксигруппой с прямой или разветвленной цепью,

- фенилалкоксигруппой, галофенилалкоксигруппой, фенилалкоксиалкилом, феноксиалкоксигруппой или феноксиалкилом,

- циклоалкилом, замещенным С₆-С₂₀алкилом,

- гетероарилалкилом, замещенным С₆-С₂₀алкилом,

- гетероциклическим С₆-С₂₀алкилом, или

- гетероциклическим алкилом, замещенным С₆-С₂₀алкилом,

и где

алкильная группа может нести

- в углеродной цепи связь или гетероатом, выбранные из двойной связи, тройной связи. О, S, сульфинила, сульфонила или NR₆, где R₆ имеет указанные выше значения, и

- в качестве заместителя алкоксигруппу, алкенилоксигруппу, алкинилоксигруппу, аралкилоксигруппу, ацил, алкиламиногруппу, алкилтиогруппу, ациламиногруппу, алкоксикарбонил, алкоксикарбониламиногруппу, ацилоксигруппу, алкилкарбамоил, нитрогруппу, галоген, аминогруппу, гидроксигруппу или карбоксигруппу; и

R₂, R₃, R₄ и R₅ каждый независимо друг от друга обозначает Н, С₁-С₄алкил или ацил,

или его фармацевтически приемлемая соль;

- соединения, описанные в ЕР 1002792 А1, например соединение формулы II

в которой m обозначает 1-9 и R'₂, R'₃, R'₄ и R'₅ каждый независимо друг от друга обозначает Н, алкил или ацил,

или его фармацевтически приемлемая соль;

- соединения, описанные в ЕР 0778263 А1, например соединение формулы III

в которой W обозначает Н; C₁-С₆алкил, С₂-С₆алкенил или С₂-С₆алкинил; незамещенный или замещенный ОН-группой фенил; R''₄O(CH₂)n; или С₁-С₆алкил, замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, С₃-С₈циклоалкил, фенил и фенил, замещенный ОН;

Х обозначает Н или незамещенный или замещенный алкил с прямой цепью, несущий р атомов углерода, или незамещенную или замещенную алкоксигруппу с прямой цепью, несущую (р-1) атомов углерода, например замещенную 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего C₁-С₆алкил, ОН, C₁-С₆алкоксигруппу, ацилоксигруппу, аминогруппу, C₁-С₆алкиламиногруппу, ациламиногруппу, оксогруппу, галоC₁-С₆алкил, галоген, незамещенный фенил и фенил, замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего C₁-С₆алкил, ОН, C₁-С₆алкоксигруппу, ацил, ацилоксигруппу, аминогруппу, C₁-С₆алкиламиногруппу, ациламиногруппу, галоС₁-С₆алкил и галоген; Y обозначает Н, C₁-С₆алкил, ОН, С₁-С₆алкоксигруппу, ацил, ацилоксигруппу, аминогруппу, C₁-С₆алкиламиногруппу, ациламиногруппу, галоС₁-С₆алкил или галоген; Z₂ обозначат простую связь или алкилен с прямой цепью, несущий q атомов углерода,

где р и q каждый независимо друг от друга обозначает целое число от 1 до 20 при условии, что 6≤p+q≤23, m' обозначает 1, 2 или 3, n обозначает 2 или 3, R''₁, R''₂, R''₃ и R''₄ каждый независимо друг от друга обозначает Н, С₁-С₄алкил или ацил,

или его фармацевтически приемлемая соль;

- соединения, описанные в WO 02/18395, например соединение формулы IVa или IVb

или

в котором Х_а обозначает О, S, NRis или группу -(СН₂)_na-, где группа является незамещенной или замещена 1-4 атомами галогена; n_а обозначает 1 или 2, R_1s обозначает Н или С₁-С₄алкил, где алкил является незамещенным или замещен галогеном; R_1a обозначает Н, ОН, С₁-С₄алкил или O(С₁-С₄)алкил, где алкил является незамещенным или замещен 1-3 атомами галогена; R_1b обозначает Н, ОН или (С₁-С₄)алкил, где алкил является незамещенным или замещен галогеном;

R_2a каждый независимо друг от друга выбран из Н или С₁-С₄алкила, где алкил является незамещенным или замещен галогеном; R_3a обозначает Н, ОН, галоген или O(С₁-С₄)алкил, где алкил является незамещенным или замещен галогеном; и R_3b обозначает Н, ОН, галоген, С₁-С₄алкил, где алкил является незамещенным или замещен гидроксигруппой, или O(С₁-С₄)алкил, где алкил является незамещенным или замещен галогеном; Y_a обозначает -CH₂-, -C(O)-, -СН(ОН)-, -C(=NOH)-, О или S, и R_4a обозначает С₄-С₁₄алкил или С₄-С₁₄алкенил;

или его фармацевтически приемлемая соль или гидрат;

- соединения, описанные в WO 02/076995, например соединение формулы V

в которой

m_c обозначает 1, 2 или 3;

Х_а обозначает О или прямую связь;

R_1c обозначает Н, C₁-С₆алкил, необязательно замещенный ОН, ацилом, галогеном, С₃-С₁₀циклоалкилом, фенилом или гидроксифениленом; С₃-С₆алкенил; С₂-С₆алкинил; или фенил, необязательно замещенный ОН;

R_2c обозначает

в которой R_5c обозначает Н, С₁-С₄алкил, необязательно замещенный 1, 2 или 3 атомами галогена, и R_6c обозначает Н или С₁-С₄алкил, необязательно замещенный галогеном;

R_3c и R_4c каждый независимо друг от друга обозначает Н, С₁-С₄алкил, необязательно замещенный галогеном, или ацил, и

R_c обозначает С₁₃-С₂₀алкил, который необязательно может нести в цепи атом кислорода и который необязательно может быть замещен нитрогруппой,

галогеном, аминогруппой, гидроксигруппой или карбоксигруппой; или группу формулы (а)

в которой R_7c обозначает Н, C₁-C₄алкил или С₁-С₄алкоксигруппу, и R_8c обозначает замещенный C₁-С₂₀алканоил, фенилС₁-С₁₄алкил, где С₁-С₁₄алкил необязательно замещен галогеном или ОН, циклоалкилС₁-С₁₄алкоксигруппу или фенилС₁-С₁₄алкоксигруппу, где циклоалкильное или фенильное кольцо необязательно замещено галогеном, С₁-С₄алкилом и/или С₁-С₄алкоксигруппой, фенилС₁-С₁₄алкоксиС₁-С₁₄алкил,

феноксиС₁-С₁₄алкоксигруппу или феноксиС₁-С₁₄алкил,

R_c обозначает также группу формулы (а), в котором R_8c обозначает C₁-С₁₄алкоксигруппу, когда R_1c обозначает С₁-С₄алкил, С₂-С₆алкенил или C₂-С₆алкинил,

или соединение формулы VI

в которой

n_x обозначает 2, 3 или 4

R_1x обозначает Н, C₁-С₆алкил, необязательно замещенный ОН, ацилом, галогеном, циклоалкилом, фенилом или гидроксифениленом; С₂-С₆алкенил; С₂-С₆алкинил; или фенил, необязательно замещенный ОН;

R_2x обозначает Н; С₁-С₄алкил или ацил

R_3x и R_4x каждый независимо друг от друга обозначает Н, С₁-С₄алкил, необязательно замещенный галогеном или ацилом,

R_5x обозначает Н, С₁-С₄алкил или С₁-С₄алкоксигруппу, и

R_6x обозначает С₁-С₂₀алканоил, замещенный циклоалкилом; циклоалкилС₁-С₁₄алкоксигруппу, где циклоалкильное кольцо необязательно замещено галогеном, С₁-С₄алкилом и/или С₁-С₄алкоксигруппой; фенилС₁-С₁₄алкоксигруппу, где фенильное кольцо необязательно замещено галогеном, С₁-С₄алкилом и/или С₁-С₄алкоксигруппой,

R_6x может обозначать также С₄-С₁₄алкоксигруппу, когда R_1x обозначает С₂-С₄алкил, замещенный ОН, или пентилоксигруппу или гексилоксигруппу, когда R_1x обозначает С₁-С₄алкил,

при условии, что R_6x не обозначает фенилбутиленоксигруппу, когда либо R_5x обозначает Н, либо R_1x обозначает метил, или его фармацевтически приемлемая соль.

- соединения, описанные в WO 02/06268 A1, например соединение формулы VII

в которой R_1d и R_2d каждый независимо друг от друга обозначает Н или аминозащитную группу;

R_3d обозначает водород, гидроксизащитную группу или группу формулы

R_4d обозначает (низш.)алкил;

n_d обозначает целое число от 1 до 6;

X_d обозначает этилен, винилен, этинилен, группу формулы -D-CH₂- (в которой D обозначает карбонил, -СН(ОН)-, О, S или N), арил или арил, имеющий вплоть до трех заместителей, выбранных из указанной ниже группы а;

Y_d обозначает простую связь, C₁-С₁₀алкилен, C₁-С₁₀алкилен, имеющий вплоть до трех заместителей, выбранных из групп а и б, C₁-С₁₀алкилен, несущий О или S в середине или на конце углеродной цепи, или C₁-С₁₀алкилен, несущий О или S в середине или на конце углеродной цепи, который имеет вплоть до трех заместителей, выбранных из групп а и б;

R_5d обозначает водород, циклоалкил, арил, гетероцикл, циклоалкил, имеющий вплоть до трех заместителей, выбранных из групп а и б, арил, имеющий вплоть до трех заместителей, выбранных из групп а и б, или гетероцикл, имеющий вплоть до трех заместителей, выбранных из групп а и б;

R_6d и R_7d каждый независимо друг от друга обозначает Н или заместитель, выбранный из группы а;

R_6d и R_9d каждый независимо друг от друга обозначает Н или

C₁-C₄алкил, необязательно замещенный галогеном;

«группа а» включает галоген, (низш.)алкил, галоген(низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, (низш.)алкилтиогруппу, карбоксил, (низш.)алкоксикарбонил, гидроксигруппу, алифатический (низш.)ацил, аминогруппу, моно(низш.)алкиламиногруппу, ди(низш.)алкиламиногруппу, алифатическую (низш.)ациламиногруппу, цианогруппу или нитрогруппу; и «группа б» включает циклоалкил, арил, гетероцикл, каждый из которых необязательно имеет вплоть до трех заместителей, выбранных из группы а; при условии, что когда R_5d обозначает водород, Y_d не обозначает простую связь и линейный C₁-С₁₀алкилен, или его фармакологически приемлемая соль или сложный эфир;

- соединения, описанные в JP-14316985 (JP 2002316985), например соединение формулы VIII

в котором R_1e, R_2e, R_3e, R_4e, R_5e, R_6e, R_7e, n_e, Х_е И Y_e имеют значения, указанные в JP-14316985;

или его фармакологически приемлемая соль или сложный эфир;

- соединения, описанные в WO 03/29184 и WO 03/29205, например соединение формулы IX

в которой

X_f обозначает О или S и R_1f, R_2f, R_3f и n_f имеют значения, указанные в WO 03/29184 и WO 03/29205,

R_4f и R_5f каждый независимо друг от друга обозначает Н или группу формулы

в которой R_8f и R_9f каждый независимо друг от друга обозначает Н или C₁-С₄алкил, необязательно замещенный галогеном; например 2-амино-2-[4-(3-бензилоксифенокси)-2-хлорфенил]пропил-1,3-пропандиол или 2-амино-2-[4-(бензилоксифенилтио)-2-хлорфенил]пропил-1,3-пропандиол, или его фармакологическая соль.

- соединения, описанные в WO 03/062252 А1, например соединение формулы Х

в которой

Ar обозначает фенил или нафтил; mg и ng каждый независимо друг от друга обозначают 0 или 1; А выбран из СООН, РО₃Н₂, РО₂Н, SO₃Н, РО(С₁-С₃алкил)ОН и 1H-тетразол-5-ила; R_1g и R_2g каждый независимо друг от друга обозначает Н, галоген, ОН, СООН или С₁-С₄алкил, необязательно замещенный галогеном; R_3g обозначает Н или С₁-С₄алкил, необязательно замещенный галогеном или ОН; R_4g каждый независимо друг от друга обозначает галоген или необязательно замещенные галогеном С₁-С₄алкил или C₁-С₃алкоксигруппу; и R_g и М имеют одно из значений, указанных для В и С соответственно в WO 03/062252 A1;

- соединения, описанные в WO 03/062248 A2, например соединение формулы XI

в которой

Ar обозначает фенил или нафтил; n обозначает 2, 3 или 4; А обозначает СООН, 1H-тетразол-5-ил, РО₃Н₂, PO₂Н₂, -SO₃Н или PO(R_5h)OH, где R_5h выбран из C₁-С₄алкила, гидроксиС₁-С₄алкила, фенила, -СО-С₁-С₃алкоксигруппы и -СН(ОН)фенила, где фенил или фенильная группа необязательно являются замещенными; R_1h и R_2h каждый независимо друг от друга обозначает Н, галоген, ОН, СООН или необязательно замещенный галогеном C₁-С₆алкил или фенил; R_3h обозначает Н или С₁-С₄алкил, необязательно замещенный галогеном и/или ОН; R_4h каждый независимо друг от друга обозначает галоген, ОН, СООН, С₁-С₄алкил,

S(O)(С₁-С₃)_{0,2 или 3}алкил, C₁-С₃алкоксигруппу, С₃-С₆циклоалкоксигруппу, арил или аралкоксигруппу, где арильные группы необязательно могут быть замещены 1-3 атомами галогена; и R_g и М каждый имеют одно из значений, указанных для В и С соответственно в WO 03/062248 A2.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения агонист рецептора S1P, который применяют в комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, может представлять собой также соединение, обладающее избирательным действием в отношении рецептора S1P1, например соединение, действие которого в отношении рецептора S1P1 превосходит его действие в отношении рецептора S1P3 по меньшей мере в 20 раз, например в 100, 500, 1000 или 2000 раз, что оценивали на основе соотношения значения ЕС₅₀ для рецептора S1P1 и значения ЕС₅₀ для рецептора S1P3, полученных с помощью анализа связывания 358-ГТФγS, при этом значение ЕС₅₀ указанного соединения при связывании с рецептором S1P1 составляло примерно 100нМ или менее по данным анализа связывания 358-ГТФγS. Репрезентативными агонистами рецептора S1P1 являются, например соединения, перечисленные в WO 03/061567, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки, например соединение формулы

или

В каждом случае, когда даны ссылки на заявки на патент, подразумевается, что тем самым их сущность, касающаяся соединений, включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Ацил может представлять собой группу R_y-CO-, в которой R_y обозначает C₁-С₆алкил, С₃-С₆циклоалкил, фенил или фенилС₁-С₄алкил. Если не указано иное, алкил, алкоксигруппа, алкенил или алкинил могут иметь прямую или разветвленную цепь.

Когда в соединениях формулы I углеродная цепь, представляющая собой R₁, является замещенной, то предпочтительно она замещена галогеном, нитрогруппой, аминогруппой, гидроксигруппой или карбоксигруппой. Когда углеродная цепь несет необязательно замещенный фенилен, то углеродная цепь предпочтительно является незамещенной. Когда фениленовая группа является замещенной, то предпочтительно она замещена галогеном, нитрогруппой, аминогруппой, метоксигруппой, гидроксигруппой или карбоксигруппой.

Предпочтительными соединениями формулы I являются соединения, в которых R₁ обозначает С₁₃-С₂₀алкил, необязательно замещенный нитрогруппой, галогеном, аминогруппой, гидроксигруппой или карбоксигруппой, и более предпочтительно соединения, в которых R₁ обозначает фенилалкил, замещенный С₆-С₁₄алкильной цепью, необязательно замещенной галогеном, и алкильная группа обозначает C₁-С₆алкил, необязательно замещенный гидроксигруппой. Более предпочтительно R₁ обозначает фенилС₁-С₆алкил, замещенный на фенильной группе прямой или разветвленной, предпочтительно прямой С₆-С₁₄алкильной цепью. С₆-С₁₄алкильная цепь может находиться в орто-, мета- или пара-положении, предпочтительно в пара-положении.

Предпочтительно R₂-R₅ каждый обозначают Н.

Предпочтительным соединением формулы I является 2-амино-2-тетрадецил-1,3-пропандиол. Наиболее предпочтительным агонистом рецептора S1P формулы I является FTY720, т.е. 2-амино-2-[2-(4-октилфенил)этил]пропан-1,3-диол в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли (ниже в настоящем описании обозначен как соединение А), например в форме гидрохлорида приведенной ниже формулы

Предпочтительным соединением формулы II является соединение, в котором R'₂-R'₅ каждый обозначают Н и m обозначает 4, т.е. 2-амино-2-{2-[4-(1-оксо-5-фенилпентил)фенил]этил}пропан-1,3-диол, в свободной форме или в форме его фармацевтически приемлемой соли (ниже в настоящем описании обозначено как соединение Б), например в форме гидрохлорида.

Предпочтительным соединением формулы III является соединение, в котором W обозначает СН₃, R''₁-R''3 каждый обозначают Н, Z₂ обозначает этилен, Х обозначает гептилоксигруппу и Y обозначает Н, т.е. 2-амино-4-(4-гептилоксифенил)-2-метилбутанол, в свободной форме или в форме его фармацевтически приемлемой соли (ниже в настоящем описании обозначено как соединение В), например в форме гидрохлорида. Наиболее предпочтительным является R-энантиомер.

Предпочтительным соединением формулы IVa является PTY720-фосфат (R_2a обозначает Н, R_3а обозначает ОН, Х_а обозначает О, R_1a и R_1b обозначают ОН). Предпочтительным соединением формулы IVб является фосфат соединения В (R_2a обозначает Н, R_3b обозначает ОН, Х_а обозначает О, R_1a и R_1b обозначают ОН, Y_a обозначает О и R_4a обозначает гептил). Предпочтительным соединением формулы V является фосфат соединения Б.

Предпочтительным соединением формулы V является моно[(R)-2-амино-2-метил-4-(4-пентилоксифенил)бутиловый]эфир фосфорной кислоты.

Предпочтительным соединением формулы VIII является (2R)-2-амино-4-[3-(4-циклогексилоксибутил)бензо[b]тиен-6-ил]-2-метилбутан-1-ол.

Когда соединения формул I-XIII имеют один или несколько асимметричных центров в молекуле, то под объем изобретения подпадают различные оптические изомеры, а также рацематы, диастереоизомеры и их смеси.

Примеры фармацевтически приемлемых солей соединений формул I-XIII включают соли с неорганическими кислотами, такие как гидрохлорид, гидробромид и сульфат, соли с органическими кислотами, такие как ацетат, фумарат, малеат, бензоат, цитрат, малат, метансульфонат и бензолсульфонат, или при необходимости соли с металлами, такими как натрий, калий, кальций и алюминий, соли с аминами, такими как триэтиламин, и соли с двухосновными аминокислотами, такими как лизин. Под объем соединений и солей, предлагаемых в настоящем изобретении, подпадают формы в виде гидратов и сольватов.

Связывание с рецепторами S1P можно оценивать с помощью следующих методов анализа.

А. Аффинность к связыванию агонистов рецептора S1P с индивидуальными человеческими рецепторами S1P.

Кратковременная трансфекция человеческими рецепторами S1P клеток линии НЕК293

Клонировали рецепторы S1P и протеины G1, смешивали равные количества четырех кДНК, кодирующих рецептор EDG, G_i-α, G_i-β и G_i-γ, и использовали для трансфекции монослоев клеток линии НЕК293 с помощью осаждения фосфатом кальция (М.Wigler и др., Cell., 11, 1977, с.223 и D.S. Im и др., Mol. Pharmacol., 57, 2000, с.753). В целом метод состоял в следующем. Смесь ДНК, содержащую 25 мкг ДНК и 0.25М CACL₂, добавляли к HEPES, забуференному 2 мМ Na₂HPO₄. В субконфлюентные монослои клеток линии НЕК293 вносили 25 мМ хлорохин и затем к клеткам добавляли осадок ДНК. Через 4 ч монослои промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и подпитывали средами (90% смеси (1:1) модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM):F-12+10% фетальной бычьей сыворотки). Клетки собирали через 48-72 ч после добавления ДНК путем соскабливания в буфер НМЕ (20 мМ HEPES, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4), содержащий 10% охлажденной на льду сахарозы, и разрушали с использованием гомогенизатора Dounce, После центрифугирования при 800×g, супернатант разбавляли НМЕ без добавления сахарозы и центрифугировали при 100000×g в течение 1 ч. Образовавшийся дебрис повторно гомогенизировали и центрифугировали при 100000×g в течение еще одного часа. Полученный неочищенный дебрис мембран ресуспендировали в НМЕ с добавлением сахарозы, разделяли на аликвоты и мгновенно замораживали путем погружения в жидкий азот. Мембраны хранили при -70°С. Концентрацию протеина определяли спектроскопическим путем с помощью анализа протеина по методу Брэдфорда.

Анализ связывания ГТФγS с использованием препаратов мембран рецептор S1P/HEK293

Эксперименты по оценке связывания ГТФγS осуществляли согласно методу, описанному у D.S.Im и др., Mol. Pharmacol., 57, 2000, с.753. Опосредуемое лигандом связывание ГТФγS с G-протеинами оценивали в буфере для связывания ГТФ (50 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, рН 7,5) с использованием 25 мкг препарата мембран, полученных из подвергнутых кратковременной трансфекции клеток линии НЕК293. Лиганд добавляли к мембранам в присутствии 10 мкМ ГДФ и

0,1 нМ [³⁵S] ГТФγS (1200 Ки/ммоль) и инкубировали при 30°С в течение 30 мин. Связанный ГТФγS отделяли от несвязанного с использованием харвестера Брандела (Гейтерсберг, шт.Мэриленд) и подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Композиция, предлагаемая в изобретении, предпочтительно содержит от 0,01 до 20 мас.% агонистов рецептора S1P, более предпочтительно от 0,1 до 10 мас.%, например от 0,5 до 5 мас.% в пересчете на массу всей композиции.

Сахарный спирт может действовать в качестве разбавителя, носителя, наполнителя или агента для увеличения объема и в качестве него удобно применять маннит, мальтит, инозит, ксилит или лактит, предпочтительно практически негигроскопический сахарный спирт, например маннит (D-маннит). Можно применять сахарный спирт индивидуально или использовать смесь двух или большего количества сахарных спиртов, например смесь маннита и ксилита, например в соотношении от 1:1 до 4:1.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения сахарный спирт приготавливают из высушенной распылением композиции, например композиции маннита, которая обладает большой удельной площадью поверхности. Применение композиции маннита такого типа может способствовать обеспечению однородного распределения агониста рецептора S1P в манните в композиции. Большую площадь поверхности можно получать путем создания препарата сахарного спирта, например маннита, состоящего из частиц, которые имеют меньший средний размер и/или более шероховатую поверхность каждой частицы. Было установлено также, что применение высушенного распылением сахарного спирта, например маннита, со средним размером частиц 300 мкм или менее позволяет улучшать сжимаемость и твердость таблеток, изготовленных из композиции.

Предпочтительно удельная площадь поверхности одной частицы препарата сахарного спирта, например маннита, составляет от 1 до 7, например от 2 до 6 или от 3 до 5 м²/г. Пригодный препарат маннита может иметь средний размер частиц от 100 до 300, например от 150 до 250 мкм, и насыпную плотность от 0,4 до 0,6, например от 0,45 до 0,55 г/мл. Пригодным маннитом с большой площадью поверхности является Parteck M200, поступающий в продажу от фирмы E.Merck.

Композиция предпочтительно содержит от 75 до 99,99 мас.% сахарного спирта, более предпочтительно от 85 до 99,9, например от 90 до 99,5 мас.% в пересчете на массу всей композиции.

Композиция предпочтительно содержит также замасливатель. Пригодными замасливателями являются стеариновая кислота, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, глицерилпальмитостеарат, натрийстеарилфумарат, масло канолы, гидрогенизированное растительное масло, такое как гидрогенизированное касторовое масло (например, Cutina® или Lubriwax® 101), минеральное масло, натрийлаурилсульфат, оксид магния, коллоидный диоксид кремния, кремнийорганическая жидкость, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, бензоат натрия, тальк, полоксамер или смесь любых из указанных выше веществ. Предпочтительно замасливатель представляет собой стеарат магния, гидрогенизированное касторовое масло или минеральное масло. Менее предпочтительными в качестве замасливателя являются коллоидный диоксид кремния и полиэтиленгликоль.

Композиция предпочтительно содержит от 0,01 до 5 мас.% замасливателя, более предпочтительно от 1 до 3, например примерно 2 мас.% в пересчете на массу всей композиции.

Композиция может содержать один или несколько других эксципиентов, таких как носители, связующие вещества или разбавители. В частности, композиция может содержать микрокристаллическую целлюлозу (например Avicel®), метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, крахмал (например, кукурузный крахмал) или дикальцийфосфат, предпочтительно в количестве от 0,1 до 90, например от 1 до 30 мас.% в пересчете на массу всей композиции. Если применяют связующее вещество, например микрокристаллическую целлюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, ее предпочтительно включают в количестве от 1 до 8, например от 3 до 6 мас.% в пересчете на массу всей композиции. Применение связующего вещества повышает прочность гранул препарата, что очень важно для тонких гранулятов. Микрокристаллическую целлюлозу и метилцеллюлозу наиболее предпочтительно применяют в том случае, когда требуется высокая твердость таблеток и/или более длительное время дезинтеграции. Гидроксипропилцеллюлозу предпочтительно применяют в том случае, когда требуется более быстрая дезинтеграция. При необходимости можно добавлять также ксилит в качестве дополнительного связующего вещества, например в дополнение к микрокристаллической целлюлозе, например в количестве вплоть до 20 мас.% в пересчете на сахарный спирт, например ксилит.

В одном из вариантов осуществления изобретения композиция дополнительно содержит стабилизатор, предпочтительно глицин-HCl или бикарбонат натрия. Стабилизатор может присутствовать в количестве, например от 0,1 до 30, предпочтительно от 1 до 20 мас.%.

Композиция может находиться в форме порошка, гранулы или пеллетов или в форме стандартной дозы, например в виде таблетки или капсулы. Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, хорошо приспособлены для инкапсуляции в оболочку, предназначенную для орального введения капсулы, прежде всего в твердую желатиновую оболочку.

В альтернативном варианте композиции можно спрессовывать в таблетки. На таблетки необязательно можно наносить покрытие, например из талька или полисахарида (например, целлюлозы), или покрытие из гидроксипропилметилцеллюлозы.

Если фармацевтическая капсула представляет собой стандартную дозу, то удобно, чтобы каждая стандартная доза содержала от 0,5 до 10 мг агониста рецептора S1P.

Композиции, предлагаемые в изобретении, могут иметь хорошие характеристики стабильности, что продемонстрировано в стандартных опытах по оценке стабильности, например они сохраняют стабильность при хранении в течение периода времени вплоть до одного, двух или трех лет и даже дольше. Характеристики стабильности можно определять, например, путем оценки продуктов разложения с помощью ЖХВР-анализа после хранения в течение конкретных периодов времени при конкретных температурах, например при 20, 40 или 60°С.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать стандартными методами, например с использованием общепринятых методов смешения, грануляции, нанесения сахарного покрытия, растворения или лиофилизации. Процедуры, которые можно использовать для этого, являются известными в данной области техники, например они описаны у L.Lachman и др., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3-е изд., 1986, H.Sucker и др., Pharmazeutische Technology, изд-во Thieme, 1991, Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, 4-е изд., изд-во Springer, 1971 и Remington's Pharmaceutical Sciences, 13-е изд., изд-во Mack Publ. Co., 1970 или в более поздних изданиях.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, который заключается в том, что

(а) смешивают агонист рецептора S1P с сахарным спиртом;

(б) размалывают и/или гранулируют смесь, полученную на стадии (а); и

(в) смешивают размолотую и/или гранулированную смесь, полученную на стадии (б), с замасливателем.

С использованием этого способа получают препараты, имеющие высокий уровень содержания и однородности смеси (т.е. практически однородное распределение агониста рецептора S1P в композиции), требуемое время растворения и стабильность.

Перед осуществлением стадии (а) агонист рецептора S1P, т.е. гидрохлорид 2-амино-2-[2-(4-октилфенил)этил]пропан-1,3-диола, необязательно можно тонко измельчать и/или предварительно просеивать через сито с размером ячеек от 400 до 500 мкм для удаления комков. Стадию смешения (а) можно осуществлять путем смешения агониста рецептора S1P и сахарного спирта, например маннита, в любом пригодном смесителе или миксере в течение, например, 100-400 оборотов.

Способ можно осуществлять путем сухого смешения компонентов. В этом варианте осуществления изобретения на стадии смешения (б) можно пропускать полученную на стадии (а) смесь через сито, предпочтительно имеющее размер отверстий от 400 до 500 мкм. На стадии (а) способа можно осуществлять стадию смешения всего количества агониста рецептора S1P сначала с небольшим количеством сахарного спирта, составляющего, например, от 5 до 25 мас.% от общей массы сахарного спирта, для приготовления премикса. Затем к премиксу добавляют остальную часть сахарного спирта. Стадия (а) может включать также стадию добавления к смеси раствора связующего вещества, например метилцеллюлозы и/или ксилита, например в виде водного раствора. В альтернативном варианте связующее вещество добавляют к смеси в сухом виде и на стадии грануляции добавляют воду.

Размолотую смесь, полученную на стадии (б), необязательно можно еще раз перемешивать перед смешением с замасливателем. Перед смешением замасливатель, например стеарат магния, предпочтительно просеивают, например, через сито с размером отверстий от 800 до 900 мкм.

В альтернативном варианте применяют метод мокрой грануляции. В этом варианте осуществления изобретения агонист рецептора S1P предпочтительно сначала смешивают в сухом состоянии с требуемым сахарным спиртом, например маннитом, и затем полученную смесь сахарный спирт/агонист рецептора S1P смешивают в сухом состоянии со связующим веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза или гидроксипропилметилцеллюлоза. Затем добавляют воду и смесь гранулируют, например с использованием автоматического гранулятора. Затем гранулят сушат и размалывают.

При необходимости на стадии (в) к смеси, полученной на стадии (б), можно добавлять дополнительное количество связующего вещества.

Способ может включать дополнительную стадию таблетирования или капсулирования смеси, полученной на стадии (в), например, в твердую желатиновую капсулу с использованием автоматического капсулирующего устройства. Капсулы можно окрашивать или маркировать для придания индивидуального внешнего вида и для быстрого распознавания. Применение красителей может служить как для улучшения внешнего вида, так и для идентификации капсул. Красители, пригодные для применения в фармацевтике, как правило включают каротиноиды, оксиды железа и хлорофилл. Предпочтительно капсулы, предлагаемые в изобретении, маркируют с использованием кода.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять либо индивидуально, либо в сочетании с другими действующими веществами для лечения и предупреждения состояний, например описанных в US 5604229, WO 97/24112, WO 01/01978, US 6004565, US 6274629 и JP-14316985, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Фармацевтические композиции можно применять прежде всего для

а) лечения и предупреждения отторжения трансплантата органа или ткани, например, для лечения реципиентов трансплантатов сердца, легкого, комбинированных трансплантатов сердце-легкое, печени, почек, поджелудочной железы, кожи или роговицы, и для предупреждения реакции трансплантат против хозяина, которая иногда возникает после трансплантации костного мозга; прежде всего для лечения острого или хронического отторжения алло- и ксенотрансплантата или при трансплантации инсулинпро