Производные дигидропиридина

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к производным дигидропиридина, имеющим общую формулу

или их фармацевтически приемлемым солям, где R1 является C1-6алкилом или фенилом, С1-5гетероарилом, оба необязательно замещенные одним или более заместителями, выбранными из гидрокси, амино, галогена, нитро, циано; R2, R3 независимо являются С1-4алкилом, С1-4алкоксигруппой, С2-4алкенилоксигруппой, С3-4алкинилоксигруппой, галогеном; R4 является C1-6алкилом, С3-6циклоалкилом, С3-6циклоалкилС1-4алкилом,

С6-10арилом, С6-10арилС1-4алкилом, С1-9гетероарилом, причем (гетеро)арильная группа необязательно замещена одним или более заместителями, выбранными из гидрокси, амино, галогена, нитро, трифторметила, циано, С1-4алкила, С2-4алкенила, С2-4алкинила, С1-4алкоксигруппы, С1-4(ди)алкиламиногруппы, и, если R4 является фенилом, дополнительно из С1-4алкилтиогруппы, С1-4алкилсульфонила, R5-оксикарбонила, R5-карбонила или R5,R6-aминoкapбoнилa; Х является SO2, СН2, С(O) или X отсутствует, причем, если Х является СН2, R4 может дополнительно представлять собой R5-оксиакарбонил или R5-карбонил; R5, R6 независимо являются Н, С1-4алкилом, С2-4алкенилом, С2-4алкинилом, С3-6циклоалкилом, С3-6циклоалкилС1-4алкилом, С2-6гетероциклоалкилом, С2-6гетероциклоалкилС1-4алкилом, С1-4алкоксикарбонилС1-4алкилом, С1-4(ди)алкиламинокарбонилС1-4алкилом или

С6-10ариламинокарбонилС1-4алкилом, С1-9гетероариламинокарбонилС1-4алкилом,

С6-10арилом, С1-9гетероарилом, С6-10арилС1-4алкилом, С1-9гетероарилС1-4алкилом, причем (гетеро)арильная группа необязательно замещена одним или более заместителями, выбранными из гидрокси, амино, галогена, нитро, трифторметила, циано, С1-4алкила, С2-4алкенила, С2-4алкинила, С1-4алкоксигруппы, С1-4(ди)алкиламиногруппы или R5, R6 в R5, R6-аминокарбонильной группе могут быть связаны с С2-6гетероциклоалкильным кольцом, а также к фармацевтической композиции, обладающей агонистической активностью в отношении рецептора FSH, и к применению этих соединений для приготовления лекарственного средства. Технический результат: получены и описаны соединения, которые являются пригодными для лечения нарушений фертильности. 3 н. и 8 з.п. ф-лы.

Реферат

Настоящее изобретение относится к получению низкомолекулярного гормономиметика, который имеет селективную агонистическую активность по отношению к FSH рецептору.

Гонадотропины выполняют важные функции в различных функциях организма, включающих метаболизм, терморегуляцию и репродуктивные процессы. Гонадотропины действуют на специфические клетки гонадного типа, вызывая овариальную и тестикулярную дифференцировку и образование стероидов. Например, гонадотропин гипофиза FSH (фолликулостимулирующий гормон) играет основную роль в стимулировании развития фолликул и созревании, в то время как LH (лютеинизирующий гормон) стимулирует овуляцию (Sharp, R.M. Clin. Endocrinol. 33: 787-807, 1990; Dorrington and Armstrong, Recent Prog. Horm. Res. 35: 301-342, 1979). В данный момент FSH в сочетании с LH применяется клинически для овариальной стимуляции, то есть для овариальной гиперстимуляции для оплодотворения in vitro (IVF) и возбуждения овуляции у ановуляторных бесплодных женщин (Insler V., Int. J. Fertility 33: 85-97, 1988; Navot и Rosenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer 5: 3-13, 1988), так же, как и при мужском гипогонадизме и мужском бесплодии.

Гонадотропин FSH выделяется из передней доли гипофиза под воздействием гонадолиберина и эстрогена и из плаценты во время беременности. У женщин FSH действует на яичники, стимулируя развитие фолликул, и является основным гормоном, регулирующим выделение эстрогенов. У мужчин FSH является ответственным за сохранность семенных канальцев и действует на клетки Сертоли, поддерживая гаметогенезис. Очищенный FSH клинически используется для лечения бесплодия у женщин и некоторых типов расстройств сперматогенеза у мужчин. Гонадотропины, предназначенные для терапевтических целей, могут быть выделены из человеческой мочи и являются низкой чистоты (Morse et al., Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology 17: 143, 1988). В качестве альтернативы они могут быть получены в виде рекомбинантных гонадотропинов. Рекомбинантный человеческий FSH является коммерчески доступным и используется для поддержания репродукции (Olijve et al. Mol. Hum. Reprod. 2: 371, 1996; Devroey et al. Lancet 339: 1170, 1992).

Действия гормона FSH опосредуются специфическим рецептором плазматической мембраны, которая является членом большого семейства рецепторов, связанных с G-белком. Эти рецепторы состоят из отдельного полипептида с семью трансмембранными доменами и способны взаимодействовать с Gs-белком, приводя к активации аденилатциклазы.

Рецептор FSH является высокоспецифичной мишенью в процессе роста овариального фолликула и экспрессируется исключительно в яичнике. Блокирование рецептора или ингибирование передачи сигнала, которое обычно вызывается после активации FSH-опосредованного рецептора, нарушит развитие фолликула и, таким образом, овуляцию и фертильность. Низкомолекулярные антагонисты FSH могли бы составлять основу для новых контрацептивов, в то время как низкомолекулярные агонисты FSH могут быть использованы в тех же самых клинических целях как нативные FSH, например, для лечения бесплодия и для яичниковой гиперстимуляции оплодотворения in vitro.

Низкомолекулярные миметики FSH с агонистическими свойствами были раскрыты в международных заявках WO 2000/08015 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.) и в WO 2002/09706 (Affymax Research Institute).

Некоторые производные тетрагидрохинолина в настоящее время раскрыты в международной заявке WO2003/004028 (AKZO NOBEL N.V.) в качестве веществ, модулирующих FSH и обладающих агонистическими или антагонистическими свойствами.

Настоящее изобретение относится к получению низкомолекулярных гормономиметиков, которые селективно активируют рецепторы FSH.

Таким образом, было обнаружено, что следующий класс производных дигидропиридина формулы I или его фармацевтически приемлемых солей обладает FSH агонистической активностью:

Формула I,

в которой

R1 является С1-6алкилом, С2-6алкенилом, С2-6алкинилом, фенилом или С1-5гетероарилом;

R2, R3 независимо являются С1-4алкилом, С2-4алкенилом, С2-4алкинилом, С1-4алкоксигруппой, С2-4алкенилоксигруппой, С3-4алкинилоксигруппой, галогеном;

X является SO2, CH2, C(O) или X является связью;

R4 является С1-6алкилом, С2-6алкенилом, С2-6алкинилом, С3-6циклоалкилом, С3-6циклоалкенилом, С3-6циклоалкилС1-4алкилом, С2-6гетероциклоалкилом, С2-6гетероциклоалкилС1-4алкилом, С6-10арилом, С6-10арилС1-4алкилом, С1-9гетероарилом или С1-9гетероарилС1-4алкилом.

Если Х является СН2, то R4 может дополнительно быть R5-оксиакарбонилом или R5-карбонилом.

Если R4 является фенилом, то дополнительно к заместителям С6-10арильных групп, как упомянуто в определениях, фенил может быть необязательно замещенным одним или более заместителями, выбранными из следующих групп:

С1-4алкилтио, С1-4алкилсульфонил, R5-оксиакарбонил, R5-карбонил или R5,R6-аминокарбонил;

R5, R6 независимо являются Н, С1-4алкилом, С2-4алкенилом, С2-4алкинилом, С3-6циклоалкилом, С3-6циклоалкилС1-4алкилом, С2-6гетероциклоалкилом, С2-6гетероциклоалкилС1-4алкилом, С1-4алкоксикарбонилС1-4алкилом, С1-4(ди)алкиламинокарбонилС1-4алкилом, С6-10арилом, С1-9гетероарилом, С6-10арилС1-4алкилом, С1-9гетероарилС1-4алкилом, С6-10ариламинокарбонилС1-4алкилом, С1-9гетероариламинокарбонилС1-4алкилом, или R5, R6 могут быть связаны с С2-6гетероциклоалкильным кольцом.

Соединения в соответствии с настоящим изобретением модулируют функцию рецептора FSH и могут быть использованы в тех же самых клинических целях, что нативный FSH, поскольку они ведут себя подобно агонистам с тем преимуществом, что они могут проявлять измененные свойства стабильности и могут быть применены по-разному.

Таким образом, агонисты рецептора FSH настоящего изобретения могут быть использованы для лечения бесплодия. Предпочтительно, чтобы соединения настоящего изобретения были использованы для активации рецептора FSH.

Термин «С1-4алкил», как он использован в определении, означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода, такую как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил и трет-бутил.

Термин «С1-6алкил» означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, например метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил, н-пентил и н-гексил. Предпочтительными являются С1-5алкильные группы, наиболее предпочтительными являются С1-4алкилы.

Термин «С2-6алкенил» означает разветвленную или неразветвленную алкенильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода, такую как этенил, 2-бутенил и н-пентенил.

Термин «С2-4алкенил» означает разветвленную или неразветвленную алкенильную группу, имеющую 2-4 атома углерода, такую как этенил, н-пропенил и 2-бутенил.

Термин «С2-6алкинил» означает разветвленную или неразветвленную алкинильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода, такую как этинил, пропинил и н-пентинил.

Термин «С2-4алкинил» означает разветвленную или неразветвленную алкинильную группу, имеющую 2-4 атома углерода, такую как этинил и пропинил.

Термин «С3-6циклоалкил» означает циклоалкильную группу, имеющую 3-6 атомов углерода, такую как циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.

Термин «С3-6циклоалкенил» означает циклоалкенильную группу, имеющую 3-6 атомов углерода, такую как циклопропенил, циклопентенил и циклогексенил.

Термин «С3-6циклоалкилС1-4алкил» означает циклоалкилалкильную группу, циклоалкильная группа которой имеет 3-6 атомов с тем же значением, как определено выше, и алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше.

Термин «С2-6гетероциклоалкил» означает гетероциклоалкильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода, предпочтительно 3-5 атомов углерода, и включает, по меньшей мере, один гетероатом, выбранный из N, O и/или S, которые могут быть присоединены, если возможно, через гетероатом или атом углерода. Предпочтительными являются гетероатомы N или O. Наиболее предпочтительными являются пиперидинил, морфолинил, пирролидинил и пиперазинил.

Термин «С2-6гетероциклоалкилС1-4алкил» означает гетероциклоалкилалкильную группу, гетероциклоалкильная группа которой имеет 2-6 атомов с тем же значением, как определено выше, и алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше.

Термин «С1-4алкокси» означает алкоксильную группу, имеющую 1-4 атома углерода, при этом алкильная часть имеет то же значение, что определено выше. Предпочтительными являются С1-2алкоксигруппы.

Термин «С1-4алкилтио» означает алкилтиогруппу, имеющую 1-4 атома углерода, при этом алкильная часть имеет то же значение, что определено выше.

Термин «С2-4алкенилокси» означает алкенилоксильную группу, имеющую 2-4 атома углерода, при этом алкенильная часть имеет то же значение, что определено выше.

Термин «С3-4алкинилокси» означает алкинилоксильную группу, имеющую 3-4 атома углерода, при этом алкинильная часть имеет то же значение, что определено выше.

Термин «С6-10арил» означает ароматическую углеводородную группу, имеющую 6-10 атомов углерода, такую как фенил, нафтил, тетрагидронафтил или инденил, которые могут быть необязательно замещенными одним или более заместителями, выбранными из гидрокси, амино, галогена, нитро, трифторметила, циано, С1-4алкила, С2-4алкенила, С2-4алкинила, С1-4алкоксигруппы или С1-4(ди)алкиламиногруппы, при этом алкильная часть имеет то же значение, что определено выше. Предпочтительной ароматической углеводородной группой является фенил.

Термин «С1-9гетероарил» означает замещенную или незамещенную ароматическую группу, имеющую 1-9 атомов углерода, включающую, по меньшей мере, один гетероатом, выбранный из N, O и/или S, как тетразолил, имидазолил, тиадиазолил, пиридинил, (бензо)тиенил, (бензо)фурил, (изо)хинолинил, тетрагидро(изо)хинолинил, кумаринил, хиноксалинил или индолил. Заместители в С1-9гетероарильной группе могут быть выбраны из группы заместителей, перечисленных для С6-10арильной группы. Предпочтительным является С1-5гетероарил. С1-9гетероарильная группа может быть присоединена, если возможно, через атом углерода или через гетероатом.

Термин «С1-5гетероарил» означает замещенную или незамещенную ароматическую группу, имеющую 1-5 атомов углерода, включающую, по меньшей мере, один гетероатом, выбранный из N, O и/или S, как тетразолил, имидазолил, тиадиазолил, пиридинил, тиенил или фурил, причем наиболее предпочтительным является фурил. Предпочтительными гетероарильными группами являются тиенил, фурил и пиридинил. Заместители в С1-5гетероарильной группе могут быть выбраны из группы заместителей, перечисленных для С6-10арильной группы.

Термин «С6-10арилС1-4алкил» означает арилалкильную группу, арильная группа которой содержит 6-10 атомов углерода с тем же значением, как определено выше, и алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше. Наиболее предпочтительным является бензил.

Термин «С1-9гетероарилС1-4алкил» означает гетероарилалкильную группу, гетероарильная группа которой содержит 1-9 атомов с тем же значением, как определено выше, и алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше.

Термин «С1-4алкилсульфонил» означает алкилсульфонильную группу, алкильная группа которой содержит 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше.

Термин «С1-4алкоксикарбонил» означает С1-4алкоксикарбонильную группу, алкоксигруппа которой содержит 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше. Предпочтительными являются С1-2алкоксикарбонильные группы.

Термин «С1-4алкоксикарбонилС1-4алкил» означает алкоксикарбонилалкильную группу, алкильная группа которой содержит 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше.

Термин «С1-4(ди)алкиламинокарбонилС1-4алкил» означает (ди)алкиламинокарбонилалкильную группу, алкильная группа которой содержит 1-4 атома углерода с тем же значением, как определено выше.

Термин «галоген» означает фтор, хлор, бром и йод.

Термин «фармацевтически приемлемые соли» представляет те соли, которые являются подходящими для использования в контакте с тканями человека и низших животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и подобного и являются соразмерными с разумным соотношением выгода/риск. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в уровне техники. Они могут быть получены в процессе конечного выделения и очистки соединений изобретения или отдельно взаимодействием свободного функционального основания с подходящей минеральной кислотой, такой как хлористоводородная кислота, фосфорная кислота или серная кислота, или с органической кислотой, такой как аскорбиновая кислота, лимонная кислота, винная кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, фумаровая кислота, гликолевая кислота, янтарная кислота, пропионовая кислота, уксусная кислота, метансульфоновая кислота и подобное. Кислотная функциональная группа может взаимодействовать с органическим или минеральным основанием, таким как гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид лития.

Изобретение также относится к соединениям формулы I, в которых R1 является С1-6алкилом, фенилом или С1-5гетероарил, все необязательно замещенные заместителями, как упомянуто в определениях. Более конкретно, изобретение относится к соединениям, в которых R1 является С1-6алкилом, фенилом, С4-гетероарилом. Изобретение также касается соединений, в которых R1 является н-пропилом или фурилом.

Другим аспектом изобретения являются соединения формулы I, в которых R2, R3 являются галогеном и/или С1-4алкокси.

В еще одном аспекте изобретение касается соединений формула I, в которых Х является СН2.

Другим аспектом изобретения является соединение, в котором R4 является фенилом, необязательно замещенным заместителями, как упомянуто в определении.

В другом аспекте изобретение относится к соединениям, в которых R4 является фенилом, который является замещенным в орто- и/или мета-положениях. В еще одном аспекте изобретение относится к соединениям формулы I, в которых R4 является фенилом, замещенным R5,R6-аминокарбонилом, С1-4алкоксигруппой и/или галогеном. В еще одном аспекте изобретение относится к соединениям, в которых R5,R6 в R5,R6-аминокарбонильной группе является С1-4(ди)алкиламиногруппой, С1-4алкоксикарбонилС1-4алкилом или С1-9гетероарилС1-4алкилом. В еще одном аспекте, по меньшей мере, один из R5, R6 в R5,R6-аминокарбонильной группе является Н.

В другом аспекте изобретение касается соединений, в которых С6-10арил, С6-10арилС1-4алкил, С1-9гетероарил или С1-9гетероарилС1-4алкил в R4 являются незамещенными.

Еще один аспект изобретения касается соединений, в которых Х=СН2 и в которых

R4 является фенилом, необязательно замещенным заместителями, как упомянуто в определениях.

Еще один аспект изобретения касается соединений, в которых все особые определения групп от R1 до R4, как здесь определено выше, объединены в соединение дигидропиридина формулы I.

Из объема изобретения исключается 2-метил-5-оксо-7-фенил-4-(3,4,5-триметоксифенил)-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил.

Исключенное соединение относится к CAS330674-72-1, доступному из коммерческих источников, подобных Cembridge Corp., MicroChemistry Ltd, Ambinter, Asinex, Scientific Exchange Inc. и ChemDiv Inc.

Пригодные способы получения соединений изобретения описаны ниже.

Производные 1,4-дигидропиридина I настоящего изобретения могут быть получены хорошо описанной трехкомпонентной циклоконденсацией по Ганчу из циклогексан-1,3-дионов общей формулы II, бензальдегидов общей формулы III и 3-аминокротонитрила IV, в которых R1, R2, R3, R4 и Х являются такими, как определено выше.

Родственные реакции циклоконденсацией по Ганчу могут быть найдены в Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 1481-1484, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (2002) 1141-1156, Synlett. (2002) 89-92, Drug Dev. Res. 51 (2000) 233-243, J. Med. Chem. 42 (1999) 1422-1427, ibid. 5266-5271, ibid. 41 (1998) 2643-2650, WO 9408966, Arzneim.-Forsch./Drug Res. 45 (1995) 1054-1056, J. Med. Chem. 34 (1991) 2248-2260, ibid. 17 (1974) 956-65, Chem. Rev. 72 (1972)

1-42. Вышеупомянутые реакции обычно проводятся при повышенной температуре в протонном растворителе, таком как, например, уксусная кислота, (изо)пропанол, этанол, метанол или их смеси.

В качестве альтернативы соединения общей формулы I могут быть синтезированы взаимодействием сначала циклогексан-1,3-дионов формулы II с бензальдегидами формулы III в присутствии основания, такого как, но не ограниченного, ацетат аммония, и затем взаимодействием интермедиата 2-бензилиденциклогексан-1,3-диона общей формулы V, в которой R1, R2, R3, R4 и Х имеют то же значение, как определено выше, с 3-аминокротонитрилом IV.

Соединения общей формулы I-a, в которых X = связь и R4=H, могут быть использованы для получения соединений I-b-e О-алкилированием, О-(гетеро)арилированием, О-ацилированием или О-сульфонилированием обычными способами, хорошо известными специалисту в данной области.

В обычном эксперименте соединения I-a взаимодействуют в таком растворителе, как дихлорметан, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, этанол, тетрагидрофуран, диоксан, толуол, 1-метилпирролидин-2-он или пиридин, с алкилгалогенидом, или ацилгалогенидом, или ангидридом кислоты, или сульфонилгалогенидом, или (гетеро)арилгалогенидом в присутствии такого основания, как, но не ограничиваясь, триэтиламин, N,N-диизопропилэтиламин (DiPEA), карбонат калия, карбонат цезия или гидрид натрия, необязательно в присутствии каталитического количества йодида калия или йодида тетрабутиламмония, и/или Cu- или Pd-катализатора с образованием О-алкилированного, О-(гетеро)арилированного, О-ацилированного или О-сульфонилированного производного формулы I-b, I-c, I-d и I-e соответственно.

Соединения формул I-f, в которых Х=СН2 и R4=производное алкилкислоты или производное (гетеро)арилкислоты, полученное щелочным (например, NaOH) омылением соответствующего алкильного сложного эфира, могут быть конденсированы с аминами общей структуры R5,R6NH или спиртами общей формулы R5OH с использованием реагента связывания, такого как диизопропилкарбодиимид (DIC), (3-диметиламинопропил)этилкарбодиимид (EDCI), О-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфат (TBTU) или О-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфат (HATU), и основание третичного амина (DiPEA) в таком растворителе, как N,N-диметилформамид или дихлорметан при температуре окружающей среды или повышенной температуре с образованием соединений формулы I-g и I-h.

Замещенные циклогексан-1,3-дионы общей формулы II являются коммерчески доступными или могут быть получены известными из литературы в этой области способами. Подходящие примеры найдены в J. Med. Chem. 43 (2000) 4678-4693, Tetrahedron 56 (2000) 4753-4758, J. Med. Chem. 35 (1992) 3429-3447, ibid. 24 (1981) 1026-1034, Org. Synt. Coll. Vol. V (1973) 400, Chem. Ber. 88 (1955) 316-327, Justus Liebig Ann. Chem. 570 (1950) 15-31.

Бензальдегиды общей формулы III также являются коммерчески доступными или могут быть получены в соответствии с литературными методиками: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 (2000) 1119-1124, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 4 (1993) 419-420, Synth. Commun. 20 (1990) 2659-2666, Chem. Pharm. Bull. 34 (1986) 121-129, Indian J. Chem. Sect. B 20 (1981) 1010-1013, Monatsh. Chem. 106 (1975) 1191-1201, DE 1070162, J. Org. Chem. 23 (1958) 120.

В качестве альтернативы соединения III-a, в которых Х=связь и R4=H могут быть использованы для синтеза соединений III-b-e О-алкилированием, О-(гетеро)арилированием, О-ацилированием или О-сульфонилированием с использованием стандартных условий, как описано выше для соединений I-a.

Соединения настоящего изобретения имеют, по меньшей мере, два хиральных атома углерода и поэтому могут быть получены в виде чистых энантиомеров, или в виде смеси энантиомеров, или смеси диастереомеров. Способы получения чистых энантиомеров хорошо известны в уровне техники, например кристаллизация солей, которые получены из оптически активных кислот и рацемических смесей, или хроматография с использованием хиральных колонок. Для разделения диастереомеров могут быть использованы колонки с нормальной фазой или с обращенной фазой.

Соединения изобретения могут образовывать гидраты или сольваты. Специалистам в данной области известно, что заряженные соединения образуют гидратированные фрагменты при лиофилизации с водой или образуют сольваты при концентрировании в растворе с подходящим органическим растворителем. Соединения данного изобретения включают гидраты или сольваты перечисленных соединений.

Для отбора активных соединений тестирование при 10-5М должно привести к активности более чем 20% от максимальной активности, когда FSH используется в качестве сравнения. Другим критерием может быть величина EC50, которая должна быть <10-5М, предпочтительно <10-7М, еще более предпочтительно <10-9М.

Специалисту будет ясно, что желаемые значения EC50 зависят от тестируемого соединения. Например, соединение с EC50, которое является менее чем 10-5М, является обычно рассматриваемым кандидатом на отбор лекарственного средства. Предпочтительно, чтобы значение было более низким, чем 10-7М. Однако соединение, которое имеет более высокое EC50, но является селективным для определенного рецептора, может быть даже лучшим кандидатом.

Способы определения связывания рецептора гонадотропинов, также как и оценки in vitro и in vivo для определения биологической активности, хорошо известны. В общем, экспрессированный рецептор контактирует с тестируемым соединением, и измеряется связывание, или стимуляция, или ингибирование функционального ответа.

Для измерения функционального ответа выделенную ДНК, кодирующую ген рецептора FSH, предпочтительно человеческий рецептор, экспрессируют в подходящей клетке-хозяине. Подобными клетками могут быть клетки яичника китайского хомячка, но другие клетки также пригодны. Предпочтительно, чтобы клетки были клетками млекопитающего (Jia et al., Mol. Endocrin., 5: 759-776, 1991).

Способы создания рекомбинантного FSH, экспрессирующего колонии клеток, хорошо известны в уровне техники (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, latest edition). Экспрессия рецептора достигается экспрессией ДНК, кодирующей требуемый белок. Методики целенаправленного мутагенеза, сшивание дополнительных последовательностей, ПЦР и конструирование пригодных систем экспрессии являются на данный момент хорошо известными в уровне техники. Фрагменты или вся ДНК, кодирующая желаемый белок, могут быть сконструированы синтетически по стандартным твердофазным методикам, предпочтительно включить сайты рестрикции для ослабления сшивания. Подходящие регуляторные элементы для транскрипции и трансляции, включенной кодирующей последовательности, могут быть включены в ДНК кодирующие последовательности. Хорошо известно, что в данный момент доступны системы экспрессии, которые являются совместимыми с широким кругом хозяев, включая прокариотических хозяев, таких как бактерии, и эукариотических хозяев, таких как дрожжи, растительные клетки, клетки насекомых, клетки млекопитающих, клетки птиц и подобное.

Клетки, экспрессирующие рецептор, затем контактируют с тестируемым соединением для наблюдения связывания, или стимуляции, или ингибирования функционального ответа.

В качестве альтернативы выделенные клеточные мембраны, содержащие экспрессированный рецептор, могут быть использованы для измерения связывания соединения.

Для измерения связывания могут быть использованы радиоактивные или флуоресцирующие соединения. В качестве соединения сравнения может быть использован человеческий рекомбинантный FSH.

В качестве альтернативы также может быть осуществлен конкурирующий анализ связывания.

Другой анализ включает скрининг соединений-агонистов рецептора FSH путем определения стимулирования опосредованного рецептором накопления cAMP. Таким образом, подобный способ включает экспрессию рецептора на клеточной поверхности клетки-хозяина и воздействие на клетку тестируемого соединения. Затем измеряется количество cAMP. Уровень cAMP будет увеличиваться вследствие стимулирующего воздействия тестируемого соединения на связывание с рецептором.

Дополнительно к прямому измерению, например, уровней cAMP в клетке, на которую оказывается воздействие, могут быть использованы клеточные линии, которые в добавление к трансфекции рецептором, кодирующим ДНК, также трансфекцируются вторичной ДНК, кодирующей ген-репортер, экспрессия которого соответствует уровню cAMP. Подобные гены-репортеры могут быть индуцируемыми cAMP или могут быть получены таким образом, чтобы они были связаны с оригинальными элементами, чувствительными к cAMP. В общем, экспрессия ген-репортера может быть контролирована любыми элементами, чувствительными к изменению уровней cAMP. Подходящими генами-репортерами являются, например, LacZ, щелочная фосфатаза, светлячковая люцифераза и зеленый флуоресцентный белок. Принципы подобных оценок трансактивации хорошо известны в уровне техники и описаны, например, в Stratowa, Ch., Himmler, A. И Czernilofsky, A. P. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6: 574.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей производное дигидропиридина или его фармацевтически приемлемые соли, имеющее общую формулу I в смеси с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами и необязательно другими терапевтическими средствами. Вспомогательные вещества должны быть «приемлемыми» в том смысле, что они являются совместимыми с другими ингредиентами композиции и не опасны для их хозяев. Фармацевтические композиции также могут содержать 2-метил-5-оксо-7-фенил-4-(3,4,5-триметоксифенил)-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил.

Композиции включают, например, пригодные для перорального, сублингвального, подкожного, внутривенного, внутримышечного, назального, местного или ректального введения и подобное, все в единицах стандартной дозы для приема.

Для перорального введения активный ингредиент может быть представлен в виде отдельных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, растворы, суспензии и подобное.

Для парентального введения фармацевтическая композиция может быть представлена в виде емкостей, содержащих одну дозу или множество доз лекарственного средства, например жидкости для инъекций в заранее определенных количествах, например, в герметичных флаконах и ампулах, и могут также храниться в вымороженном (лиофилизованном) виде, требующем перед использованием только добавления жидкого стерильного носителя, например воды.

Активный агент, смешанный с подобными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, например, как описано в стандартной ссылке Gennaro, A.R. et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th Edition, Lippincott Williams and Wilkins, 2000, см. специально Part 5: Pharmaceutical Manufacturing), может быть спрессован в твердую стандартную дозу, такую как пилюли, таблетки, или переведен в капсулы или суппозитории. Используя фармацевтически приемлемые жидкости, активный агент может быть использован в виде жидкой композиции, например в виде раствора для инъекций, в виде растворов, суспензий, эмульсий или как спрей, например назальный спрей.

Для приготовления твердой стандартной лекарственной формы используют обычные добавки, такие как наполнители, красители, полимерные связующие вещества и подобное. Вообще могут быть использованы любые фармацевтически приемлемые добавки, которые не взаимодействуют с активными соединениями. Подходящие носители, с которыми активный агент настоящего изобретения может быть использован в качестве твердой стандартной лекарственной дозы, включают лактозу, крахмал, производные целлюлозы и подобное или их смеси, использованные в подходящих количествах. Для парентального введения могут быть использованы водные суспензии, изотонические солевые растворы и стерильные растворы для инъекций, содержащие фармацевтически приемлемые диспергирующие агенты и/или смачивающие агенты, такие как пропиленгликоль или бутиленгликоль.

Изобретение дополнительно включает фармацевтическую композицию, как описано выше, в комбинании с упаковочным материалом, пригодным для указанной композиции, причем указанный упаковочный материал включает инструкции по использованию композиции.

Точная дозировка и режим приема активного ингредиента или его фармацевтической композиции может меняться в зависимости от конкретного соединения, пути введения и возраста, и состояния индивидуального пациента, которому прописывают лекарственное средство.

В общем парентальный прием требует более низких доз, чем другие способы приема, которые являются более зависимыми от абсорбции. Однако пригодная дозировка для людей может составить 0,05-25 мг на кг веса тела. Требуемая дозировка может быть представлена как одна доза или множество поддоз, принимаемых через соответствующие интервалы в течение дня, или, в случае пациентов-женщин, как дозы, которые следует принимать ежедневно в течение менструального цикла. Дозировка, также как и режим приема, может различаться у пациентов мужчин и женщин.

Таким образом, соединения в соответствии с изобретением могут быть использованы в терапии.

Изобретение относится также к применению производного дигидропиридина, имеющего общую формулу I, для приготовления лекарственного средства для лечения расстройств, чувствительных к метаболическим путям, опосредованных FSH рецептором, предпочтительно для лечения бесплодия.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1

4-(3-Бром-4-этокси-5-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

а) 4-(3-Бром-4-гидрокси-5-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Смесь 5-фенилциклогексан-1,3-диона (0,51 г), 3-бром-5-метокси-4-гидроксибензальдегида (0,62 г) и 3-аминокротонитрила (0,22 г) в 20 мл абсолютного этанола перемешивали в течение 3 ч при 75°С. Реакционную смесь концентрировали и после колоночной флэш-хроматографии (силикагель, гептан/этилацетат (3/7 об./об.), Rf=0,36) получили указанное в заголовке соединение в виде не совсем белого твердого вещества.

Выход: 0,95 г.

MS-ESI: [M-H]- = 463/465.

b) 4-(3-Бром-4-этокси-5-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Смесь продукта стадии а (15 мг), этилйодида (6,4 мкл), гидрида натрия (2,6 мг, 60% в масле) и тетрабутиламмония йодида (1,2 мг) в 0,5 мл N-метилпирролидона перемешивали в течение 2 ч при 80°С. Добавили воду и реакционную смесь экстрагировали этилацетатом. Органические фазы концентрировали и после колоночной флэш-хроматографии (силикагель, гептан/этилацетат (1/4 об./об.), Rf=0,52) получили указанное в заголовке соединение.

Выход: 2,2 мг.

MS-ESI: [M-H]- = 491/493.

Пример 2

4-(3-Бром-4-циклогексилметокси-5-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 1b из продукта примера 1а (15 мг) и бромметилциклогексана (12 мкл).

Выход: 12 мг.

Rf(гептан/этилацетат (1/4 об./об.))=0,59.

MS-ESI: [M-H]- = 559/561.

Пример 3

4-[3-Бром-5-метокси-4-(3-метилбутокси)фенил]-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 1b из продукта примера 1а (15 мг) и 1-йод-3-метилбутана (4,7 мкл).

Выход: 14 мг.

Rf(гептан/этилацетат (1/4 об./об.))=0,56.

MS-ESI: [M-H]- = 533/535.

Пример 4

4-[3-Бром-4-(5-хлортиофен-2-илметокси)-5-метоксифенил]-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Смесь продукта из примера 1а (15 мг), 2-хлор-5-хлорметилтиофена (4,3 мкл) и карбоната цезия (21 мг) в 1 мл диоксана перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Реакционную смесь концентрировали и после колоночной флэш-хроматографии (силикагель, гептан/этилацетат (3/7 об./об.), Rf=0,38) получили указанное в заголовке соединение.

Выход: 4,7 мг.

MS-ESI: [M-H]- = 593/595/597.

Пример 5

Метиловый эфир [2-бром-4-(3-циано-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-4-ил)-6-метоксифенокси]уксусной кислоты

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 4 из продукта примера 1а (0,47 г) и метилового эфира бромуксусной кислоты (1,0 мл).

Выход: 0,32 г.

Rf(гептан/этилацетат (1/4 об./об.))=0,46.

MS-ESI: [M-H]- = 535/537.

Пример 6

2-Бром-4-(3-циано-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-4-ил)-6-метоксифениловый эфир 3-метоксибензойной кислоты

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 4 из продукта примера 1а (15 мг) и 3-метоксибензоилхлорида (5,4 мкл).

Выход: 7,4 мг.

Rf(гептан/этилацетат (1/4 об./об.))=0,48.

MS-ESI: [M-H]- = 597/599.

Пример 7

4-[3-Бром-4-(3-цианобензилокси)-5-метоксифенил]-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 4 из продукта примера 1а (15 мг) и 3-бромметилбензонитрила (7,6 мг).

Выход: 15 мг.

Rf(гептан/этилацетат (1/4 об./об.))=0,51.

MS-ESI: [M-H]- = 578/580.

Пример 8

4-[3-Бром-5-метокси-4-(нафталин-2-илметокси)фенил]-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 4 из продукта примера 1а (15 мг) и 2-бромметилнафталина (8,6 мг).

Выход: 11 мг.

Rf(гептан/этилацетат (1/4 об./об.))=0,60.

MS-ESI: [M-H]- = 603/605.

Пример 9

2-Бром-4-(3-циано-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-4-ил)-6-метоксифениловый эфир фенилметансульфоновой кислоты

Смесь продукта из примера 1а (15 мг), фенилметансульфонилхлорида (9,2 мг) и триэтиламин (9,4 мкл) в 1 мл дихлорметана перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали и после колоночной флэш-хроматографии (силикагель, гептан/этилацетат (1/4 об./об.), Rf=0,41) получили указанное в заголовке соединение.

Выход: 15 мг.

MS-ESI: [M+H]+ = 619/621.

Пример 10

2-Бром-4-(3-циано-2-метил-5-оксо-7-фенил-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-4-ил)-6-метоксифениловый эфир тиофен-2-сульфоновой кислоты

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 9 из продукта примера 1а (15 мг) и тиофен-2-сульфонилхлорида (8,8 мг).

Выход: 20 мг.

Rf(гептан/этилацетат (1/4 об./об.))=0,30.

MS-ESI: [M-H]- = 611/613.

Пример 11

4-[3,5-Дибром-4-(3-метоксибензилокси)фенил]-7-этил-2-метил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

а) 3,5-Дибром-4-(3-метоксибензилокси)бензальдегид

Смесь 3,5-дибром-4-гидроксибензальдегид (0,28 г), 1-бромметил-3-метоксибензол (0,15 мл), карбонат калия (0,29 г) и йодид калия (42 мг) в 10 мл абсолютного этанола перемешивали при 80°С в течение 2 дней. Реакционную смесь концентрировали и после колоночной флэш-хроматографии (силикагель, гептан/этилацетат (3/7 об./об.), Rf=0,51) получили указанное в заголовке соединение в виде не совсем белого твердого вещества.

Выход: 0,24 г.

MS-ESI: [M-H]- = 463/465.

1Н ЯМР (CDCl3): δ = 9,88 (с, 1Н), 8,06 (с, 1Н), 7,34 (т, 1Н), 7,18 (ушир.с, 1Н), 7,15 (д, 1Н), 6,93 (дд, 1Н), 5,10 (с, 2Н), 3,85 (с, 3Н).

b) 4-[3,5-Дибром-4-(3-метоксибензилокси)фенил]-7-этил-2-метил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение было получено аналогично примеру 1а из 5-этилциклогексан-1,3-диона (8,5 мг) и продукта стадии а (24 мг).

Выход: 26 мг.

Rf(гептан/этилацетат (3/7 об./об.))=0,40.

MS-ESI: [M+H]+ = 585/587/589.

П