Способ получения ингибиторов дипептидилпептидазы iv и их производных

Способ получения ингибиторов дипептидилпептидазы iv и их производных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Способ получения частично очищенных концентратов фенилаланиндегидрогеназы и/или формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), который включает следующие стадии:а. получение культуральной жидкости микроорганизма Escherichia coli JM110 (pBMS 2000-PPDFDH-mod), способного продуцировать фенилаланиндегидрогеназу и/или формиатдегидрогеназу;b. подвергание культуральной жидкости микрофлюидизации для высвобождения ферментативной активности из клеток и получения микрофлюидизированной культуральной жидкости, обладающей PDH и/или FDH активностью,c. очистка культуральной жидкости путем обработки ее флокулирующим агентом, чтобы скоагулировать клеточный дебрис и удалить ДНК и нежелательные белки;d. фильтрование очищенной культуральной жидкости; ие. концентрирование культуральной жидкости с получением частично очищенного ферментного концентрата, обладающего PDH/FDH активностью, с PDH активностью, по крайней мере, около 400 МЕ/мл и FDH активностью, по крайней мере около 20 МЕ/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральную жидкость подвергают микрофлюидизации под давлением в интервале от около 12000 пси до около 20000 пси.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральную жидкость подвергают микрофлюидизации при поддержании температуры культуральной жидкости ниже 25°С.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что температуру культуральной жидкости поддерживают ниже 25°С.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что очищенную культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации.

6. Способ получения амина структурной формулы который включает стадииа. обработки водного раствора кетокислоты структурной формулы формиатом аммония, никотинамидадениндинуклеотидом, дитиотреитолом и частично очищенной смесью ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), полученных способом по п.1, при температуре от 35 до 40°С;b. поддержания pH реакционной смеси гидроксидом натрия в пределах от 7,8 до 8,2 с получением амина формулы 2.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что реакцию ведут течение периода времени от около 24 ч до около 48 ч для получения амина формулы 2.

8. Способ получения ВОС-защищенного амина структурной формулы который включает стадииа. получения водного раствора аминокислоты (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло [3.3.1.1^3,7]декан-1-уксусной кислоты структурной формулы путем восстановительного аминирования кетокислоты где водный раствор (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло[3.3.1.1^3,7] декан-1-уксусной кислоты, формиата аммония, никотинамидадениндинуклеотида, дитиотреитола и частично очищенным концентратом ферментовфенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), полученным способом по п.1, нагревают до температуры от 35 до 40°С и поддерживают pH реакционной смеси гидроксидом натрия в пределах от 7,8 до 8,2, с получением указанного раствора аминокислоты; иb. обработки вышеуказанного водного раствора дитретбутилдикарбонатом с получением ВОС-защищенного амина.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что pH смеси водного раствора и дитретбутилдикарбоната поддерживают в пределах от около 8,5 до около 12,5.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадии выделения ВОС-защищенного амина из реакционной среды и его кристаллизации.

11. Частично очищенная смесь ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, полученная способом по п.1.

12. Способ получения ВОС-защищенного амина формулы который включает стадииа. получения частично очищенного концентрата ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, путемполучение культуральной жидкости микроорганизма Escherichia coli JM110 (pBMS 2000-PPDFDH-mod), способного продуцировать фенилаланиндегидрогеназу и/или формиатдегидрогеназу;подвергание культуральной жидкости микрофлюидизации для высвобождения ферментативной активности из клеток и получения микрофлюидизированной культуральной жидкости, обладающей PDH и/или FDH активностью,очистки культуральной жидкости путем обработки ее флокулирующим агентом, чтобы скоагулировать клеточный дебрис и удалить ДНК и нежелательные белки;фильтрование очищенной культуральной жидкости; иконцентрирование культуральной жидкости с получением частично очищенного ферментного концентрата, обладающего PDH/FDH активностью, с PDH активностью, по крайней мере, около 400 МЕ/мл и FDH активностью, по крайней мере около 20 МЕ/мл;b. обработки водного раствора кетокислоты структурной формулы формиатом аммония, никотинамидадениндинуклеотидом, дитиотреитолом и частично очищенной смесью ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, полученных на этапе (а) при температуре от 35 до 40°С;c. поддержания pH реакционной смеси с помощью гидроксида натрия в пределах от 7,8 до 8,2 с получением амина формулы 2 иd. обработку вышеуказанного водного раствора дитретбутилдикарбонатом без выделения промежуточной аминокислоты с получением ВОС-защищенного амина структурной формулы .

13. Способ получения соединения в виде свободного основания формулы который предусматривает получение ВОС-защищенного соединения формулы 3 путем получения водного раствора аминокислоты (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло[3.3.1.1^3,7]декан-1-уксусной кислоты структурной формулы путем восстановительного аминирования кетокислоты где водный раствор (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло[3.3.1.1^3,7]декан-1-уксусной кислоты, формиата аммония, никотинамидадениндинуклеотида, дитиотреитола и частично очищенных концентратов ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), полученных способом по п.1, нагревают до температуры от 35 до 40°С и поддерживают pH реакционной смеси гидроксидом натрия в пределах от 7,8 до 8,2, с получением указанного раствора аминокислоты; иобработку вышеуказанного водного раствора дитретбутилдикарбонатом с получением ВОС-защищенного амина формулы 3;обработку ВОС-защищенного соединения мезилхлоридом и диизопропил-этиламином и соединением формулы J и 1-гидроксибензотриазолом (НОВТ) с получением ВОС-защищенного промежуточного соединения структуры К дегидратирование промежуточного К в присутствии пиридина и трифторуксусного ангидрида, последующий гидролиз продукта реакции в присутствии сильного основания с получением соединения L и обработку соединения L соляной кислотой с получением соответствующей солянокислой соли L' обработку соединения L' гидроксидом натрия с получением соединения М' в виде свободного основания.