Способ затирания

Способ затирания

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится, кроме прочего, к стадии затирания и фильтрации в процессе получения алкогольного напитка, такого как пиво или виски, и к композиции, используемой на стадии затирания и фильтрации такого процесса.

Использование ферментов при пивоварении является общепринятым. Применение ферментов на стадии затирания и фильтрации для того, чтобы улучшить фильтруемость затора и увеличить выход экстракта, описан в WO 97/42302. Однако имеется необходимость в улучшении стадии затирки и фильтрации и в улучшенных ферментных композициях для использования на стадии затирания и фильтрации.

Изобретение предлагает способ получения затора, имеющего улучшенную фильтруемость и/или улучшенный выход экстракта после фильтрации, который включает приготовление затора в присутствии ферментной активности и фильтрацию затора для получения сусла и в котором ферментная активность включает ксиланазу семейства 10 глюкозидгидролазы, присутствующую в количестве по меньшей мере 15 вес.% от общего веса ксиланазного и эндоглюканазного ферментного белка.

Следующий объект изобретения предлагает способ снижения вязкости водного раствора, включающего гидролизат крахмала, предусматривающий испытание по меньшей мере одного ксиланолитического фермента на его гидролитическую активность по отношению к нерастворимому арабиноксилану пшеницы, выбор ксиланолитического фермента, который расщепляет возле разветвленных остатков, оставляя в результате конечно-замещенные олигосахариды ксилозы, и добавление выбранного ксиланолитического фермента к водному раствору, включающему гидролизат крахмала.

В еще одном своем объекте изобретение предлагает способ снижения вязкости водного раствора, включающего гидролизат крахмала, где указанный способ включает испытание по меньшей мере одного эндоглюканолитического фермента на его гидролитическую активность по отношению к бета-глюкану ячменя, выбор эндоглюканолитического фермента, который в условиях: 10 мкг/мл очищенного фермента и 5 мг/мл бета-глюкана ячменя в 50 мМ ацетате натрия, 0,01% Triton X-100 при рН 5,5 и 50°С в течение 1 часа разлагает более чем 70% бета-глюкана ячменя до DP 6 или DP<6, и добавление выбранного эндоглюканолитического фермента к водному раствору, включающему гидролизат крахмала.

В еще одном объекте изобретение предлагает композицию, включающую ксиланазу GH10, присутствующую в количестве по меньшей мере 15 вес.% от общего протеина ферментов, и/или эндоглюканазу GH12, GH7 и/или GH5, присутствующую в количестве по меньшей мере 40 вес.% от общего протеина ферментов.

Другие объекты касаются применений упомянутой композиции в процессе, включающем снижение вязкости водного раствора, содержащего гидролизат крахмала, включая такие процессы, в которых водный раствор, содержащий гидролизат крахмала, предназначен для использования в пищевых композициях.

Определения

В настоящем описании использованы разнообразные термины, которые, как правило, понятны специалистам. Однако некоторые термины использованы в специфическом значении и означают следующее.

Термин "солодовая крупка", как он использован здесь, понимается как крахмал или сахар, содержащий материал, который является основой для приготовления пива, например ячменный солод и добавку.

Термин "солод" понимается как любое осоложенное злаковое зерно, в особенности, ячмень.

Термин "добавка" понимается как часть солодовой крупки, которая не является ячменным солодом. Добавкой может быть любой богатый углеводами материал.

Термин "затор" понимается как водная суспензия крахмала, включающая, например, размолотый ячменный солод, и/или другую добавку, или их комбинацию, замоченные в воде для приготовления сусла.

Термин "сусло" понимается как неферментированный сиропный оттек после экстрагирования солодовой крупки во время затирания.

Термин "барда" понимается как дренированные твердые вещества, остающиеся поле того, как солодовая крупка была экстрагирована и сусло отделено от затора.

Термин "пиво" понимается здесь как ферментированное сусло, например как алкогольный напиток, сваренный из ячменного солода, необязательно, добавки и шишек хмеля.

Термин "извлечение экстракта" в сусле определяется как сумма растворимых веществ, экстрагированных из солодовой крупки (солод и добавки), выраженная в процентах на сухое вещество.

Термин "термостабильный фермент" понимается как фермент, который при температурном режиме и периоде термостатирования, применяемых в способах по настоящему изобретению, в добавленных количествах способен к достаточному разложению рассматриваемого субстрата.

Термин "ксиланаза типа А" понимается как ксиланаза, которая расщепляет арабиноксилановые полимеры, близкие к разветвленным остаткам, оставляя конечно-замещенные олигосахариды ксилозы. Ксиланазы типа А могут быть идентифицированы, используя метод, описанный в разделе "Методы" настоящего описания.

Термин "гомология", когда он использован относительно последовательностей полипептидов или ДНК, указанных в настоящем описании, понимается как степень гомологии между двумя последовательностями, указывающая отклонение первой последовательности от второй. Гомология может быть удобно определена посредством компьютерной программы, известной в данной области, такой как GAP, имеющейся в программном пакете GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Для сравнения полипептидных последовательностей использованы следующие установки: GAP creation penalty в 3,0 и GAP extension penalty в 0,1.

Термин "DP" представляет степень полимеризации, использованную здесь как среднее число глюкозных блоков в полимерах в гидролизате полисахаридов.

Нумерация семейств гликозидгидролазы (GH) и модулей связывания углеводов (СВМ), примененная в данном описании, следует концепции Coutinho, P.M. and Henrissat, B. (1999), CAZy -Carbohydrate-Active Enzymes server at URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html или, альтернативно, Coutinho, P.M. and Henrissat, B., 1999: The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach, in "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi S., Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, p. 15-23 и в Bourne, Y. and Henrissat, B. 2001: Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structure Biology 11: 593-600. Эта система классификации групп гликозидгидролаз основывается на подобиях в первичной структуре. Кроме того, члены семейства показывают один и тот же каталитический механизм и имеют подобия в общей трехмерной структуре, хотя семейство может содержать члены с существенными вариациями в специфичности субстрата.

Наименования эндоглюканаз Humicola insolens следует системе Karlsson, J. 2000, Fungi Cellulases, Study of hydrolytic properties of endoglucanases from Trichoderma reesei and Humicola insolens, Lundt University.

Процессы пивоварения хорошо известны в практике и, как правило, включают стадии солодоращения, затирания и ферментации. В традиционных процессах пивоварения солодоращение служит целям превращения нерастворимого крахмала в растворимый крахмал, уменьшения комплексных протеинов, образования цвето- и вкусообразующих соединений, образования питательных веществ для роста дрожжей и развития ферментов. Тремя главными стадиями процесса солодоращения являются замачивание, проращивание и отсушивание.

Замачивание включает смешение зерен ячменя с водой для повышения уровня влаги и активизации метаболических процессов в непроросшем ячмене. На следующей стадии влажный ячмень проращивают выдерживанием его при подходящей температуре и уровне влажности до тех пор, пока не будет достигнуто требуемое изменение, т.е. такое как разложение крахмала и активация ферментов. Конечной стадией является сушка сырого солода в сушилке. Температурный режим в сушилке определяет цвет ячменного солода и количество ферментов, которые выживают для использования в процессе затирания. Низкая температура сушки более подходит для солодов, когда она важна для сохранения ферментной активности. Солоды, высушенные при высоких температурах, очень богаты окрашивателями, такими как карамелизированные сахара, а также придающими вкус соединениями.

Затирание представляет собой процесс превращения крахмала из размолотого ячменного солода и твердых добавок в ферментируемые и неферментируемые сахара для получения сусла желаемого состава. Традиционное затирание включает смешение размолотого ячменного солода и добавок с водой при заданных температуре и объеме для продолжения биохимических изменений, начатых во время процесса солодоращения. Процесс затирания ведут в течение периода времени при различных температурах для того, чтобы активизировать эндогенные ферменты солода, ответственные за разложение протеинов и углеводов. Несомненно, наиболее важным изменением, осуществляемым при затирании, является превращение молекул крахмала в ферментируемые сахара. Главными ферментами, ответственными за превращение крахмала, в традиционном процессе затирания являются альфа- и бета-амилазы. Альфа-амилаза очень быстро уменьшает нерастворимый и растворимый крахмал путем расщепления молекул крахмала намного более коротких цепочек, которые могут быть атакованы бета-амилазой. Получаемым дисахаридом является мальтоза.

После затирания необходимо отделить жидкий экстракт (сусло) от твердых (барда, т.е. нерастворимое зерно и материал лузги, образующие часть солодовой крупки). Отделение сусла является важным, поскольку твердые содержат большие количества некрахмальных полисахаридов, протеина, слабомодифицированного крахмала, жировых веществ, силикатов и полифенолов (таннинов). Важными некрахмальными полисахаридами, присутствующими в злаковых зернах, являются бета-глюкан и арабиноксилан. Эндосперма клеточных стенок ячменя включает 75% бета-глюкана, 20% арабиноксилана и 5% остаточного протеина с малым количеством целлюлозы, глюкоманнана и фенольных кислот. Длинные цепи арабиноксиланов ячменя и, в меньшей степени, бета-глюкана, которые не были модифицированы в результате ферментативного гидролиза, могут вызвать образование гелей при солюбилизации в воде, и эти гели будут сильно повышать вязкость сусла и понижать фильтруемость. Подобным образом для качества сусла очень важно, чтобы бета-глюкан был уменьшен до более мелких олигомеров, поскольку немодифицированные бета-глюканы позднее будут вызывать проблемы со стойкостью к помутнению готового пива. Поэтому ферментные композиции, включающие эндоглюканазы и ксиланазы, такие как Ultraflo® или Viscozyme®, часто используют на стадии растирания для улучшения разделения сусла. Целями разделения сусла, среди прочего, являются:

- получение хорошего извлечения экстракта,

- получение хорошей фильтруемости,

- обеспечение прозрачного сусла.

Извлечение экстракта и фильтруемость являются важными для экономики процесса пивоварения, в то время как прозрачность является необходимостью для получения пива, в котором не образуется муть. Извлечение экстракта, фильтруемость и прозрачность сусла в значительной мере определяются стандартами солодовой крупки, например ячменного солода и типов добавки, а также примененной технологией затирания.

После отделения сусла от барды сусло может быть ферментировано пивными дрожжами для получения пива.

Дополнительную информацию об обычных способах пивоварения можно найти в "Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 2^nd revised Edition 1999, ISBN 3-921690-39-0.

Изобретение предлагает способ приготовления затора, имеющего улучшенную фильтруемость и/или улучшенный выход экстракта после фильтрации, который включает приготовление затора в присутствии ферментных активностей и фильтрацию затора для получения сусла, в котором ферментные активности включают ксиланазу семейства GH10 в количестве по меньшей мере 15%, 20%, предпочтительно 25%, таком как по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или даже 100 вес.% от общего веса ксиланазного и эндоглюканазного ферментного белка.

В предпочтительном осуществлении ксиланаза является ксиланазой типа А, и в особо предпочтительном осуществлении ксиланаза является ксиланазой типа А, имеющей отношение I_{1,3-концевое}/I_{1,3-внутреннее} по меньшей мере 0,25, такое как по меньшей мере 0,30, по меньшей мере 0,40, по меньшей мере 0,50 или даже по меньшей мере 0,60.

В другом предпочтительном осуществлении ксиланаза является ксиланазой, которая при описанном здесь анализе связывания имеет отношение связывания растворимого/нерастворимого волокна ячменя по меньшей мере 0,50, предпочтительно, по меньшей мере 0,60, более предпочтительно, по меньшей мере 0,70, такое как 0,80, 0,90, 1,00, 1,10 или даже по меньшей мере 1,20.

В другом предпочтительном осуществлении ксиланаза происходит из мицелиальных грибов, таких как из штамма Aspergillus sp., предпочтительно из Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9), из штамма Myceliophotora sp., предпочтительно из Myceliophotora thermophillia (SEQ ID NO:13), из штамма Humicola sp., предпочтительно, из Humicola insolens (SEQ ID NO:12). В еще одном предпочтительном осуществлении ксиланаза происходит из штамма Trichoderma sp., предпочтительно из T. reesei, такой как ксиланаза, показанная в SEQ ID NO: 17. В более предпочтительном варианте выполнения ксиланаза имеет по меньшей мере 50%, такую как по меньшей мере 60%, 70%, 80% или даже 90% гомологию с любой из последовательностей.

В другом предпочтительном осуществлении ксиланаза происходит из бактерий, таких как из штамма Bacillus, предпочтительно из Bacillus halodurans.

В другом предпочтительном осуществлении эндоглюканазой является эндоглюканаза, происходящая из Humicola sp., такая как эндоглюканаза из Humicola insolens (SEQ ID NO:3), или эндоглюканаза из H. insolens (SEQ ID NO:4), из Thermoascus sp., такая как эндоглюканаза, происходящая из Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO:6), или из Aspergillus sp., такая как эндоглюканаза, происходящая из Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO:16).

В предпочтительном осуществлении ксиланаза имеет по меньшей мере 50%, такую как по меньшей мере 60%, 70%, 80% или даже 90% гомологию с любой из вышеупомянутых последовательностей.

В другом предпочтительном осуществлении присутствует по меньшей мере один дополнительный фермент, каковым ферментом является арабинофуранозидаза.

Изобретение также предлагает способ уменьшения вязкости водного раствора, включающего гидролизат крахмала, где указанный способ включает испытание по меньшей мере одного ксиланолитического фермента на его гидролитическую активность по отношению к нерастворимому арабиноксилану пшеницы; выбор ксиланолитического фермента, который расщепляет близкие к разветвленным остатки, оставляя в результате конечно-замещенные олигосахариды ксилозы; и добавление выбранного ксиланолитического фермента к водному раствору, включающему гидролизат крахмала.

Изобретение далее предлагает способ уменьшения вязкости водного раствора, включающего гидролизат крахмала, где указанный способ включает испытание по меньшей мере одного эндоглюканолитического фермента на его гидролитическую активность по отношению к бета-глюкану ячменя; выбор эндоглюканолитического фермента, который в условиях: 10 мкг/мл очищенного фермента и 5 мг/мл бета-глюкана ячменя в 50 мМ ацетате натрия, 0,01% Triton X-100 при рН 5,5 и 50°С в течение 1 часа разлагает более чем 70% бета-глюкана ячменя до DP 6 или DP<6; и добавление выбранного эндоглюканолитического фермента к водному раствору, включающему гидролизат крахмала.

В предпочтительном осуществлении двух процессов водный раствор, включающий гидролизат крахмала, представляет собой затор для приготовления пива.

Изобретение предлагает также композицию, включающую ксиланазу семейства GH10, присутствующую в количестве по меньшей мере 15 вес.% от общего веса ферментного белка, и/или эндоглюканазу GH12, GH7 и/или GH5, присутствующую в количестве по меньшей мере 40 вес.% от общего веса ферментного белка.

В предпочтительном осуществлении ксиланаза композиции является ксиланазой типа А и, предпочтительно, ксиланазой типа А, имеющей отношение I_{1,3-концевое}/I_{1,3-внутреннее} по меньшей мере 0,25, такое как по меньшей мере 0,30, по меньшей мере 0,40, по меньшей мере 0,50 или даже по меньшей мере 0,60.

В предпочтительном осуществлении ксиланаза композиции происходит из мицелиальных грибов, таких как из штамма Aspergillus sp., предпочтительно из Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9), из штамма Myceliophotora sp., предпочтительно из Myceliophotora thermophillia (SEQ ID NO: 13), из штамма Humicola sp., предпочтительно, из Humicola insolens (SEQ ID NO: 12). В предпочтительном осуществлении ксиланаза композиции имеет по меньшей мере 50%, такую как по меньшей мере 60%, 70%, 80% или даже 90% гомологию с любой из вышеупомянутых последовательностей.

В предпочтительном осуществлении ксиланаза композиции происходит из бактерий, таких как из штамма Bacillus, предпочтительно из Bacillus halodurans.

В предпочтительном осуществлении эндоглюканазой композиции является эндоглюканаза, происходящая из Humicola sp., такая как эндоглюканаза из Humicola insolens (SEQ ID NO:3), эндоглюканаза из H. insolens (SEQ ID NO:4), или из Thermoascus sp., такая как эндоглюканаза, происходящая из Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO:6), или из Aspergillus sp., такая как эндоглюканаза, происходящая из Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO:16), или из Trichoderma sp., предпочтительно из T. reesei, и/или T. viride, такая как эндоглюканаза семейства 5, показанная в SEQ ID NO:18, бета-глюканаза семейства 7, показанная в SEQ ID NO:19, или бета-глюканаза семейства 12, показанная в SEQ ID NO:20.

В предпочтительном осуществлении эндоглюканаза композиции имеет по меньшей мере 50%, такую как по меньшей мере 60%, 70%, 80% или даже 90% гомологию с любой из вышеупомянутых последовательностей.

В предпочтительном осуществлении ксиланаза семейства GH10 композиции присутствует в количестве по меньшей мере 20%, предпочтительно 25%, таком как по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45% или даже по меньшей мере 50 вес.% от общего веса ксиланазного и эндоглюканазного ферментного белка.

В предпочтительном осуществлении эндоглюканаза GH семейства 12, 7 и/или 5 композиции присутствует в количестве по меньшей мере 25%, предпочтительно 30%, таком как по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45% или даже по меньшей мере 50%, таком как по меньшей мере 55% или даже по меньшей мере 60 вес.% от общего веса ксиланазного и эндоглюканазного ферментного белка.

Композиция согласно предшествующему аспекту может быть использована в процессе, включающем уменьшение вязкости водного раствора, включающего гидролизат крахмала.

Композиция может быть еще использована в процессе, включающем фильтрацию водного раствора, включающего гидролизат крахмала. В предпочтительном осуществлении водный раствор, включающий гидролизат крахмала, представляет собой затор для приготовления пива, и в другом предпочтительном осуществлении водный раствор, включающий гидролизат крахмала, представляет собой пищевую композицию.

Способ по изобретению может быть применен при затирании любой солодовой крупки. Согласно изобретению солодовая крупка может включать любой содержащий крахмал и/или сахар растительный материал, полученный из любого растения и любой части растения, включая клубни, корни, стебли, листья и семена. Предпочтительно солодовая крупка включает зерно, такое как зерно ячменя, пшеницы, ржи, овса, кома, риса, мило, проса и сорго, и, более предпочтительно, по меньшей мере 10% или, более предпочтительно, по меньшей мере 15%, еще более предпочтительно по меньшей мере 25% или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 35%, так что по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или даже по меньшей мере 100 вес.% солодовой крупки сусла получают из зерна.

Наиболее предпочтительно солодовая крупка включает осоложенное зерно, такое как ячменный солод. Предпочтительно по меньшей мере 10% или, более предпочтительно, по меньшей мере 15%, еще более предпочтительно по меньшей мере 25% или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 35%, так что по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или даже по меньшей мере 100 вес.% солодовой крупки сусла получают из осоложенного зерна.

Для затирания солодовых крупок с низким содержанием солода ферменты затирания могут быть поданными экзогенно. Ферменты, использованные главным образом как ферменты разложения крахмала, включают пуллуланазы, альфа-амилазы и амилоглюкозидазы. Использование разлагающих крахмал ферментов при затирании хорошо известно специалистам.

Добавка, включающая легкоферментируемые углеводы, такие как сахара или сиропы, может быть добавлена к солодовому затору до, во время или после процесса затирания по изобретению, но предпочтительно добавляется после процесса затирания. Часть добавки может быть обработана протеазой и/или эндоглюканазой и/или подвергнута тепловой обработке перед добавлением к затору по изобретению.

Во время процесса затирания крахмал, экстрагированный из солодовой крупки, постепенно гидролизуется до ферментированных сахаров и более мелких декстринов. Предпочтительно затор является крахмалом, негативным к иодной пробе перед отделением сусла.

Применение соответствующих ксиланазной и эндоглюканазной активностей в способе по настоящему изобретению приводит к эффективному снижению концентрации бета-глюкана и арабиноксилана, облегчающему разделение сусла, обеспечивая таким образом уменьшенное время цикла, высокое извлечение экстракта и прозрачное сусло.

Сусло, изготовленное способом по первому аспекту изобретения, может быть ферментировано для приготовления пива. Ферментация сусла может включать засевание сусла суспензией, содержащей свежие дрожжи, т.е. дрожжи, не использовавшиеся ранее для изобретения, или дрожжи могут быть рецикловыми дрожжами. Применяемые дрожжи могут быть любыми дрожжами, пригодными для пивоварения, в особенности дрожжами, выбранными из Saccharomyces spp., таких как S. cerevisiae и S. uvarum, включая природные или искусственно полученные варианты этих организмов. Способы ферментации сусла для приготовления пива хорошо известны специалистам.

Способ по изобретению может включать добавление гидрогеля диоксида кремния к ферментированному суслу для повышения коллоидной стабильности пива. Способы могут дополнительно включать добавление кизельгура к ферментированному суслу и фильтрацию для того, чтобы сделать пиво светлым. Пивом, изготовленным ферментацией сусла по изобретению, может быть любой тип пива, например эль, крепкий эль, стаут, портер, лагер, пильзнер, горькое, экспортное пиво, солодовый напиток, хаппушу, ламбик, ячменное вино, высокоалкогольное пиво, низкоалкогольное пиво, низкокалорийное пиво или легкое пиво.

Пиво, изготовленное способом по изобретению, может быть дистиллировано для извлечения этанола, например, для получения виски. Предполагается любой сорт виски, включая бурбон, канадское виски, ирландское виски, ржаное виски и шотландское виски.

Ксиланаза

Для данных целей ксиланаза является ферментом, классифицируемым как ЕС 3.2.1.8. Официальным названием является эндо-1,4-бета-ксиланаза. Системным названием является 1,4-бета-D-ксиланксиланогидролаза. Могут быть использованы другие названия, такие как эндо-(1,4)-бета-ксиланаза, (1-4)-бета-ксилан-4-ксиланогидролаза, эндо-1,4-ксиланаза, ксиланаза, бета-1,4-ксиланаза, эндо-1,4-ксиланаза, эндо-бета-1,4-ксиланаза, эндо-1,4-бета-D-ксиланаза, 1,4-бета-ксиланксиланогидролаза, бета-ксиланаза, бета-1,4-ксиланксиланогидролаза, эндо-1,4-бета-ксиланаза, бета-D-ксиланаза. Катализируемой реакцией является эндогидролиз 1,4-бета-D-ксилозидиновых связей в ксиланах.

Хотя ксиланаза, которая должна использоваться в настоящем изобретении, может быть любого происхождения, включая происхождение от млекопитающих, растительное или животное происхождение, в настоящее время предпочтительно, чтобы ксиланаза была микробиального происхождения. В частности, ксиланаза может быть ксиланазой, полученной из мицелиальных грибов или дрожжей.

Ксиланазы были обнаружены в ряде видов грибов, в частности видов Aspergillus, таких как A. niger, A. awamori, A. aculeatus и A. oryzae, Trichoderma, таких как T. reesei или T. harzianum, Penicillum, таких как P. camenbertii, Fusarium, таких как F. oxysporum, Humicola, таких как H. insolens, и Thermomyces lanuginosa, таких как T. lanuginosa. Ксиланазы были также обнаружены в видах бактерий, например в роде Bacillus, таких как B. pumilus.

Предпочтительно согласно способу по изобретению ксиланаза происходит от мицелиального гриба, такого как Aspergillus sp., Bacillos sp., Humicola sp., Mycellophotora sp., Poitrasia sp., Rhyzomucor sp. или Trichoderma.

Было показано, что специфичность субстрата является ключевым параметром для показателей работы ксиланаз в способе по изобретению. Представляется, что ксиланаза с оптимальным показателем работы в способе по изобретению должна быть ферментом, который присоединяется довольно прочно к растворимому арабиноксилану и довольно слабо - к нерастворимому арабиноксилану. Предпочтительно ксиланаза для использования в настоящем изобретении является ксиланазой, которая в анализе на связывание в методиках, описанных в этой заявке, имеет отношение связывания растворимое/нерастворимое волокно ячменя по меньшей мере 0,50, предпочтительно по меньшей мере 0,60, более предпочтительно по меньшей мере 0,70, такое как 0,80, 0,90, 1,00, 1,10 и даже по меньшей мере 1,20.

Ряд идентифицированных ксиланаз, имеющих эти характеристики, является членами семейства 10 глюкозидгидролаз. Предпочтительно ксиланаза для использования в настоящем изобретении является ксиланазой семейства 10 глюкозидгидролаз (GH10), и наиболее предпочтительно ксиланаза является ксиланазой GH10, которая является также ксиланазой типа А, т.е. ксиланазой, которая расщепляет нерастворимые полимеры арабиноксилана пшеницы близко к разветвленным остаткам, оставляя конечно-замещенные олигосахариды ксилозы (см. примеры для определения типов А и В). Поскольку ферменты GH10 способны подойти ближе к разветвленным ксилозным блокам, они образуют более мелкие олигосахариды, чем ксиланазы GH11.

Предпочтительно ксиланаза для использования в данном изобретении имеет функциональный СВМ, такой как СВМ семейства 1.

Предпочтительно согласно способу по изобретению ксиланазу выбирают из списка, состоящего из ксиланазы, показанной как ксиланаза из Aspergillus aculeatus, показанная как SEQ ID NO: 8 (AA XYL I), ксиланаза из Aspergillus aculeatus, показанная как SEQ ID NO: 9 (AA XYL II), ксиланаза из Bacillus halodurans, показанная как SWISS PROT P07528 (BH XYL A), ксиланаза из Humicola insolens, показанная как SEQ ID NO: 12 (HI XYL III), ксиланаза из Myceliophotora thermophila, показанная как SEQ ID NO: 13 (MT XYL I) и ксиланаза из Trichoderma reesei, такая как ксиланаза, показанная как SEQ ID NO: 17. Предпочтительной также является любая последовательность, имеющая по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или даже по меньшей мере 90% гомологии с любой из вышеупомянутых последовательностей ксиланаз.

Эндоглюканаза

Для данных целей эндоглюканаза является ферментом, классифицируемым как ЕС 3.2.1.4. Хотя эндоглюканаза, которая должна использоваться в настоящем изобретении, может быть любого происхождения, включая происхождение от млекопитающих, растительное или животное происхождение, в настоящее время предпочтительно, чтобы эндоглюканаза была микробиального происхождения. В частности, эндоглюканаза может быть эндоглюканазой, полученной из мицелиальных грибов или дрожжей.

Предпочтительно эндоглюканаза является глюканазой семейства 12 гликозидгидролаз (GH12), семейства 7 гликозидгидролаз (GH7), или семейства 5 гликозидгидролаз (GH5). Более предпочтительно эндоглюканаза является полипептидом, имеющим в суперструктуре бета-"рулет с джемом" или b8/a8-полость.

Хотя эндоглюканаза, которая должна использоваться в настоящем изобретении, может быть любого происхождения, включая происхождение от млекопитающих, растительное или животное происхождение, в настоящее время предпочтительно, чтобы эндоглюканаза была микробиального происхождения. В частности, эндоглюканаза может быть эндоглюканазой, полученной из мицелиальных грибов или дрожжей.

Более предпочтительно согласно способу по изобретению эндоглюканаза происходит от мицелиального гриба, такого как Aspergillus sp. или Humicola sp.

Предпочтительно, согласно способу по изобретению эндоглюканазу выбирают из списка, состоящего из эндоглюканазы из Aspergillus aculeatus, показанной в SEQ ID NO: 1 (AA EG I), эндоглюканазы из Aspergillus aculeatus, показанной в SEQ ID NO: 2 (AA EG II), эндоглюканазы из Aspergillus aculeatus, показанной в SEQ ID NO: 16 (AA EG III), эндоглюканазы из Humicola insolens, показанной в SEQ ID NO: 3 (HI EG I), эндоглюканазы из Humicola insolens, показанной в SEQ ID NO: 4 (HI EG III), эндоглюканазы из Humicola insolens, показанной в SEQ ID NO: 5 (HI EG IV), эндоглюканазы из Trichoderma sp., показанной в SEQ ID NO:19, или эндоглюканазы из Trichoderma sp., показанной в SEQ ID NO: 20. Предпочтительной также является любая последовательность, имеющая по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или даже по меньшей мере 90% гомологии с любой из вышеупомянутых последовательностей.

Другие глюканазы GH12 включают эндоглюканазы из Aspergillus sp., такие как из Aspergillus kawachi (SWISSPROT Q12679) или Aspergillus niger (SWISSPROT O74705), Aspergillus oryzae (SWISSPROT O13454), из Erwinia sp., таких как из Erwinia carotonova (SWISSPROT P16630), и из Thermotoga sp., таких как Thermotoga maritima (SWISSPROT Q60032 или Q9S5XB). Предпочтительной также является любая последовательность, имеющая по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или даже по меньшей мере 90% гомологии с любой из вышеупомянутых последовательностей глюканаз GH12.

Другие глюканазы GH7 включают эндоглюканазы, полученные из Agaricus sp., такие как из Agaricus bisporus (SWISSPROT Q92400), из Aspergillus sp., такие как из Aspergillus niger (SWISSPROT Q9UVS8), из Fusarium sp., такие как из Fusarium oxysporum (SWISSPROT P 46238), из Neuspora sp., такие как из Neuspora crassa (SWISSPROT P38676), или из Trichoderma sp., такие как из Trichoderma longibratchiatum (SWISSPROT Q12714). Предпочтительной также является любая последовательность, имеющая по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или даже по меньшей мере 90% гомологии с любой из вышеупомянутых последовательностей глюканаз GH7.

Другие глюканазы GH5 включают эндоглюканазы, полученные из Acidothermus sp., такие как из Acidothermus celluloliticus (SWISSPROT P554583), из Aspergillus sp., такие как из Aspergillus niger (SWISSPROT O74706), или из Bacillus sp., такие как из Bacillus polymixa (SWISSPROT P23548). Предпочтительной также является любая последовательность, имеющая по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или даже по меньшей мере 90% гомологии с любой из вышеупомянутых последовательностей глюканаз GH5.

Арабинофуранозидаза

Арабинофуранозидаза ЕС 3.2.1.55, общее наименование альфа-N-арабинофуранозидаза, гидролизует концевые невосстановленные остатки альфа-L-арабинофуранизида в альфа-L-арабинозидах. Фермент действует на альфа-L-арабинофуранизиды, альфа-L-арабинаны, содержащие (1,3)- и/или (1,5)-связи арабиноксиланы и арабиногалактаны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ

Ксиланазная активность

Ксиланолитическая активность может быть выражена в единицах FXU, определенных при рН 6,0 с ремазол-ксиланом (4-О-метил-D-глюкуроно-D-ксилан, окрашенный Remazol Brilliant Blue R, Fluka) в качестве субстрата.

Образец ксиланазы инкубируют с ремазол-ксилановым субстратом. Фон неразложенного окрашенного субстрата осаждают этанолом. Оставшаяся голубая окраска супернатанта (что определено спектрофотометрически на 585 нм) пропорциональна ксиланазной активности, и ксиланазные единицы затем определяют относительно ферментного стандарта при стандартных условиях реакции: т.е. при 50,0°С, рН 6,0 и времени реакции 30 мин.

Папка AF 293.6/1, описывающая этот аналитический метод более подробно, доступна по запросу в Novozymes A/S, Denmark, каковая папка настоящим включена ссылкой.

Глюканазная активность

Целлюлитическая активность может быть измерена в единицах грибной эндоглюканазы (FBG), определенных на 0,5% бета-глюкановом субстрате при 30°С, рН 5,0 и времени реакции 30 мин. Грибная эндоглюканаза реагирует с высвобождаемой бета-глюканом глюкозой или восстанавливаемым углеводом, который определяется как восстановленный сахар согласно методу Somogyl-Nelson.

Единица активности грибной эндоглюканазы (FBG) является количеством фермента, которое соответственно указанным выше стандартным условиям высвобождает глюкозу или восстанавливаемый углевод с восстановительной способностью, эквивалентной 1 ммоль глюкозы в минуту.

Ферменты

Ultraflo® L., многокомпонентная ферментная композиция, полученная из Humicola insolens, включающая смесь эндоглюканаз, ксиланаз, пентозаназ и арабаназ. Ultraflo® L. стандартизован до 45 FBG/г и имеет плотность приблизительно 1,2 г/мл. Ultraflo® L может быть получен от Novozymes A/S.

Viscozyme® L., многокомпонентная ферментная композиция, полученная из Aspergillus aculeatus, включающая смесь эндоглюканаз, арабаназ и ксиланаз. Viscozyme® L. стандартизован до 100 FBG/г и имеет плотность приблизительно 1,2 г/мл. Viscozyme может быть получен от Novozymes A/S.

Alcase®, Subtilisin, протеазная композиция, полученная из Bacillus licheniformis. Alcase® может быть получен от Novozymes A/S.

Termamyl SC®, Bacillus альфа-амилаза может быть получена от Novozymes A/S.

Были применены следующие однокомпонентные эндоглюканазы и ксиланазы.

Эндоглюканазы
AA EG I	Aspergillus aculeatus		SEQ ID NO:1
AA EG II	Aspergillus aculeatus	Cel12b	SEQ ID NO:2
АА EG III	Aspergillus aculeatus	Cel12a	SEQ ID NO:16
HI EG I	Humicola insolens	Cel12a, GH12	SEQ ID NO:3
HI EG III	Humicola insolens	Cel12a, GH12	SEQ ID NO:4
HI EG IV	Humicola insolens	Cel5a,GH12	SEQ ID NO:5
HI EG V	Humicola insolens	Cel45a, GH45	SEQ ID NO:8
TA EG BG025	Thermoascus aurantiacus		SEQ ID NO:6
Ксиланазы
АА XYL I	Aspergillus aculeatus	GH10,Type A	SEQ ID NO:8
AA XYL II	Aspergillus aculeatus	GH10, Type A	SEQ ID NO:9
АА XYL III	Aspergillus aculeatus	GH11, Type B	SEQIDNO:10
BH XYL A	Bacillus halodurans	GH10, Type A	SWISS PROT P07528
HI XYL I	Humicola insolens	GH11, Type B	SEQ ID NO:11
HI XYL III	Humicola insolens	GH10, Type A	SEQ ID NO:12
MT XYL I	Myceliophotora thermophila	GH10, Type A	SEQ ID NO:13
MT XYL III	Myceliophotora thermophila	GH11, Type B	SEQ ID NO:14
TL XYL	Thermomyces lanuginosus	GH11, Type B	SEQ ID NO:15

МЕТОДЫ

Приготовление затора

Если не указано иное, затирание проводили следующим образом. Исключая отмеченное (например, в отношении дозировки фермента), затор готовили согласно ЕВС: 4.5.1, используя солод, размолотый согласно ЕВС: 1.1. Опыты по затиранию проводили в 500 мл закрываемых крышками сосудах, выдерживаемых в водяной бане с перемешиванием, и каждый содержал затор с 50 г солодовой крупки, дополненный до общего веса в 300±0,2 г водой, предварительно нагретой до начальной температуры инкубации +1°С. Полученное сусло имело приблизительно 12% Плато.

Температурный профиль затирания

Если не указано иное, затирание проводили, используя температуру начальной инкубации 52°С в течение 30 мин, за чем следовал шаг повышения температуры до 63°С с оставлением этой температуры на 20 мин. Профиль продолжали с шагом повышения до 72°С на 30 мин и затирание завершали при 78°С в течение 5 мин. Все поэтапные температурные градиенты осуществляли повышением на 1°С/мин. Затор охлаждали до 20°С в течение 15 мин, что давало в результате суммарный период инкубации 2 ч 11 мин.

Дополнительные методики

Методики анализа сырья, продуктов, сусла, пива и т.д. можно найти в Analytica-EBC, Analysis Committee of EBC, the European Brewing Convention (1998), Verlag Hans Carl Geranke-Fachverlag. Для настоящего изобретения методами, применяемыми для определения следующих параметров, были методы, указанные ниже.

Плато: рефрактометр.

Бета-глюкан: ЕВС: 8.13.2 (High molecular weight beta-glucan content of wort fluorimetric method).

Мутность: ЕВС: 4.7.1.

Фильтруемость: определение объема (мл) фильтрата: согласно ЕВС: 4.5.1 (Extract of Malt: Congress Mash) subsection 8.2. Filterability: объем фильтрата замеряли после 1 ч фильтрации через гофрированную фильтровальную бумагу диаметром 320 мм, Schleicher and Schüll, No 597 1/2, Machery, Nagel and Co в воронки диаметром 200 мм, присоединенные к 500 мл колбам.

Извлечение экстракта: ЕВС: 4.5.1 (Extract of Malt: Congress Mash. Extract in dry). Термин "извлечение экстракта в сусло" определен как сумма растворимых веще