Новые пиримидинамидные производные и их применение

Новые пиримидинамидные производные и их применение

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым замещенным N-(3-бензоиламинофенил)-4-пиридил-2-пиримидинаминовым производным, способам их получения, содержащим их фармацевтическим композициям, их применению необязательно в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными соединениями для лечения заболевания, которое связано с ингибированием активности протеинкиназы, особенно пролиферативного заболевания, и к способам лечения такого заболевания.

Протеинкиназы (РК) являются ферментами, которые катализируют фосфорилирование остатков серина, треонина или тирозина в клеточных белках. Эти посттрансляционные модификации субстратных белков выступают в качестве молекулярных регуляторов клеточной пролиферации, активации и/или дифференциации. Ненормальная или избыточная активность РК наблюдается в многочисленных заболеваниях, включая доброкачественные и злокачественные пролиферативные заболевания. В ряде случаев лечение заболеваний, таких как пролиферативные заболевания, возможно с помощью применения РК ингибиторов in vitro и in vivo.

Ввиду большого количества ингибиторов протеинкиназы и множества пролиферативных и других заболеваний, связанных с РК, все еще существует потребность в получении новых классов соединений, которые были бы полезными в качестве ингибиторов РК, и таким образом для лечения этих заболеваний, связанных с РК, необходимы новые классы фармацевтически приемлемых соединений, ингибирующих РК.

Филадельфийская хромосома является признаком хронической миеломной лейкемии (CML) и несет гибридный ген, который содержит N-терминальные экзоны bcr гена и основную С-терминальую часть (экзоны 2-11) с-abl гена. Ген кодирует химерный белок 190 кДа, 210 кДа или 230 кДа в зависимости от того, какие из трех альтернативных точек остановки включены в bcr. Abl-часть Bcr-Abl белка содержит Abl-тирозинкиназу, которая слабо регулируется в диком виде с-Abl, но сильно активируется в Bcr-Abl белке слияния. Это неодинаковое регулирование тирозинкиназы соотносится с многочисленными путями клеточных сигналов, приводящих к трансформации и неодинаковому регулированию пролиферации клеток (Lugo и др., Science 247, 1079 [1990]).

р210 Bcr-Abl экспрессируется у 95% пациентов с CML и приблизительно у 33% пациентов с острой лимфобластомной лейкемией (ALL). Экспрессия меньшего белка р190 кДа чаще всего происходит при ALL, но иногда при CML, и характеризуется клинически усиленным моноцитозом. Белок слияния 230 кДа связан с редкой хронической нейтрофильной лейкемией, чья прогрессия в преодолении кризиса является медленной. На развитой стадии CML и особенно ALL часто появляются клоны, в которых мутирует киназный домен Bcr-Abl белка. Такие мутанты включают, например, E225V и М351Т трансформации (Shah и др., Cancer Research 2, 117-225 [2002]).

Мутантные ras онкогены часто связаны с ростом опухоли. Белки Ras экспрессируются из трех различных генов, а именно Neuroblastoma (N)-ras, Harvey (Ha)-ras и Kirsten (К)-ras. K-ras мутирует чаще всего в твердых опухолях, таких как рак толстой кишки, легких и особенно поджелудочной железы, и N-ras мутирует в гематопоэтических опухолях, преимущественно в острой миеломной лейкемии (Lyons и др., Endocrine-Related Cancer 8, 219 [2001]). Было показано, что Ras регулирует некоторые пути клеточной трансформации, включая, например, Raf/MEK пути посредством связывания и активации Raf киназы.

N-(3-бензоиламинофенил)-4-пиридил-2-пиримидинаминовые производные формулы 1, описанные далее более подробно, проявляют отличное ингибирование активности протеинкиназ, особенно ингибирование одной или нескольких тирозинкиназ, таких как Bcr-Abl, мутантная Bcr-Abl, с-Abl, Raf, рецептор тирозинкиназ PDGF-R, Flt3, VEGF-R, EGF-R и c-Kit, а также комбинации двух или нескольких из них. В частности, соединения по изобретению проявляют хорошую активность в отношении некоторых мутированных форм Bcr-Abl, которые наблюдались у пациентов, резистентных к лекарственным средствам. Благодаря этим активностям соединения могут использоваться для лечения заболеваний, связанных особенно с неправильной или избыточной активностью таких типов киназ, например, для лечения некоторых видов лейкемий и твердых опухолей, таких как рак толстой кишки, легких и поджелудочной железы.

Данное изобретение относится к соединению формулы 1,

где

R₁ представляет собой водород и R₂ представляет собой NR₅R₆, или R₁ представляет собой NR₅R₆ и R₂ представляет собой водород;

R₃ представляет собой низший алкил, фторалкил, гидроксиалкил или карбамоил;

R₄ представляет собой водород, низший алкил или галоген; и

R₅ и R₆ представляют собой, независимо друг от друга, водород, низший алкил, гидрокси-низший алкил, низший алкокси-низший алкил, низший асилокси-низший алкил, карбокси-низший алкил, низший алкоксикарбонил-низший алкил, амино-низший алкил, низший алкиламино-низший алкил, ди(низший алкил)амино-низший алкил, N-низший алкилпиперидинил, N-низший алкилпирролидинил или низший ацил, или R₅R₆ вместе представляют собой алкилен с четырьмя, пятью или шестью атомами углерода, окса-низший алкилен с одним атомом кислорода и тремя или четырьмя атомами углерода, или азанизший алкилен с одним атомом азота и тремя или четырьмя атомами углерода, где атом азот является незамещенным или замещенным низшим алкилом, гидрокси-низшим алкилом или низшим алкокси-низшим алкилом, и где низший алкилен в каждом случае может быть частично или полностью ненасыщенным и/или атомы углерода низшего алкилена могут быть замещены низшим алкилом, гидрокси или низшим алкокси;

и N-оксиду или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

Общие термины, которые используются здесь и далее, предпочтительно имеют следующие значения в контексте описания, если конкретно не указано иное:

"Низший" обозначает радикал, имеющий до 7 включительно, особенно до 4 включительно атомов углерода, радикалы являются либо линейными, либо разветвленными с одним или несколькими ответвлениями.

В случае если для соединений, солей и им подобных используется множественное число, предполагается, что одно соединение, соль или им подобные также включены.

В (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации, предпочтительно в (R)- или (S)-конфигурации могут присутствовать асимметричные атомы углерода. Соединения могут присутствовать в виде смесей изомеров или в виде чистых изомеров, предпочтительно в виде энантиомерно чистых диастереомеров.

Настоящее изобретение также относится к возможным таутомерам соединений формулы 1.

Низший алкил предпочтительно представляет собой алкил с 1-7, предпочтительно с 1-4 атомами углерода, и является линейным или разветвленным; предпочтительно, низший алкил представляет собой бутил, такой как н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, пропил, такой как н-пропил или изопропил, этил или метил. Предпочтительно низший алкил представляет собой метил, пропил или трет-бутил.

Низший ацил предпочтительно представляет собой формил или низший алкилкарбонил, особенно ацетил.

Гидроксиалкил представляет собой особенно гидрокси-низший алкил, предпочтительно гидроксиметил, 2-гидроксиэтил или 2-гидрокси-2-пропил.

Фторалкил представляет собой особенно фтор-низший алкил, предпочтительно трифторметил или пентафторэтил.

Галоген представляет собой особенно фтор, хлор, бром или йод, особенно фтор, хлор или бром.

Низший алкокси представляет собой особенно метокси, этокси, изопропилокси или трет-бутилокси.

Низший алкоксикарбонил представляет собой особенно трет-бутоксикарбонил, изопропоксикарбонил, метоксикарбонил или этоксикарбонил.

Соли особенно представляют собой фармацевтически приемлемые соли соединений формулы 1.

Такие соли получают, например, в виде кислотных аддитивных солей, предпочтительно с органическими или неорганическими кислотами, из соединений формулы 1 с основным атомом азота, особенно в виде фармацевтически приемлемых солей. Подходящими неорганическими кислотами являются, например, галогенсодержащие кислоты, такие как соляная кислота, серная кислота или фосфорная кислота. Подходящими органическими кислотами являются, например, карбоновые, фосфорные, сульфоновые или сульфаминовые кислоты, например, уксусная кислота, пропановая кислота, октановая кислота, декановая кислота, додекановая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аминокислоты, такие как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, метилмалеиновая кислота, циклогексанкарбоновая кислота, адамантанкарбоновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, фталевая кислота, фенилуксусная кислота, манделиновая кислота, коричная кислота, метан- или этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 2-нафталенсульфоновая кислота, 1,5-нафталендисульфоновая кислота, 2-, 3- или 4-метилбензолсульфоновая кислота, метилсерная кислота, этилсерная кислота, додецилсерная кислота, N-циклогексилсерная кислота, N-метил-, N-этил- или N-пропилсульфаминовая кислота, или другие органические протонные кислоты, такие как аскорбиновая кислота.

Для выделения или очистки также возможно применение фармацевтически неприемлемых солей, например, пикратов или перхлоратов. Для терапевтического применения используются только фармацевтически приемлемые соли или свободные формы соединений (где применимо в форме фармацевтических составов), и, следовательно, они являются предпочтительными.

Ввиду сродства между новыми соединениями в свободной форме и соединениями в форме их солей, включая те соли, которые могут использоваться в качестве промежуточных соединений, например, для очистки или идентификации новых соединений, любое указание на свободную форму соединений здесь и далее должно относиться также к соответствующим солям, которые являются подходящими и приемлемыми.

Соединения формулы 1 и их N-оксиды имеют ценные фармакологические свойства, как описано здесь и далее.

Эффективность соединений по изобретению в качестве ингибиторов активности с-Abl, Bcr-Abl, Raf и VEGF-рецептора тирозинкиназы может быть определена следующим образом.

Тест на активность в отношении с-Abl протеинтирозинкиназы. Тест проводили как фильтровальный анализ на связывание следующим образом: домен His-меченой киназы с-Abl клонировали и экспрессировали в системе бакуловирус/Sf9, как описано Bhat и др., J. Biol. Chem. 272, 16170-5 (1997). Белок 37 кДа (с-Abl киназа) очищали двухстадийной методикой на колонке с хелатом металлического кобальта с последующей анионообменной колонкой с выходом 1-2 мг/л Sf9 клеток. Чистота с-Abl киназы составляла >90%, что определяли SDS-PAGE после подкрашивания кумачевым синим. Анализ включает: с-Abl киназу (50 нг), 20 мМ Tris·HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 10 мкМ Na₃VO₄, 1 мМ DTT и 0,06 мк Ci/анализ [γ³³Р]-АТФ (5 мкМ АТФ), используя 30 мкг/мл поли-Ala, Glu, Lys, Tyr-6:2:5:1 (Poly-AEKY, Sigma P1152) в присутствии 1% ДМСО, общий объем 30 мкл. Реакции обрывали добавлением 10 мкл 250 мМ EDTA, и 30 мкл реакционной смеси переносили на мембрану Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA), предварительно смоченную в течение 5 мин метанолом, промывали водой, затем промывали 5 мин 0,5% H₃PO₄ и загружали в вакуумную трубку с неподсоединенным вакуумным источником. После загрузки всех образцов подсоединяли вакуум и каждую ячейку промывали 200 мкл 0,5% H₃PO₄. Мембраны удаляли и промывали на вибраторе 0,5% H₃PO₄ (4 раза) и один раз этанолом. Мембраны исследовали после высушивания при температуре окружающей среды, загружали в 96-ячеечную подложку Packard TopCount и добавляли 10 мкл/ячейку Microscint TM (Packard).

Тест на активность в отношении Bcr-Abl. Миелоидную прародительскую клеточную линию мыши 32Dcl3, трансфецированную р210 Bcr-Abl вектором экспрессии pGDp210Bcr/Abl (32D-bcr/abl), получали от J.Griffin (Dana Faber Cancer Institute, Boston, MA, USA). Клетки экспрессировали белок слияния Bcr-Abl с изначально активной Abl киназой и независимо пролиферировали фактор роста. Клетки обрабатывали RPMI 1640 (AMIMED), 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамина (Gibco) („полная среда”) и рабочий раствор получали замораживанием аликвот 2×10⁶ клеток на сосуд в среде для замораживания (95% FCS, 5% ДМСО-d₆ (SIGMA)). После размораживания клетки использовали максимально 10-12 раза в экспериментах.

Для клеточного испытания соединения растворяли в ДМСО и разбавляли полной средой с получением начальной концентрации 10 мкМ, затем получали 3-кратно разбавленные растворы в полной среде. 200'000 32D-Bcr/Abl клетки в 50 мкл полной среды высаживали в каждую ячейку 96-ячейчных круглодонных подложек для культуры тканей. К клеткам трижды добавляли 50 мкл на ячейку серийных 3-кратных разбавлений тестируемого соединения. Необработанные клетки использовали в качестве контроля. Соединение инкубировали вместе с клетками в течение 90 мин при 37°С, 5% CO₂, затем центрифугировали подложки с культурой тканей при 1300 об/мин (центрифуга Beckman GPR) и супернатанты удаляли, сливая осторожно, чтобы не удалить остаток клеток. Остатки клеток лизировали добавлением 150 мкл лизисного буфера (50 мМ Tris/HCl, рН 7,4, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% NP-40, 2 мМ орто-ванадата натрия, 1 мМ PMSF, 50 мкг/мл апротинина и 80 мкг/мл леупептина) и непосредственно использовали в ELISA или хранили замороженными в подложках при -20°С до использования.

Черные подложки ELISA (черные подложки Packard HTRF-96) предварительно обрабатывали в течение ночи при 4°С 50 нг/ячейку поликлональным анти-abl-SH3 доменом Ab 06-466 кролика от Upstate в 50 мкл PBS. После промывания 3 раза 200 мкл/ячейку PBS, содержащим 0,05% Tween20 (PBST) и 0,5% TopBlock (Juro), оставшиеся сайты связывания белка блокировали 200 мкл/ячейку PBST, 3% TopBlock в течение 4 ч при комнатной температуре, затем инкубировали с 50 мкл лизатов необработанных или обработанных соединением клеток (20 мкг всего белка на ячейку) в течение 3-4 ч при 4°С. После 3 промываний добавляли 50 мкл/ячейку анти-фосфотирозина Ab PY20(AP), меченого щелочной фосфатазой (Zymed), разбавленного до 0,2 мкг/мл в блокирующем буфере и инкубировали в течение ночи (4°С). На всех стадиях инкубации подложки покрывали крышками (Costar). Наконец, подложки промывали еще три раза промывочным буфером и один раз деионизированной водой перед добавлением 90 мкл/ячейку АР-субстрата CDPStar RTU с Emerald II. Подложки, закрытые крышками Packard TopSeal™-А, инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре в темноте и количественно определяли люминесценцию измерением показателей в секунду (CPS) с помощью Packard Top Count Microplate Scintillation Counter (Top Count).

Определяли разницу между показаниями ELISA (CPS), полученными для лизатов необработанных 32D-Bcr/Abl клеток, и показаниями базового анализа (все компоненты, но без клеточного лизата) и за 100% брали отражение изначально фосфорилированного Bcr-Abl белка, присутствующего в этих клетках. Влияние соединения на активность Bcr-Abl киназы выражали как процентное снижение фосфорилирования Bcr-Abl. Значения IC₅₀ и IC₉₀ определяли по кривым зависимостей от доз графическим экстраполированием.

Тест на активность в отношении мутантной Bcr-Abl: активность соединений в отношении активности М351Т мутантной Bcr-Abl киназы осуществляли, как описано выше, за исключением того, что использовали 32Dcl3 клетки, трансфецированные мутантным Bcr-Abl вместо р210 Bcr-Abl.

Анализ с c-Raf-1 протеинкиназой: рекомбинантный c-Raf-1 белок получали тройной обработкой Sf21 клеток GST-c-Raf-1 рекомбинантным бакуловирусом вместе с v-Src и v-Ras рекомбинантными бакуловирусами, что требуется для активации продуцирования c-Raf-1 киназы (Williams и др., PNAS 1992; 89:2922-6). Активный Ras (v-Ras) необходим для проникновения c-Raf-1 в клеточную мембрану и v-Src для фосфорилирования c-Raf-1 для полного его активирования. Клетки высаживали в количестве 2,5×10⁷ клеток в 150 мм плашку и оставляли связываться в плашках на 150 в течение 1 час при комнатной температуре. Среду (SF900II, содержащий 10% FBS) удаляли и добавляли рекомбинантный бакуловирус GST-c-Raf-1, v-Ras и v-Src в количестве MOI 3,0, 2,5 и 2,5 соответственно, общим объемом 4-5 мл. Клетки инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и затем добавляли 15 мл среды. Обработанные клетки инкубировали в течение 48-72 ч при 27°С. Обработанные Sf21 клетки выскабливали и собирали в пробирки на 50 мл и центрифугировали в течение 10 мин при 4°С в количестве 1100 г на центрифуге Sorvall. Остаток клеток промывали один раз ледяным PBS и лизировали 0,6 мл лизисного буфера в количестве 2,5×10⁷ клеток. Полный лизис клеток достигался через 10 мин во льду при редком прикапывании. Клеточные лизаты центрифугировали в течение 10 мин при 4°С в количестве 14,500 г на центрифуге Sorvall с SS-34 ротором и супернатант переносили в чистую пробирку и хранили при -80°С. c-Raf-1 очищали от клеточных лизатов с помощью 100 мкл расфасованных гранул глутатион-сефарозы 4В, уравновешенных в охлажденном льдом PBS, в количестве 2,5×10⁷ клеток. GST-c-Raf-1 оставляли связываться с гранулами при 4°С в течение 1 часа при покачивании. Связавшийся с гранулами GST-c-Raf-1 переносили на колонку. Колонку промывали один раз лизисным буфером и два раза охлажденным льдом TRis буферным соляным раствором. Добавляли охлажденный льдом буфер для промывки и поток колонки останавливали для того, чтобы позволить свободному глутатиону разорвать взаимодействие GST-c-Raf-1 с глутатион-сефарозными гранулами. Фракцию (1 мл) собирали в предварительно охлажденные пробирки. Каждая пробирка содержит 10% глицерина (конечная концентрация) для сохранения активности киназы в процессе циклов замораживания-оттаивания. Очищенные фракции белка GST-c-Raf-1 киназы хранили при -80°С.

IκВ использовали в качестве субстрата для c-Raf-1 киназы. IκВ экспрессировался в бактериях в виде His-меченого белка BL21. LysS бактерии, содержащие плазмиду IκВ, высаживали в OD600 0,6 в среде LB, затем индуцировали экспрессию IκВ с помощью IPTG (конечная концентрация 1 мМ) в течение 3 часов при 37°С и затем бактерии подвергали лизису озвучиванием (microtip ограничение, установленное 3 раза на 1 мин), в буфере для озвучивания [50 мМ Tris рН 8,0, 1 мМ DTT, 1 мМ EDTA] и центрифугировали при 10,000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант смешивали с сульфатом аммония с получением конечной концентрации 30%. Эту смесь встряхивали в течение 15 мин при 4°С, затем раскручивали при 10,000 об/мин в течение 15 мин. Остаток повторно суспендировали в связующем буфере (Novagen), содержащем 10 мМ БСА. Этот раствор наносили на Ni-агарозу (Novagen) и промывали в соответствии с инструкцией Novagen. IκВ смывали с колонки буфером для промывки (0,4 М имидазола, 0,2 М NaCl, 8 мМ Tris рН 7,9). Фракции, содержащие белок, подвергали диализу в 50 мМ Tris рН 8,1 мМ DTT.

Активность c-Raf-1 протеинкиназы измеряли в присутствии или отсутствии ингибиторов, измерением проникновения ³³Р из [γ³³Р] АТФ в IκВ. Анализ осуществляли в 96-ячеечных подложках при температуре окружающей среды в течение 60 мин. Они содержали (общий объем 30 мкл): c-Raf-1 киназу (400 нг), 25 мМ Tris·HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 5 мМ MnCl₂, 10 мкМ Na₃VO₄, 1 мМ DTT и 0,3 мк Ci/анализ [γ³³Р]-АТФ (10 мкМ АТФ), используя 600 нг IκВ в присутствии 1% ДМСО. Реакции обрывали добавлением 10 мкл 250 мМ EDTA и 30 мкл реакционной смеси переносили на мембрану Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA), предварительно намоченную в течение 5 мин метанолом, промытую водой, затем намоченную в течение 5 мин 0,5% H₃PO₄ и помещенную на вакуумный сборник с отсоединенным источником вакуума. После загрузки всех образцов присоединяли вакуум и каждую ячейку промывали 200 мкл 0,5% H₃PO₄. Мембраны удаляли и промывали 4 раза на вибраторе с 0,5% H₃PO₄, один раз с этанолом. Мембраны количественно измеряли после высушивания при температуре окружающей среды, устанавливая на Packard TopCount 96-ячеечную рамку и добавляя 10 мкл/ячейку Microscint TM (Packard).

Тест на активность в отношении тирозинкиназы VEGF-рецептора. Тест проводили с помощью тирозинкиназы Flt-1 VEGF-рецептора. Подробная методика приведена далее: раствор 30 мкл киназы (10 нг киназного домена Flt-1, Shibuya и др., Oncogene 5, 519-24 [1990]) в 20 мМ Tris·HCl pH 7,5, 3 мМ дихлорида марганца (MnCl₂), 3 мМ хлорида магния (MgCl₂), 10 мкМ ванадата натрия, 0,25 мг/мл полиэтиленгликоля (PEG) 20000, 1 мМ дитиотреитола и 3 мкг/мкл поли(Glu, Tyr) 4:1 (Sigma, Buchs, Switzerland), 8 мкМ [³³P]-АТФ (0,2 мк Ci), 1% ДМСО и 0-100 мкМ тестируемого соединения инкубировали вместе в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию затем останавливали добавлением 10 мкл 0,25 М этилендиаминтетраацетата (EDTA) pH 7. Используя многоканальный передатчик (LAB SYSTEMS, USA), аликвоты 20 мкл переносили на PVDF (= поливинилдифторид) Immobilon P мембраны (Millipore, Bedford, USA), на Gibco-BRL микротитровальный фильтр и подсоединяли к вакууму. После полного расщепления жидкости мембрану промывали 4 раза последовательно в бане, содержащей 0,5% фосфорной кислоты (H₃PO₄), и один раз этанолом, инкубировали в течение 10 минут все, время встряхивая, затем загружали на Hewlett Packard TopCount Manifold и измеряли радиоактивность добавлением 10 мкл Microscint® (β-стинтилляционный счетчик для жидкостей). IC₅₀-значения определяли линейным регрессионным анализом процентного соотношения ингибирования каждого соединения по крайней мере в четырех концентрациях (как правило, 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мкмоль). IC₅₀-значения для соединений формулы 1 находятся в пределах 1-10'000 нМ, предпочтительно в пределах 1-100 нМ.

Ингибирование VEGF-индуцированного автофосфорилирования KDR-рецептора может быть подтверждено следующим экспериментом in vitro на клетках: трансфецированные СНО клетки, которые постоянно экспрессируют клетки VEGF рецептора (KDR), высаживали в полную культуральную среду с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FCS) в 6-ячеечные подложки для клеток и инкубировали при 37°С под 5% СО₂ приблизительно до 80% слияния. Затем тестируемые соединения разбавляли культуральной средой (без FCS, с 0,1% бычьим сывороточным альбумином) и добавляли к клеткам (контроли включали среду без тестируемых соединений). Через два часа инкубирования при 37°С добавляли рекомбинантный VEGF; конечная концентрация VEGF составляет 20 нг/мл. Еще через пять минут инкубирования при 37°С клетки промывали два раза охлажденным льдом PBS (фосфат-буферный соляной раствор) и немедленно подвергали лизису в 100 мкл лизисного буфера на ячейку. Затем лизаты центрифугировали для удаления клеточных ядер и концентрации белка супернатантов измеряли с помощью коммерчески доступного белкового анализа (BIORAD). Лизаты затем могут использоваться немедленно или, при необходимости, храниться при -20°С.

Для измерения фосфорилирования KDR-рецептора проводили сэндвич ELISA: моноклональное антитело к KDR (например, Mab 1495, 12, 14) иммобилизировали на черных ELISA подложках (OptiPlate™ HTRF-96 от Packard). Затем подложки промывали и оставшиеся свободные белок-связывающие сайты насыщали 1% БСА в PBS. Клеточные лизаты (20 мкг белка на ячейку) затем инкубировали в этих же подложках в течение ночи при 4°С вместе с антителом к фосфотирозину, связанным с щелочной фосфатазой (PY20:AP от Transduction Laboratories). Подложки промывали опять и связывание антитела к фосфотирозину с захваченным фосфорилированным рецептором, затем определяли с помощью люминесцентного АР субстрата (CDP-Star, готовый к применению, с Emerald II; TROPIX). Люминесценцию измеряли на Packard Top Count Microplate Scintillation Counter (Top Count). Разница между сигналом положительного контроля (стимулируемого VEGF) и сигналом отрицательного контроля (не стимулируемого VEGF) соответствует VEGF-индуцированному фосфорилированию KDR-рецептора (=100%). Активность тестируемых веществ рассчитывали как % ингибирование VEGF-индуцированного фосфорилирования KDR-рецептора, где концентрацию вещества, которая вызывает половину максимального ингибирования, определяли как ED50 (эффективная доза для 50% ингибирования). Соединения формулы 1 предпочтительно имеют значения ED50 в области от 0,25 нМ до 1000 нМ, предпочтительно от 0,25 до 250 нМ.

Соединение формулы 1 или его N-оксид в различной степени ингибирует также другие тирозинкиназы, вовлеченные в сигнальную трансдукцию, которые опосредуются трофными факторами, например, Raf, Bcr-Abl и Abl киназу, Arg, киназы из семейства Src, особенно c-Src киназу, Lck и Fyn; также киназы семейства EGF, например, с-erbB2 киназу (HER-2), с-erbB3 киназу, с-erbB4 киназу; киназу инсулиноподобного рецептора фактора роста (IGF-1 киназа), особенно членов семейства тирозинкиназы PDGF-рецептора, таких как киназа PDGF-рецептора, киназа CSF-1-рецептора, киназу Kit-рецептора и киназу VEGF-рецептора; а также серин/треонинкиназы, каждая из которых играет важную роль для регулирования и трансформации клеток млекопитающих, включая клетки человека.

Ингибирование с-erbB2 тирозинкиназы (HER-2) может быть измерено, например, тем же способом, что и ингибирование EGF-R протеинкиназы, используя известные методики.

На основе этих исследований соединение формулы 1 по изобретению проявляет терапевтическую эффективность, особенно в отношении заболеваний, зависящих от протеинкиназы, особенно пролиферативных заболеваний.

На основе этой эффективности в качестве ингибиторов активности тирозинкиназы VEGF-рецептора соединения формулы 1 ингибируют главным образом рост сосудов крови и таким образом являются, например, эффективными против ряда заболеваний, связанных с нерегулируемым ангиогенезом, особенно заболеваний, вызванных глазной неоваскуляризацией, особенно ретинопатиями, такими как диабетическая ретинопатия или возрастная дегенерация сетчатки, псориазом, гемангиобластомой, такой как гемангиома, мезанглиальных клеточных пролиферативных заболеваний, таких как хронических или острых заболеваний почек, например, диабетическая нефропатия, злокачественный нефросклероз, тромботические микроангиопатические синдромы или отторжение трансплантата, или особенно воспалительное заболевание почек, такое как гломерулонефрит, особенно мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитического-уремического синдрома, диабетической нефропатии, гипертензивного нефросклероза, атеромы, артериального рестеноза, аутоиммунных заболеваний, диабетов, эндометриоза, хронической астмы и особенно неопластических заболеваний (твердые опухоли, а также лейкемии и другие "жидкие опухоли", особенно опухоли, экспрессирующие c-kit, KDR, Flt-1 или Flt-3), таких как особенно рак груди, рак толстой кишки, рак легких (особенно рак легких малых клеток), рак простаты или саркома Капоши. Соединение формулы 1 (или его N-оксид) ингибирует рост опухолей и особенно полезно для предотвращения распространения метастаз опухолей и роста микрометастаз.

Соединение формулы 1 может вводиться отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, возможна комбинированная терапия в форме фиксированных комбинаций или введением соединения по изобретению и одного или нескольких терапевтических агентов последовательно или независимо друг от друга, или объединенным введением фиксированных комбинаций и одного или нескольких других терапевтических агентов. Соединение формулы 1 может, помимо этого, использоваться особенно при терапии рака, такой как терапия лейкемии, в комбинации с химиотерапией, радиотерапией, иммунотерапией, хирургическим вмешательством или их комбинацией. Длительная терапия также возможна в качестве вспомогательной терапии при других методиках лечения, как описано выше. Другими возможными лечениями являются терапия для поддержания состояния пациента во время роста опухоли или даже химиопредотвращающей терапии, например, у пациентов группы риска.

Терапевтическими агентами для возможной комбинации являются особенно одно или несколько антипролиферативных, цитостатических или цитотоксических соединений, например, химиотерапевтический агент или несколько агентов, выбранных из группы, включающей, но не ограничиваясь ими, ингибитор биосинтеза полиаминов, ингибитор протеинкиназы, особенно серин/треонин протеинкиназы, такой как протеинкиназа С, или тирозинпротеинкиназы, такой как тирозинкиназа EGF рецептора, например, PKI166, тирозинкиназы VEGF рецептора, например, РТК787, или тирозинкиназы PDGF рецептора, например, STI571, цитокин, регулятор отрицательного роста, такой как TGF-β или IFN-β, ингибитор ароматазы, например, летрозол или анастрозол, ингибитор взаимодействия SH2 домена с фосфорилированным белком, антиэстрогены, ингибиторы топоизомеразы I, такие как иринотекан, ингибиторы топоизомеразы II, микротубулярные активные агенты, например, паклитаксел, дискодермолид или эпотилон, алкилирующие агенты, антинеопластические антиметаболиты, такие как гемцитабин или капецитабин, платиновые соединения, такие как карбоплатин или цисплатин, антиангиогенные соединения, агонисты гонадорелина, антиандрогены, бисфосфонаты, например, AREDIA® или ZOMETA®, и трастузумаб. Предпочтительные терапевтические агенты для комбинации особенно предпочтительно выбраны из группы, включающей индарубицин, цитарабин, интерферон, гидроксимочевина и бисульфан. Структура активных агентов, обозначенных кодом nos., дженерики или товарные знаки могут быть взяты из текущего стандартного издания "The Merck Index" или из баз данных, например, Patents International (например, IMS World Publications). Их соответствующее содержание включено здесь в качестве ссылки.

Соединение по изобретению предназначено не только для (профилактического и предпочтительно терапевтического) введения людям, а также для лечения других теплокровных животных, например, промышленных животных, например, грызунов, таких как мыши, кролики или крысы, или морских свинок. Такие соединения могут также использоваться в качестве ссылочного стандарта в описанных выше тестовых системах для осуществления сравнения с другими соединениями.

Вообще изобретение также относится к применению соединения формулы 1 или его N-оксида для ингибирования активности тирозинкиназы, in vitro или in vivo.

Для групп предпочтительных соединений формулы 1 и их N-оксидов, упомянутых далее, могут использоваться определения заместителей из общих упомянутых ранее определений, например, для замены общих определений на более конкретные определения или особенно для определений, являющихся наиболее предпочтительными.

В частности, изобретение относится к соединениям формулы 1, где R₁ представляет собой водород и R₂ представляет собой NR₅R₆, или R₁ представляет собой NR₅R₆ и R₂ представляет собой водород;

R₃ представляет собой низший алкил, фторалкил, гидроксиалкил или карбамоил;

R₄ представляет собой низший алкил; и

R₅ и R₆ представляют собой, независимо друг от друга, водород, низший алкил, гидрокси-низший алкил, низший алкокси-низший алкил, низший асилокси-низший алкил, карбокси-низший алкил, низший алкоксикарбонил-низший алкил, амино-низший алкил, низший алкиламино-низший алкил, ди(низший алкил)амино-низший алкил, N-низший алкилпиперидинил, N-низший алкилпирролидинил, или низший ацил, или R₅R₆ вместе представляют собой алкилен с четырьмя, пятью или шестью атомами углерода, окса-низший алкилен с одним атомом кислорода и тремя или четырьмя атомами углерода, или азанизший алкилен с одним атомом азота и тремя или четырьмя атомами углерода, где атом азота является незамещенным или замещенным низшим алкилом, гидрокси-низшим алкилом или низшим алкокси-низшим алкилом, и где низший алкилен в каждом случае может быть частично или полностью ненасыщенным и/или атомы углерода низшего алкилена могут быть замещены низшим алкилом, гидрокси или низшим алкокси;

и к N-оксиду или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к соединениям формулы 1, где

R₁ представляет собой водород и R₂ представляет собой NR₅R₆, или R₁ представляет собой NR₅R₆ и R₂ представляет собой водород;

R₃ представляет собой трифторметил;

R₄ представляет собой метил; и

R₅ и R₆ представляют собой, независимо друг от друга, водород, низший алкил, гидрокси-низший алкил, низший алкокси-низший алкил, низший асилокси-низший алкил, карбокси-низший алкил, низший алкоксикарбонил-низший алкил, амино-низший алкил, низший алкиламино-низший алкил, ди(низший алкил)амино-низший алкил, N-низший алкилпиперидинил, N-низший алкилпирролидинил, или ацетил, или R₅R₆ вместе представляют собой алкилен с четырьмя, пятью или шестью атомами углерода, окса-низший алкилен с одним атомом кислорода и тремя или четырьмя атомами углерода, или азанизший алкилен с одним атомом азота и тремя или четырьмя атомами углерода, где атом азота является незамещенным или замещенным низшим алкилом, гидрокси-низшим алкилом или низшим алкокси-низшим алкилом, и где низший алкилен в каждом случае может быть частично или полностью ненасыщенным и/или атомы углерода низшего алкилена могут быть замещены низшим алкилом, гидрокси или низшим алкокси;

и N-оксиду или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к соединениям формулы 1, где

R₁ представляет собой водород и R₂ представляет собой NR₅R₆, или R₁ представляет собой NR₅R₆ и R₂ представляет собой водород;

R₃ представляет собой трифторметил;

R₄ представляет собой метил; и

R₅ и R₆ представляют собой, независимо друг от друга, водород, низший алкил, гидрокси-низший алкил, амино-низший алкил, низший алкиламино-низший алкил, ди(низший алкил)амино-низший алкил, N-низший алкилпиперидинил, или низший ацил, или R₅R₆ вместе представляют собой алкилен с четырьмя или пятью атомами углерода, окса-низший алкилен с одним атомом кислорода и тремя или четырьмя атомами углерода, или азанизший алкилен с одним атомом азота и тремя или четырьмя атомами углерода, где атом азота является незамещенным или замещенным низшим алкилом, гидрокси-низшим алкилом или низшим алкокси-низшим алкилом, и где низший алкилен в каждом случае может быть частично или полностью ненасыщенным и/или атомы углерода низшего алкилена могут быть замещены низшим алкилом;

и N-оксиду или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

Предпочтительными являются соединения формулы 1, где

R₁ представляет собой водород и R₂ представляет собой NR₅R₆, или R₁ представляет собой NR₅R₆ и R₂ представляет собой водород;

R₃ представляет собой трифторметил;

R₄ представляет собой метил; и

R₅ и R₆ представляют собой, независимо друг от друга, водород, низший алкил, ди(низший алкил)амино-низший алкил, N-низший алкилпиперидинил, или низший ацетил, или R₅R₆ вместе представляют собой алкилен с четырьмя или пятью атомами углерода, окса-низший алкилен с одним атомом кислорода и четырьмя атомами углерода, или азанизший алкилен с одним атомом азота и тремя или четырьмя атомами углерода, где атом азота является незамещенным или замещенным низшим алкилом, и где азанизший алкилен может быть ненасыщенным и/или атомы углерода азанизшего алкилена могут быть замещены низшим алкилом;

и N-оксид или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.

Особенно предпочтительными являются соединения формулы 1, где

R₁ представляет собой водород и R₂ представляет собой NR₅R₆, или R₁ представляет собой NR₅R₆ и R₂ представляет собой водород;

R₃ представляет собой трифторметил;

R₄ представляет собой метил; и

R₅ и R₆ представляют собой, независимо друг от друга, водород, метил, этил, 2-диметиламиноэтил, 4-метил-1-пиперидинил или ацетил, или NR₅R₆ вместе представляют собой пирролидино, пиперидино, морфолино, N-метилпиперазино, 1H-имидазолил, 1H-2-метилимидазолил, 1Н-4-метилимидазолил или 1Н-2,4-диметилимидазолил;

и N-оксид или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.

Особенно предпочтительными являются соединения, описанные в примерах.

Особенно настоящее изобретение относится к применению соединения формулы 1 или его N-оксида или возможного таутомера; или фармацевтически приемлемой соли такого соединения для изготовления фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое связано с ингибированием активности протеинкиназы, где заболевание представляет собой неопластическое заболевание.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы 1 или его N-оксида или возможного таутомера; или фармацевтически приемлемой соли