Белок

Белок

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым грибковым липолитическим ферментам и к одному или нескольким полинуклеотидам, кодирующим один или несколько новых грибковых липолитических ферментов. Настоящее изобретение также относится к способам получения грибковых липолитических ферментов и к их применению. Кроме того, настоящее изобретение относится к получению продуктов питания улучшенного качества, и, в частности, к получению хлебобулочных изделий улучшенного качества. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым грибковым липолитическим ферментам, которые способны придавать улучшенные качества пищевым продуктам, включая хлебобулочные изделия.

Предшествующий уровень техники

Многие годы известно липолитические ферментов (Е.С.3.1.1.х) успешно применяют в промышленном производстве пищевых продуктов или кормов.

Так, например, в патенте ЕР 0585988 было заявлено, что добавление липазы в тесто обеспечивает положительный эффект против черствения. Было высказано предположение, что липаза, полученная из Rhizopus arrhizus, при ее добавлении в тесто, может повышать качество выпеченного хлеба, если она используется в сочетании с шортенингом/жиром. В заявке WO94/04035 сообщается, что повышение мягкости хлеба может быть достигнуто путем добавления липазы в тесто без добавления в это тесто дополнительного количества жира/масла. В публикации Castello, P.ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsenki, было показано, что экзогенные липазы могут модифицировать объем хлеба.

Субстратом для липазы в пшеничной муке является 1,5-3% эндогенных липидов пшеницы, которые представляют собой комплексную смесь из полярных и неполярных липидов. Полярные липиды можно разделить на гликолипиды и фосфолипиды. Эти липиды состоят из глицерина, этерифицированного двумя жирными кислотами и полярной группой. Такая полярная группа придает поверхностную активность этим липидам. Ферментативное расщепление одной из таких жирных кислот в этих липидах позволяют получить липиды с гораздо более высокой поверхностной активностью. Хорошо известно, что эмульгаторы, такие как DАТЕМ с высокой поверхностной активностью, являются в высокой степени функциональными при их добавлении в тесто.

Липолитические ферменты гидролизуют одну или несколько жирных кислот липидов, присутствующих в пищевом продукте, что может приводить к образованию молекул, действующих как сильные эмульгаторы в пищевом продукте, который представляет коммерческую ценность. Молекулами, придающими наилучшие эмульгирующие свойства, являются продукты частичного гидролиза, такие как молекулы лизофосфолипидов, лизогликолипидов и моноглицеридов. Особенно предпочтительными являются продукты гидролиза полярных липидов, а именно, лизофосфолипиды и лизогликолипиды. При выпечке хлеба, такие in situ эмульгаторы могут обладать функциональными свойствами, эквивалентными свойствам добавленных эмульгаторов, таких как DATEM.

Однако было также обнаружено, что активность липолитических ферментов также приводит к накоплению свободных жирных кислот, что может негативно влиять на свойства пищевого продукта. Такая природная активность липолитических ферментов ограничивает их применение.

Негативное влияние этих ферментов на объем хлеба часть объясняют их передозировкой. Передозировка может приводить к снижению эластичности клейковины, которая приводит к получению слишком жесткого теста, а поэтому и к снижению объема. Дополнительно или альтернативно такие липазы могут разлагать шортенинг, масло или молочный жир, добавляемые в тесто, что придает тесту и хлебобулочному изделию не свойственный им привкус. Избыточные уровни фермента и привкус являются следствием накопления в тесте свободных жирных кислот, а в частности, короткоцепочечных жирных кислот.

Присутствие высоких уровней свободных жирных кислот (СЖК) в исходных продуктах или в готовых пищевых продуктах является, вообще говоря, дефектом качества, но обычно производители пищевых продуктов и заказчики включают в технические условия на пищевые продукты максимальные уровни СЖК. Избыточные уровни СЖК могут приводить к ухудшению органолептических и/или функциональных свойств.

В ЕР 1193314 авторами изобретения было обнаружено, что использование липолитических ферментов, активных по отношению к гликолипидам, дает особенно благоприятный эффект при выпечке хлеба, поскольку было установлено, что продукты частичного гидролиза, а именно лизогликолипиды, действуют как сильные эмульгаторы, что, очевидно, приводит к более высокому уровню позитивного функционального эффекта эмульгирования по сравнению с негативным накоплением свободных жирных кислот. Однако было также обнаружено, что ферменты обладают значительной неселективной активностью по отношению триглицеридам, что приводит к чрезмерно высокому уровню свободных жирных кислот.

Эта проблема, связанная с высокой активностью по отношению к триглицеридам, обсуждается в заявке WO 02/094123, авторами которой было обнаружено, что улучшение функциональных свойств может быть достигнуто путем выбора липолитических ферментов, являющихся активными по отношению к полярным липидам (гликолипидам и фосфолипидам), присутствующих в тесте, но, в основном, не активными по отношению к триглицеридам или 1-моноглицеридам.

Предпочтительным коммерчески доступными источниками липазных ферментов являются гифомицеты, такие как Aspergillus spp. и Fusarium spp. Было обнаружено, что липазы, выделенные из гифомицетов, обладают ценными с промышленной точки зрения свойствами, а также было обнаружено, что они является наиболее подходящими для экспрессии в системах гетерологичного продуцирования, таких как Aspergillus oryzae, Fusarium и дрожжи.

Липаза, выделенная из Fusarium oxysporum, была идентифицирована в ЕР 0130064, а в работе Hoshino et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56:660-664, было высказано предположение о возможном применении липаз F. oxysporum в пищевых продуктах.

В ЕР 0869167 описано клонирование и экспрессия липазы Fusarium oxysporum и ее применение в хлебопекарной промышленности. Этот фермент описан как обладающий фосфолипазной активностью. В настоящее время этот фермент имеется в продаже под торговым знаком как Lipopan F^TM Novozymes A/S (Denmark).

В WO 02/00852 описаны пять липазных ферментов и кодирующих эти ферменты полинуклеотидов, выделенных из F.venenatum, F.sulphureum, A. berkeleyanum, F. culmorum и F. solani. Все эти пять ферментов описаны как ферменты, обладающие триацилглицерин-гидролизующей активностью, фосфолипазной активностью и галактолипазной активностью. Из них, три фермента обладают активностью, эквивалентной активности фермента F. oxysporum, описанного в ЕР 0869167: F. venenantum, F. sulphureum, F. culmorum.

Кроме того, было обнаружено, что некоторые липазы Fusarium, включая Lipopan F^TM, обладают побочной активностью по отношению к полярным липидам, включая фосфолипиды и гликолипиды. Хотя в ЕР 0869167 было указано, что этот фермент обладает фосфолипазной активностью, однако, было установлено, что такой фермент Fusarium oxysporum обладает высокой липазной активностью. Этот фермент также обладает гликолипазной активностью. Однако, несмотря на значительную активность по отношению к полярным липидам, эффект, достигаемый с применением такого фермента, ограничен высокой липазной активностью (т.е. активностью по отношению к триглицеридам).

В публикации Nagao et al. (J. Biochem. 116(1994)536-540) описана липаза, выделенная из F.heterosporum, и такой фермент преимущественно функционирует как липаза (Е.С. 3.1.1.3), гидролизующая триглицериды. Этот фермент очень отличается от ферментов согласно изобретению.

Были получены варианты липолитических ферментов, имеющие специфические аминокислотные замены и вставки, некоторые из которых, по сравнению с исходными ферментами дикого типа, обладают повышенной активностью по отношению к полярным липидам. В WO 01/39602 описан такой вариант, обозначенный SP979, который представляет собой гибрид липазы Thermomyces lanuginosus и липазы Fusarium oxysporum, описанной в ЕР 0869167. Было обнаружено, что этот вариант обладает высоким отношением активности, направленной на фосфолипиды и гликолипиды, к активности, направленной на триглицериды.

Однако до подачи настоящей заявки, нигде не указывалось, что природные грибковые липолитические ферменты, а в частности, ферменты, происходящие от Fusarium spp., имеют высокое отношение активности, направленной на полярные липиды, к активности, направленной на триглицериды.

Описание сущности изобретения

В основном аспекте, настоящее изобретение относится к грибковому липолитическому ферменту, обладающему более высоким отношением активности, направленной на полярные липиды (фосфолипиды и/или гликолипиды) к активности, направленной на триглицериды, а в частности, более высоким отношением активности, направленной на гликолипиды, к активности, направленной на триглицериды.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к грибковому липолитическому ферменту дикого типа, имеющему более высокое отношение активности, направленной на полярные липиды (фосфолипиды и/или гликолипиды), к активности, направленной на триглицериды, а в частности, более высоким отношением активности, направленной на гликолипиды, к активности, направленной на триглицериды.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей новый грибковый липолитический фермент, описанный в настоящей заявке.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу приготовления пищевого продукта, предпочтительно, продуктов с добавлением яиц, где указанный способ предусматривает добавление грибкового липолитического фермента по изобретению к одному или нескольким ингредиентам пищевого продукта.

Настоящее изобретение относится к способу получения теста, где указанный способ предусматривает добавление грибкового липолитического фермента по изобретению к одному или нескольким ингредиентам теста и смешивание этих ингредиентов для приготовления теста.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу приготовления хлебобулочного изделия из теста, где указанный способ предусматривает добавление грибкового липолитического фермента по изобретению в указанное тесто.

Настоящее изобретение также относится к способу получения грибкового липолитического фермента по изобретению, где указанный способ предусматривает трансформацию клетки-хозяина рекомбинантной нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую грибковый липолитический фермент, и где указанная клетка-хозяин обладает способностью экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид грибкового липолитического фермента; культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, при которых экспрессируется указанная нуклеиновая кислота; и сбор полученного грибкового липолитического фермента.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к липолитическому ферменту, который сохраняет активность при низких температурах, то есть к низкотемпературному липолитическому ферменту.

Аспекты настоящего изобретения описаны в формуле изобретения и в нижеследующем описании.

Другие аспекты изобретения, относящиеся к нуклеотидным последовательностям, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают конструкцию, содержащую последовательности согласно изобретению; вектор, содержащий последовательности, используемые в настоящем изобретении; плазмиду, содержащую последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированную клетку, содержащую последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированную ткань, содержащую последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированный орган, содержащий последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированного хозяина, содержащего последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированный организм, содержащий последовательности, используемые в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также относится к способам экспрессии нуклеотидной последовательности, используемой в настоящем изобретении, например, экспрессии в клетке-хозяине, включая способы переноса этой последовательности. Настоящее изобретение также относится к способам выделения нуклеотидной последовательности, таким как выделение последовательности из клетки-хозяина.

Другие аспекты настоящего изобретения, относящиеся к аминокислотной последовательности, используемой в настоящем изобретении, включают конструкцию, содержащую аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении; вектор, кодирующий аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении; плазмиду, кодирующую аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированную клетку, экспрессирующую аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированную ткань, экспрессирующую аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированный орган, экспрессирующий аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированный хозяин, экспрессирующий аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении; трансформированный организм, экспрессирующий аминокислотные последовательности, используемые в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также охватывает способы очистки аминокислотной последовательности, используемой в настоящем изобретении с применением способа экспрессии этой последовательности, такой как экспрессия в клетке-хозяине, включая способы переноса этой последовательности с ее последующей очисткой.

Для лучшего понимания изобретения, эти и другие аспекты настоящего изобретения обсуждаются в настоящем описании в соответствующих разделах. Однако обсуждения, представленные в каждом разделе, не должны ограничиваться каким-либо конкретным разделом.

Подробное описание изобретения

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к грибковым липолитическим ферментам, имеющим более высокое отношение активности, направленной на полярные липиды, к активности, направленной на триглицериды.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к грибковым липолитическим ферментам, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной аминокислотной последовательности.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей грибковый липолитический фермент, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной аминокислотной последовательности.

SEQ ID NO:1 представлена на фиг.37, SEQ ID NO:2 представлена на фиг.38, SEQ ID NO:4 представлена на фиг.40, а SEQ ID NO:6 представлена на фиг.42.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей грибковый липолитический фермент, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из:

а) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7;

b) нуклеиновой кислоты, которая соответствует нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7 в соответствии с вырожденностью генетического кода; и

с) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7.

SEQ ID NO:3 представлена на фиг.39, SEQ ID NO:5 представлена на фиг.41, а SEQ ID NO:7 представлена на фиг.43.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению для приготовления пищевого продукта, такого как, например, тесто, хлебобулочные изделия, продукты с добавлением или основу которых составляют яица, макаронные изделия, сырные продукты, лепешки, корм для животных, растительное масло или пищевое масло. Добавление фермента по изобретению в пищевой продукт, преимущественно, приводит к улучшению эмульгирования с одновременным уменьшением содержания свободных жирных кислот.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению для приготовления теста и/или хлебобулочного изделия, где указанное применение включает добавление указанного липолитического фермента в тесто, и (необязательно) выпекание теста с получением хлебобулочного изделия, обладающего одним или несколькими свойствами, такими как: пониженная липкость теста: повышенная обрабатываемость теста; пониженный уровень вздутия во время выпекания хлебобулочного изделия; повышенный объем и/или мягкость хлеба; длительный срок хранения указанного хлебобулочного изделия и/или теста; повышенная устойчивость к черствению такого хлебобулочного изделия и/или теста; улучшенная структура мякиша такого хлебобулочного изделия; пониженная гетерогенность пор такого хлебобулочного изделия; повышенная гомогенность пор хлебобулочного изделия; уменьшенный средний размер пор хлебобулочного изделия; высокий глютеновый индекс теста; улучшенный вкус и/или запах хлебобулочного изделия, и более ярко выраженный цвет корочки такого хлебобулочного изделия.

В преимущественном варианте, фермент по изобретению может иметь более высокую активность, чем стандартные липофильные ферменты при низких рН, и таким образом, он может быть более подходящим для применения в кислом тесте с низким рН, чем стандартные липофильные ферменты.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения теста и/или хлебобулочного продукта, предусматривающему добавление в тесто грибкового липолитического фермента по изобретению и (необязательно) выпекание теста с получением хлебобулочного изделия.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению для приготовления продуктов с добавлением яиц в целях улучшения их консистенции, снижения среднего размера частиц, снижения среднего распределения частиц, повышения термостабильности и повышения производительности при выпечке в микроволновой печи, и/или повышения стабильности.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу обработки яиц или продуктов с добавлением яиц, где указанный способ предусматривает добавление к яйцам и яичным продуктам грибкового липолитического фермента согласно изобретению.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу приготовления лапши или теста для лапши, где указанный способ включает добавление в лапшу или в тесто для лапши или в продукт из лапши грибкового липолитического фермента по изобретению.

В одном из аспектов изобретения, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению в приготовлении лапши или макаронных изделий для улучшения их цвета/придания им желтизны, а также для стабилизации цветовых характеристик, снижения белизны, снижения содержания жира, улучшения консистенции и уменьшения нежелательного привкуса (при разжевывании), снижения смачивающей активности, повышения устойчивости к разлому, повышения плотности изделия и повышения способности к сохранению формы в процессе обработки.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу приготовления лепешек или теста для лепешек, где указанный способ предусматривает добавление в эту лепешку или в тесто для лепешек грибкового липолитического фермента по изобретению.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению для изготовления лепешек или теста для лепешек в целях улучшения раскатываемости лепешки, повышения ее пластичности, повышения устойчивости против черствения лепешки и/или теста для лепешек, повышения мягкости и/или устранения привкуса данной лепешки и/или теста для лепешек.

Функциональные свойства липолитического фермента в лепешках и/или в лапше могут быть улучшены благодаря использованию этого фермента в сочетании с эмульгаторами, такими как DАТЕМ.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу обработки молока, молока для сыроделия, сыра или сырного продукта, где указанный способ предусматривает добавление в сыр или сырный продукт грибкового липолитического фермента по изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению в изготовлении сыра или сырного продукта для придания этому продукту одного или нескольких свойств, а именно, для улучшения вкуса и консистенции продукта и/или повышения его стабильности, а также для повышения маслянистости сыра и/или увеличения выхода сыра в сыроделии.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу обработки корма для животных, где указанный способ предусматривает добавление в корм для животных грибкового липолитического фермента согласно изобретению.

Настоящее изобретение также относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению в изготовлении корма для животных в целях достижения одной или нескольких целей, а именно, повышения эффективности утилизации и/или переработки кормов, увеличения прироста массы тела, улучшения усвояемости азота, усиления метаболизма сухих веществ и улучшения их вкусовых качеств.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению в способе получения лизофосфолипида, например, лизолецитина путем обработки фосфолипида (например, лецитина) ферментом с продуцированием продукта частичного гидролиза, то есть лизофосфолипида.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения лизофосфолипида, например, лизолецитина, где указанный способ предусматривает обработку фосфолипида (например, лецитина) грибковым липолитическим ферментом по изобретению.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению в способе получения лизогликолипида (например, дигалактозилмоноглицерида (ДГМГ) или моногалактозилмоноглицерида (МГМГ)) путем обработки гликолипида (например, дигалактозилдиглицерида (ДГДГ) или моногалактозилдиглицерида (МГДГ)) липолитическим ферментом по изобретению с получением продукта частичного гидролиза, то есть, лизогликолипида.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения лизогликолипида (например, дигалактозилмоноглицерида (ДГМГ) или моногалактозилмоноглицерида (МГМГ)), где указанный способ предусматривает обработку гликолипида (например, дигалактозилдиглицерида (ДГДГ) или моногалактозилдиглицерида (МГДГ)) грибковым липолитическим ферментом по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу ферментативного рафинирования растительных или пищевых масел, предусматривающему обработку пищевого или растительного масла грибковым липолитическим ферментом по изобретению так, чтобы большая часть полярных липидов (например, фосфолипида и/или гликолипида) была гидролизована.

Для большей ясности, специалисту в данной области следует ознакомиться с соответствующей методикой проведения ферментативной обработки пищевых масел (см., например, ЕР0869167). При осуществлении настоящего изобретения может быть использован любой подходящий известный метод, при условии, что известный фермент будет заменен ферментом по изобретению.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента согласно изобретению для изготовления растительного или пищевого масла в целях снижения количества фосфолипида в растительном или пищевом масле при сохранении содержания триглицеридов в этом масле и/или в целях предотвращения или снижения накопления свободных жирных кислот.

В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению в способе, предусматривающем обработку фосфолипида в целях гидролиза ацильных групп жирных кислот.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению грибкового липолитического фермента по изобретению в способе снижения содержания фосфолипида в пищевом масле, где указанный способ предусматривает обработку указанного масла грибковым липолитическим ферментом по изобретению в целях гидролиза большей части фосфолипида, и удаление из этого масла водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к липолитическому ферменту, сохраняющему активность при низких температурах, то есть к низкотемпературному ферменту. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к применению низкотемпературного фермента, а именно грибкового липолитического фермента согласно изобретению, в описанных здесь способах.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению имеет более высокое отношение активности, направленной на полярные липиды (например, гликолипидов и/или фосфолипидов), по сравнению с активностью, направленной на триглицериды.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению имеет более высокое отношение фосфолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению имеет более высокое отношение гликолипид-гидролизующей активности по сравнению с триглицерид-гидролизующей активностью.

В соответствии с этим грибковый липолитический фермент по изобретению может иметь более высокое отношение гликолипид- и фосфолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности.

Более предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению имеет более высокое отношение дигалоктозилдиглицерид (ДГДГ)-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению гидролизует ДГДГ или МГДГ с образованием ДГМГ или МГМГ, соответственно.

Используемый здесь термин “более высокое отношение активности, направленной на полярные липиды” означает, что грибковый липолитический фермент по изобретению имеет более высокое отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности, чем коммерчески доступный фермент Lipopan F^TM (Novozymes A/S, Denmark).

Используемый здесь термин “полярные липиды” означает фосфолипиды и/или гликолипиды. Используемый здесь термин “полярные липиды”, предпочтительно, означает как фосфолипиды, так и гликолипиды.

Используемый здесь термин “более высокое отношение активности, направленной на гликолипиды” или “более высокое отношение активности, направленной на фосфолипиды” означает, что грибковый липолитический фермент по изобретению имеет более высокое отношение гликолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности, соответственно, чем коммерчески доступный фермент Lipopan F^TM (Novozymes A/S, Denmark).

Предпочтительно, липолитический фермент по изобретению может иметь отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности, равное, по меньшей мере 4. В основном, отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности может составлять более 5. В основном, отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности может составлять более 8, предпочтительно, более 9, более предпочтительно, более 10, а еще более предпочтительно, более 15.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению может иметь отношение фосфолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности, равное, по меньшей мере 4. В основном, отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности, может составлять более 5. В основном, отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности может составлять более 8, предпочтительно, более 9, более предпочтительно, более 10, а еще более предпочтительно, более 15.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению может иметь отношение гликолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности, равное, по меньшей мере, 1,5, предпочтительно, по меньшей мере, 1,8, предпочтительно, по меньшей мере, 2, предпочтительно, по меньшей мере, 3, а предпочтительно, по меньшей мере, 4. В основном, отношение гликолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности, может составлять более 4. В основном, отношение гликолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности, может составлять более 5.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к грибковому липолитическому ферменту, имеющему отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности, равное, по меньшей мере, 4. В основном, отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности может составлять более 5. В основном, отношение отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности может составлять более 8, предпочтительно, более 9, более предпочтительно, более 10, а еще более предпочтительно, более 15.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к грибковому липолитическому ферменту, имеющему отношение фосфолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности, равное, по меньшей мере, 4. В основном, отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности может составлять более 5. В основном, отношение активности, направленной на гидролиз полярного липида, к триглицерид-гидролизующей активности может составлять более 8, предпочтительно, более 9, более предпочтительно, более 10, а еще более предпочтительно, более 15.

В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к грибковому липолитическому ферменту, имеющему отношение гликолипид-гидролизующей активности к триглицерид-гидролизующей активности, активностей, равное, по меньшей мере, 1,5, предпочтительно, по меньшей мере, 1,8, предпочтительно, по меньшей мере, 2, предпочтительно, по меньшей мере, 3, а предпочтительно, по меньшей мере, 4, предпочтительно, более 5, предпочтительно, более 10 и предпочтительно, более 15.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению имеет в 1,5 раза, а предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза, более предпочтительно, по меньшей мере, в 3 раза, а еще более предпочтительно, по меньшей мере, в 4 раза большую активность по отношению к полярным липидам (например, фосфолипазную А2 (Е.С. 3.1.1.4) активность и/или фосфолипазную А1 (Е.С. 3.1.1.32) активность и/или гликолипазную (Е.С. 3.1.1.26) активность) по сравнению с триглицерид-липазной (Е.С. 3.1.1.3) активностью.

Предпочтительно, грибковый липолитический фермент по изобретению имеет в 1,5 раза, а предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза, более предпочтительно, по меньшей мере, в 3 раза, а еще более предпочтительно, по меньшей мере, в 4 раза большую гликолипазную (Е.С. 3.1.1.26) активность по сравнению с триглицерид-липазной (Е.С. 3.1.1.3) активностью.

При дозе, которая дает оптимальный объем хлеба, как было определено в анализе на выпечку в лабораторном масштабе, подробно описанном в примере 3, отношение ДГДГ-гидролизующей активности к триглицерид (ТГ)-гидролизующей активности, предпочтительно, составляет по меньшей мере 1,7%, предпочтительно по меньшей мере 1,8%, предпочтительно по меньшей мере 2%, предпочтительно по меньшей мере 3%, предпочтительно по меньшей мере 4%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, предпочтительно, по меньшей мере 10%, предпочтительно, по меньшей мере 20%, предпочтительно, по меньшей мере 40%, а более предпочтительно, по меньшей мере 50%.

Используемый здесь термин “гликолипазная активность” охватывает “галактолипазную активность”.

Гликолипазная активность, фосфолипазная активность и триацилглицерид-липазная активность фермента могут быть определены в анализах, представленных ниже.

Определение галактолипазной активности (анализ на гликолипазную активность)

Субстрат:

0,6% дигалактозилдиглицерид (Sigma D 4651), 0,4% Тритона-Х 100 (Sigma X-100) и 5 мМ СаCl₂ растворяют в 0,05М буфере HEPES при рН 7.

Процедура анализа:

400 мкл субстрата добавляют в 1,5 мл-пробирку Eppendorf и помещают в термомиксер Eppendorf на 5 минут при 37°С. В момент времени t=0 минут добавляют 50 мкл раствора фермента. В качестве контроля, вместо фермента использовали воду. Образец смешивали при 10 × 100 об/мин в термомиксере Eppendorf при 37°С в течение 10 минут. Через 10 минут пробирку Eppendorf помещают на 10 минут в другой термомиксер при 99°С для прекращения реакции.

Свободную жирную кислоту в образцах анализировали с использованием набора NEFA C, поставляемого WAKO GmbH.

Ферментативную активность GLU при рН 7 выражают в микромолях жирной кислоты, полученной за 1 минуту в условиях анализа.

Определение фосфолипазной активности (анализ на фосфолипазную активность)

Фосфолипазную активность измеряли двумя различными методами, которые давали сравнимые результаты. В соответствии с настоящим изобретением, для определения фосфолипазной активности может быть использован любой из этих методов. Для определения фосфолипазной активности любого фермента, предпочтительно, проводить анализ на PLU.

“Анализ на PLU-” для определения фосфолипазной активности

Субстрат:

0,6% L-α-фосфатидилхолин, 95% растительного экстракта (Avanti #441601), 0,4% Triton-Х 100 (Sigma X-100) и 5 мМ СаCl₂ растворяют в 0,05М буфере HEPES при рН 7.

Процедура анализа:

400 мкл субстрата добавляли в 1,5 мл-пробирку Eppendorf и помещают на 5 минут в термомиксер Eppendorf при 37°С. На время t=0 минут добавляли 50 мкл раствора фермента. В качестве контроля, вместо фермента используют воду. Образец смешивают при 10 × 100 об/мин в термомиксере Eppendorf при 37°С в течение 10 минут. Через 10 минут пробирку Eppendorf помещают в другой термомиксер на 10 минут при 99°С для прекращения реакции.

Свободную жирную кислоту в образцах анализируют с использованием набора NEFA C, поставляемого WAKO GmbH.

Ферментативную активность PLU-7 при рН 7 выражают в микромолях жирной кислоты, продуцированной за 1 минуту в условиях анализа.

“Анализ на TIPU” для определения фосфолипазной активности

1 TIPU (титрационную единицу фосфолипазной активности) определяют как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль свободной жирной кислоты в одну минуту в условиях данного анализа.

Фосфолипазы А1 и А2 катализируют превращение лецитина в лизолецитин с высвобождением свободной жирной кислоты из положения 1 и 2, соответственно. Фосфолипазная активность может быть определена путем непрерывного титрования жирных кислот, высвобождаемых из лецитина в процессе ферментации, поскольку количество поглощаемой щелочи равно количеству высвобождаемой жирной кислоты.

Субстрат:

4% лецитин, 4% Triton-Х 100 и 6 мМ СаCl₂: 12 г лецитинового порошка (полярные липиды Avanti # 44160) и 12 г Triton-Х 100 (Merck 108643) диспергируют приблизительно в 200 мл деминерализованной воды при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Затем добавляют 3,0 мл 0,6 М СаCl₂ (р.а. Merck 1.02382). Объем доводят до 300 мл добавлением деминерализованной воды и эмульсию гомогенизируют с помощью устройства Ultra Thurax. Этот субстрат получают в свежем виде каждый день.

Процедура анализа:

Раствор фермента приготавливают с добавлением 300 мкл фермента и полу