Мультиэнзимная композиция для животноводства

Мультиэнзимная композиция для животноводства

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к разработке биотехнологической продукции - мультиэнзимной композиции (МЭК), предназначенной для использования в технологии производства комбикормов для с/х животных и птицы.

Отечественный и мировой опыт ведения животноводства убедительно свидетельствует, что полноценное кормление - это основа для проявления генетического потенциала продуктивности животных и эффективной трансформации питательных веществ корма в продукцию. Доказано, например, что наиболее полно свой генетический потенциал птица реализует на рационах, основу которых составляют кукуруза как источник обменной энергии и соевый шрот как наиболее сбалансированный по аминокислотам источник растительного протеина.

В настоящее время потребность кормопроизводства в белковых кормах удовлетворяется только на 45-50%. Это является главным фактором, лимитирующим рост производства продукции животноводства и птицеводства. В последние годы для решения проблемы кормового белка в кормлении с/х животных и птицы широко используют шроты белково-масличных культур - подсолнечника, сои, рапса и других.

Несмотря на высокую биологическую ценность растительных белковых кормов наличие «антипитательных» и ингибирующих факторов сдерживает их широкое применение. Зерно сои, например, уникально по содержанию питательных веществ, но продукты ее переработки, наряду с высоким содержанием белка (35-51%) и других ценных компонентов, содержат ядовитый белок соин, ингибиторы протеаз, трудногидролизуемые олигосахариды, факторы развития рахита, микотоксины, гемагглютинины и др. [1]. Соевый шрот рекомендовано контролировать также по активности уреазы, поскольку это связано с ингибитором трипсина, наличие которого оценивают по активности уреазы [2].

Для России в качестве источника кормового белка особое значение имеет подсолнечник и продукты его переработки, так как по объемам производства этой культуры наша страна занимает второе место в мире и их стоимость значительно ниже стоимости сои и соевых шротов. Содержание протеина в подсолнечном шроте (жмыхе) составляет 25-43% при пониженном уровне лизина и обменной энергии. По сравнению с соевым шротом в подсолнечном содержится большее количество некрахмальных полисахаридов (до 30%), таких как арабиноксиланы, пектины различной степени метоксилирования, олигосахариды, а также танины и др., которые отрицательно влияют на использование питательных веществ [1, 3]. Подсолнечный шрот содержит некрахмальные полисахариды сложной структуры (НПС), состоящей на 42% из целлюлозы, 24% из пектиновых соединений, 24% из 4-O-метилглюкуроно-ксиланов, 5% из глюкоманнанов и на 4,5% из фукоксилоглюканов [4]. К факторам, ограничивающим потребление подсолнечного шрота, относят хлорогеновую кислоту, уровень которой в нем не должен превышать 1%, так как повышенное содержание ее вызывает ингибирование пищеварительных ферментов (трипсина и липазы), а также снижение доступности метионина [2, 1]. Ограничение в применении имеют и другие белковые корма растительного происхождения, содержащие "антипитательные" факторы. Поэтому в рацион вводят подсолнечный жмых/шрот в количестве 7-10% для молодняка и 15-20% - для взрослой птицы, для молодняка и откорма свиней - 10-15%, для жвачных животных разных возрастных групп - 10-25 % [2, 3, 5].

Таким образом, дефицит кормового белка, сдерживающий развитие животноводства и птицеводства, диктует необходимость разработки способов повышения эффективности использования растительных белковых кормов за счет снижения или устранения присутствующих в них "антипитательных" и ингибирующих факторов с целью повышения норм ввода их в комбикормовую продукцию.

Известны способы предобработки растительного белкового сырья с целью устранения "антипитательных" факторов - замачивание, гидротермическая обработка, термообработка, инфракрасное облучение и др. Однако неусвояемые олигосахариды являются термостабильными соединениями и практически не разрушаются в результате применения различных видов технологических воздействий. Повышенное содержание ингибитора трипсина в белковом сырье (даже после термообработок) приводит к снижению активности эндогенных ферментов и ограничивает доступ метионина и цистина [1].

Учитывая специфичность состава некрахмальных полисахаридов (НПС) белкового сырья растительного происхождения, наличие в нем ингибиторов пищеварительных ферментов белковой и небелковой природы, неусвояемых олигосахаридов, а также ряда других негативных факторов (танины, лектины и др.), особое внимание было уделено комплексному подходу к решению проблемы повышения питательной ценности этого сырья. К наиболее эффективным и экономически целесообразным способам многофункционального воздействия на сложное по составу растительное сырье относится ферментативная обработка, при условии создания многокомпонентной системы ферментов целевого назначения. Эта композиция должна содержать определенный состав и соотношение ферментов, направленных на разрушение "антипитательных" веществ.

Для решения поставленной задачи было уделено внимание рассмотрению и отбору научно-технических материалов и патентных источников, характеризующих состояние проблемы.

Известны ферментные препараты фирмы БАСФ (Германия) - Натугрейн, Натугрейн Бленд и др. (Натуфос - 5000, Натуфос - 5000 G, Натуфос - 10000 G и Натуфос - 5000 L, которые содержат разный уровень фитазы) [6]. Препараты предназначены для рационов, содержащих преимущественно растительные (зерновые и белковые) компоненты. Особый интерес представляет комплексный ферментный препарат Натугрейн Бленд, который содержит сопутствующие ферменты - целлюлазу, гемицеллюлазы и протеазу. Необходимо отметить, что уровень ксиланазы в нем значительно превышает все известные препараты, содержащие этот фермент. По экспериментальным данным авторов заявляемого решения содержание ксиланазы (КсА) в препарате составляет 25000 ед./г (по действующей в РФ НТД), поэтому объяснимо, что он и рекомендован к использованию в составе пшенично-ячменных рационов, в том числе содержащих растительные белковые корма, для с/х птицы и свиней в дозе 80-100 г/т корма. Например, положительные результаты получены в опытах при включении в комбикорма 20% гороха. Продуктивность опытных цыплят повысилась по сравнению с контрольным вариантом на 3,1%, а затраты корма снизились на 4,2% [7]. Однако следует отметить, что при очень высокой активности КсА в препарате уровень сопутствующих ферментов достаточно низкий, особенно целлюлазы (ЦлА=245 ед./г), и введение его в дозе 0,1 кг/т не обеспечивает достаточного уровня этих ферментов в кормах в расчете на единицу сырья.

Известны ферментные препараты фирмы "Адиссео" (Франция) - Ровабио^TM Эксель, Ровабио Макс, Ровабио Бленд, предназначенные для использования в комбикормах разной зерновой основы с включением белковых растительных кормов (шроты, жмыхи, горох, люпин и др.). Наиболее широкие испытания в рационах с/х животных и птицы проведены с использованием препарата Ровабио^TM Эксель, содержащего ксиланазу (ведущий фермент), а также сопутствующие - β-глюканазу, целлюлазу, комплекс пектиназ, протеазы и другие, которые не регламентируются производителем. По данным фирмы и других исследователей комбинация ферментов, входящих в состав Ровабио, эффективно разрушает антипитательные вещества кормов и повышает уровень их обменной энергии (ОЭ) на 7-10%. В ряде опытов, проведенных с использованием Ровабио (50 г/т), показана эффективность применения его в кормлении бройлеров и кур-несушек: цыплята, получавшие рационы с повышенным содержанием ржи (до 50% со старта), подсолнечного шрота (до 25% со старта), не отличались по привесам и сохранности от контрольных групп, а продуктивность кур-несушек при вводе в их рацион отрубей - до 60%, овса - 40%, травяной муки - 25%, ржи - 35% - не снижалась. Аналогичные положительные результаты получены в рационах цыплят-бройлеров при выращивании их на комбикормах, содержащих до 30% подсолнечного жмыха (взамен рыбной муки и соевого шрота), и в рационах кур-несушек с включением 25% подсолнечного жмыха (взамен кукурузного глютена, рыбной муки и соевого шрота) [8-14].

ЗАО Биотехнологическая компания Восток разработала препараты Мультизимы Я, П и У, предназначенные для использования в рационах с/х животных и птицы, содержащих комбикорма разной зерновой основы, в том числе с повышенным введением жмыхов и шротов. В состав препаратов входят ферменты β-глюканаза, пектинлиаза, ксиланаза и протеаза [15-17]. Пектиназа мацерирующего действия (пектинлиаза) способствует разрушению низкометоксилированных пектинов, а также протопектина, но в меньшей степени влияет на деградацию пектиновых структур с повышенным содержанием метильных групп. Кроме того, по мнению авторов, из-за отсутствия α-галактозидазы, действующей на трудногидролизуемые олигосахариды сырья, поскольку только в соевом шроте наличие α-галактозидов составляет 50% от общего уровня некрахмальных полисахаридов (20%) [18], препараты не могут в полной мере решить проблему устранения основных "антипитательных" факторов используемых белковых кормов.

В последние годы появилась тенденция к совместному использованию ферментных препаратов, антибиотиков, пробиотиков, витаминов, окислителей, органических кислот и т.д., что, по данным исследователей, позволяет повысить эффективность их применения в рационах с/х животных и птицы [19-27].

Запатентована мультиэнзимная добавка для ферментативной обработки зерновых кормов - ржи и зерносмесей с содержанием 50% и более ржи, содержащая мультиэнзимную композицию МЭК-СХ-2 - 30%, Протосубтилин - 5% и солод ячменный - 65%, а для обработки ржаных отрубей добавка содержит: МЭК-СХ-2 - 40%, Протосубтилин - 5%, солод ячменный - 55%. Использование мультиэнзимной добавки в дозе 0,1% от воздушно-сухого вещества зернофуража повышает сумму сахаров в готовом корме до 300 г/кг и более, при низкой вязкости [28].

Установлено, что благодаря ферментному препарату Бацелл (производство Краснодарского биоцентра), который содержит целлюлазу, β-глюканазу, пектиназу + пробиотик, можно удешевить стоимость комбикормов за счет использования подсолнечного шрота (30%) в качестве единственного источника белкового корма, но при условии дополнительного введения лизина и растительного масла [19].

На рынке присутствует отечественный ферментный препарат Целло-Люкс-Ф (ранее Целловиридин - В Г20х), содержащий целлюлазу, ксиланазу, а также β-глюканазу и рекомендованный для использования в комбикормах, в том числе с включением белковых кормов растительного происхождения. Использование препарата (100 г/т) в комбикормах, содержащих 20% подсолнечного жмыха, 20-30% нешелушеного ячменя и 5-6% спиртовой барды, позволяет нивелировать отрицательное действие указанных компонентов, повысить продуктивность бройлеров и снизить затраты корма на ед. продукции на 8,7%. Отсутствие в препарате специфических ферментов, разрушающих α-галактозиды, ингибиторы трипсина, некоторые пектиновые вещества, по мнению авторов, не позволяет получать более значительный эффект. Комплексное использование препарата с Бациллихином оказалось более эффективным - 10,1% и 9,7% соответственно [21]. Проведены испытания препарата в сравнении с зарубежными препаратами аналогичного назначения (Ровабио, Роксазим G2 отдельно и в комплексе с Бациллихином) в рационах цыплят-бройлеров на фоне комбикормов разной зерновой основы (ячмень, рожь), содержащих белковые корма (горох - 20%, шрот подсолнечный - 20-30%). Установлено, что эффективность испытанных препаратов оказалась практически одинаковой [25].

Известен мультиэнзимный комплекс Экозим^TM (Голландия), содержащий эндоксиланазу, целлюлазу, β-глюканазу и предназначенный для комбикормов с повышенным уровнем НПС как зернового сырья (рожь, ячмень, овес, отруби, пшеница и т.д.), так и растительных белковых кормов - подсолнечный шрот/жмых, рапсовый жмых и т.д. (500-1000 г/т) [29].

Группа компаний Арсенал Гольджи представляет на российском рынке серию ферментных препаратов КСИБЕТЕН (торговая марка АД "БиоВет", Болгария). Ферментный препарат КСИБЕТЕН-ЦЕЛ (50-100 г/т) аналогичен хорошо известному препарату Целловиридин Г 20х, но, по данным фирмы, качественно отличается от него. Препарат КСИБЕТЕН-КСИЛ (75-200 г/т) характеризуется высокой ксиланазной активностью и содержит также целлюлазу и β-глюканазу. Препараты рекомендованы для использования в комбикормах разной зерновой основы (преимущественно ячмень, рожь, пшеница) с включением трудногидролизуемых компонентов, в том числе шротов и жмыхов [16, 30].

Датская фирма "Новозаймс" предлагает широкий ассортимент ферментных препаратов (Ронозим VX СТ, Ронозим VP СТ, Ронозим Р 5000 СТ, Ронозим Р и др.), предназначенных для включения в комбикорма, содержащие растительные белковые корма, в том числе бобовые культуры, шроты и жмыхи [31]. Из предлагаемых препаратов наиболее распространен Ронозим VP СТ, который содержит ведущий фермент β-глюканазу, высокий уровень пектиназы, а также ксиланазу и целлюлазу. Препарат применяется для повышения качества кормов (норма ввода 250-400 г/т) при включении в рацион моногастричных животных подсолнечного, или соевого, или рапсового шрота - до 30% [31].

Известны ферментные препараты производства Бельгии: Белфид Б (ксиланаза бактериальная) и Белфид Бета (β-глюканаза), которые рекомендованы к введению в комбикорма ячменно-пшеничной или пшенично-ячменной основы с добавлением подсолнечного шрота/жмыха. Испытания препарата Белфид Бета в рационах бройлеров на фоне ячменных рационов (15 и 40% нешелушеного ячменя по периодам выращивания) с добавлением 25% подсолнечного шрота показали, что живая масса цыплят на 1% превышает контроль (по нормам ВНИТИП) при более низких затратах на единицу продукции, при этом стоимость рациона снизилась на 14,0-15,5% [32]. Однако, по мнению авторов, отсутствие специфических ферментов, устраняющих "антипитательные" факторы подсолнечного шрота, не позволило получить более высокие результаты.

Известны ферментные препараты торговой марки Вильзим (АО "Биосинтезе", Литва) - Вильзим MR, MK и др., содержащие разный уровень активности ксиланазы, β-глюканазы, целлюлазы, амилазы, протеазы, и препарат MKF (с включением фитазы), предназначенные для комбикормов разной зерновой основы (ячмень, рожь, пшеница и др.), в том числе содержащих источники белковых кормов растительного происхождения. В частности, Вильзим MR, рекомендованный для пшенично-ржаных комбикормов с добавлением соевого, подсолнечного шротов и рапсового жмыха, характеризуется комплексом следующих ферментов: КсА - 1800 ед./г, ЦлА - 11-14 ед. (МЕ)/г, AC - 100 ед./г, β-ГлА - 1200-1300 ед./г, ПС - 1-2 ед./г. По материалам фирмы использование препаратов Вильзим повышает усвоение ОЭ на 4-10%, протеина и аминокислот - на 2-6%, улучшает микроклимат ферм и птичников и снижает себестоимость продукции на 3-6% [33].

Запатентован способ кормления кур, предусматривающий использование комбикормов на основе трудногидролизуемых компонентов, например, пшенично-ячменного типа, с добавлением подсолнечного шрота и мультиэнзимной композиции МЭК-СХ-3. При этом препарат добавляют в корм через день с начала яйцекладки и до конца продуктивного периода, в количестве 0,25-0,40% кг/т корма. Установлено, что переваримость сухого вещества корма повышается с 68% в контроле до 73-74% в опытном варианте. При этом яйценоскость птицы увеличивается на 3,4% [34].

Американская фирма "Оллтек" представляет на российском рынке группу ферментных препаратов для разных типов рационов, используемых в кормлении с/х животных и птицы. Среди них - Оллзайм ПТ, Оллзайм БГ, Оллзайм ФПД, Оллзайм Фитаза и Оллзайм Вегпро. Особую актуальность при проведении испытаний приобрел мультиэнзимный комплекс Оллзайм Вегпро, предназначенный для разрушения "антипитательных" веществ и усвояемости протеина и углеводов в белковых кормах растительного происхождения (бобовые культуры, жмыхи и шроты). По информации фирмы [35] препарат содержит комплекс ферментов - протеазу, целлюлазу, пентозаназу (ксиланазу), β-глюканазу и амилазу. Использование препарата является особенно эффективным в первые 20 дней жизни молодой птицы. Широкие испытания Оллзайм Вегпро проведены в рационах цыплят - бройлеров, кур-несушек промышленного стада, утят и др., которые показали, что его применение в количестве 1 кг/т повышает уровень ОЭ бобовых кормов и подсолнечника на 7-12%, усвояемость протеина и доступность аминокислот на 7-12% и, как следствие, способствует повышению питательной ценности шротов. В опытах было установлено, что с использованием Оллзайм Вегпро в комбикормах уровень подсолнечного шрота можно повысить до 30% без отрицательного влияния на продуктивность птицы [35, 36, 18, 39, 40, 23, 7].

Анализируя представленные материалы, следует отметить, что в них четко прослеживается тенденция применения уже известных, а также новых ферментных препаратов, преимущественно зарубежных, для решения существующей проблемы повышения эффективности использования белковых кормов растительного происхождения с целью увеличения норм их ввода в комбикормовую продукцию. Как правило, при характеристике препаратов зарубежного производства приводят только перечень отдельных ферментов, содержащихся в препаратах, и, в исключительных случаях, указывают количественное значение активностей ферментов, определенных по методикам фирм-производителей. По этой причине сравнительный анализ рекомендуемых ферментных препаратов для указанных целей не представляется возможным. Учитывая тот факт, что зарубежные препараты стандартизуют, в большинстве случаев, по активности одного фермента, наличие которого стабильно гарантировано в комбикорме, а уровень активностей сопутствующих ферментов при этом значительно различается в разных партиях одного и того же препарата при постоянном значении основного фермента, присутствие их в комбикормах может изменяться в значительных пределах.

Таким образом, многие ферментные препараты, предлагаемые на российском рынке для указанной цели, не в полной мере отвечают поставленной задаче, поскольку зачастую не содержат необходимого набора ферментных систем, способных эффективно устранять сложные трудногидролизуемые соединения белкового растительного сырья, наличие которых и определяет его "антипитательные" свойства. В препаратах, в основном, присутствуют ферменты, разрушающие НПС (целлюлоза, гемицеллюлозы и их производные), и практически отсутствуют ферменты (α-галактозидазы, эндополигалактуроназы, специфические протеазы), активно действующие на неусвояемые олигосахариды, а также ингибиторы протеаз, сложные пектиновые соединения и др. Так, препарат Ронозим VP СТ, рекомендованный для рационов, содержащих до 30% шрота - соевого, подсолнечного или рапсового, стандартизуют по β-глюканазе, а в качестве сопутствующих ферментов присутствуют эндополигалактуроназа, целлюлаза и ксиланаза. Уровни сопутствующих ферментов не могут быть гарантированы в препарате в постоянно одинаковых значениях, так как не регламентируются производителем. Это, в свою очередь, не может гарантировать их наличие и в комбикормах в постоянных значениях и, соответственно, обеспечить получение стабильных результатов на всех типах рационов, отличающихся разной структурой и составом компонентов, и, прежде всего, растительных белковых кормов.

Как указано ранее, мультиэнзимный комплекс фирмы "Оллтек", США - Оллзайм Вегпро предназначен для использования в комбикормах с включением повышенного уровня белковых кормов растительного происхождения (шроты, жмыхи, горох, люпин и др.). По информации фирмы в его состав входят: протеаза, а также целлюлаза, пентозаназа (ксиланаза), β-глюканаза и амилаза [35]. В рекламных материалах "Оллзаймы" этой же фирмы [36] при характеристике препарата Оллзайм Вегпро указано, что он содержит также фермент α-галактозидазу. В связи с этим в обзорной статье В. Кузьминой упоминается о наличии в этом препарате α-галактозидазы. Однако при определении активностей ферментов (по действующей в РФ НТД) трех образцов препарата Оллзайм Вегпро, полученных из разных источников, установлено, что при величинах активности протеазы (ПС) от 58 до 8 ед./г уровень целлюлазы (ЦлА) находится в пределах от 34 до 59 ед./г, ксиланазы (КсА) - от 70 до 160 ед./г, наличие α-галактозидазы не обнаружено. Но, ввиду широкого распространения препарата и полученных положительных результатов в опытах при испытаниях [37, 38, 39, 40, 18, 7], Оллзайм Вегпро выбран в качестве ближайшего аналога к заявляемой мультиэнзимной композиции. Кроме того, следует отметить, что и в рекламных материалах фирмы, и в опубликованных работах по эффективности использования Оллзайм Вегпро отсутствует информация о количественных значениях активностей ферментов, а полученные экспериментальные данные свидетельствуют о значительном разбросе этих величин, а также отсутствии фермента α-галактозидазы. С учетом изложенного, не представляется возможным определить соотношение ферментов в мультиэнзимном комплексе, и, в связи с этим, выбранный в качестве ближайшего аналога препарат Оллзайм Вегпро оценивали по наличию комплекса ферментов. Поэтому в настоящих материалах приведены сравнительные результаты по эффективности действия разработанной мультиэнзимной композиции и комплекса ферментов Оллзайм Вегпро на выбранные модели белкового растительного сырья.

Техническая задача, решаемая посредством реализации предлагаемой МЭК, состоит в повышении питательной и биологической ценности растительных белковых кормов за счет устранения их "антипитательных" и негативных факторов.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемой МЭК, состоит в обеспечении кормопроизводства растительными белковыми кормами высокого качества и повышении норм их ввода в комбикормовую продукцию, что будет способствовать снижению дефицита белка для животноводства.

Для достижения указанного технического результата предложена мультиэнзимная композиция на основе ферментов, контролируемых по единицам активности целлюлазы, ксиланазы, эндополигалактуроназы и α-галактозидазы, многокомпонентная система которой обеспечит оптимальный гидролиз сложных полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлоз, пектиновых соединений и др.), а также трудногидролизуемых олигосахаридов и ингибиторов трипсина.

Для устранения недостатков ближайшего аналога по набору ферментов в мультиэнзимную композицию, наряду с известными ферментами, дополнительно введены эндополигалактуроназа и α-галактозидаза, при соотношении единиц активностей контролируемых ферментов эндополигалактуроназы, ксиланазы и целлюлазы 1:(1,50-3,75):(0,30-0,75), а соотношение единиц активностей α-галактозидазы, ксиланазы и целлюлазы при этом составляет 1:(17,00-42,00):(3,50-8,50).

Характеристика белкового растительного сырья, предназначенного для ферментативной обработки, представлена в таблица 1.

Характеристика основных компонентов сырья была выполнена по действующей документации, количественное определение олигосахаридов вели с использованием высокоэффективного метода газожидкостной хроматографии, определение ингибиторов трипсина проводили модифицированным методом Эрлангера и др., с учетом методических рекомендаций фирмы Sigma - Aldrich Enzyme Explorer.

Таблица 1
Характеристика растительного белкового сырья
Наименование сырья	Содержание углеводов, %, с. в.	Содержание сырого протеина, %	Содержание ингибитора трипсина, мг/г
НПС	клетчатка	олигосахариды
всего	в том числе
сахароза	стахиоза	рафиноза
Шрот соевый	18,0	9,5	13,20	7,10	4,40	0,89	47,0	11,89
Шрот подсолнечный	28,0	17,3	7,40	3,70	следы	3,30	35,0	2,14

Для реализации заявляемого решения и с учетом того, что в ближайшем аналоге отсутствуют ферменты эндополигалактуроназа и α-галактозидаза, был проведен скрининг различных ферментных систем по выбору необходимых ферментов, в первую очередь указанных, для создания многокомпонентной системы целевого назначения, способствующих разрушению "антипитательных" факторов белкового растительного сырья (таблица 2).

Известно, что микробные ферментные препараты являются "комплексными", в которых, помимо основного фермента, присутствуют и сопутствующие, но отличающиеся разным уровнем активности. Например, при одном и том же уровне ЦлА в препаратах Целлюлазы содержание КсА (6200-8800 ед./г), β-ГлА (6500-11000 ед./г) и эндо-ПгА (600-1215 ед./г) существенно отличается. Аналогичная тенденция отмечена и в препаратах Ксиланазы по уровню ЦлА (24-1600 ед./г), β-ГлА (1650-13000 ед./г) и эндо-ПгА (220-1162 ед./г). Исследования ферментного комплекса препаратов Поликанесцина (разные партии) показало, что, помимо основной активности в них - эндополигалактуроназы, отмечено наличие α-галактозидазы (72-160 ед./г), незначительное содержание β-глюканазы, протеазы, ксиланазы и высокий уровень β-галактозидазы (920-3000 ед./г).

Таблица 2
Характеристика ферментных препаратов
Препарат	Активность ферментов, ед./г
ЦлА (бумага хрома-тогр.)	КсА (ксилан)	β-ГлА (β-глюкан)	β-ГалА (паранитро-фенил - β-Д-галакто-пиранозид)	α-ГалА (паранитро-фенил- α-Д-галакто-пиранозид)	эндо-ПгА (пектин свеклович-ный)	ПС, рН субстрата (казеинат натрия)
5,5	7,2
1. Целлюлаза	1860	7500	9350	0	0	1215	0	0
2. Целлюлаза	1850	8715	8000	0	0	1035	0	0
3. Целлюлаза	1800	7100	6500	0	0	964	0	0
4. Целлюлаза	1800	8800	8400	0	0	1085	0	0
5. Целлюлаза	1800	6200	11000	0	0	600	0	0
6. Ксиланаза	205	5250	4100	0	0	312	0	0
7. Ксиланаза	24	3000	1800	0	0	220	0	0
8. Ксиланаза	180	4900	1650	0	0	259	0	0
9. Ксилозим	720	10000	9200	0	0	1162	0	0
10. Ксилозим	1600	15000	13000	0	0	1007	0	0
11. Поликанесцин	0	670	312	1100	90	1200	15,3	7,0
12. Поликанесцин	0	480	600	3000	160	1200	7,2	4,3
13. Поликанесцин	0	700	500	1000	120	1200	6,7	3,8
14. Поликанесцин	0	655	550	1200	125	1060	2,8	1,1
15. Поликанесцин	0	520	620	920	100	1200	8,3	4,9
16. Поликанесцин	0	545	275	2500	160	1240	5,4	4,7
17. Поликанесцин	0	720	343	1900	145	1300	4,4	3,2
18. Поликанесцин	0	635	248	2310	119	1320	4,9	4,3
19. Поликанесцин	0	590	415	1840	100	1254	6,9	5,7
20. Поликанесцин	0	490	580	1670	72	1210	5,3	3,9

Пример осуществления изобретения

Для создания МЭК, в первую очередь, были проведены исследования по определению уровня активностей α-галактозидазы (α-ГалА) и эндополигалактуроназы (эндо-ПгА), необходимых для разрушения негативных факторов белкового сырья. С этой целью были проведены модельные опыты по ферментативной обработке шротов с использованием высокоочищенных ферментов α-ГалА и эндо-ПгА на фоне наличия в реакционной среде очищенной целлюлазы из расчета - ЦлА=750 ед./г при незначительном содержании ксиланазы. Введение целлюлазы необходимо для разрушения целлюлозосодержащих компонентов и повышения доступности неусвояемых олигосахаридов и пектиновых соединений сырья для воздействия соответствующих ферментов. Оценивали действие α-галактозидазы (α-ГалА) при уровне активностей от 70 до 150 ед., эндополигалактуроназы (эндо-ПгА) - 800-1300 ед./г. Критериями отбора оптимальных величин активностей этих ферментов служили показатели образующихся олигосахаридов и растворимой фракции пектина. Установлено, что при уровне α-ГалА в пределах 70-110 ед./г, наблюдается наибольшее разрушение олигосахаридов (28-32 %), а выход растворимой фракции пектина, при величине эндо-ПгА в пределах 900-1100 ед./г, увеличивается на 15-20%, по сравнению с контролем (целлюлаза). Дальнейшее повышение уровня α-ГалА (от 110 ед.) и эндо-ПгА (от 1100 ед.) не обеспечивало адекватного воздействия ферментов на изучаемые субстраты.

С целью определения допустимых пределов уровня активностей целлюлазы и ксиланазы для введения в состав заявляемой композиции были изготовлены экспериментальные образцы МЭК с установленными значениями α-ГалА и эндо-ПгА и проведена серия опытов по ферментолизу соевого и подсолнечного шротов (таблицы 3-6). Результаты ферментолиза оценивали по уровню углеводов [41].

Таблица 3
Данные по содержанию фракций углеводов шрота соевого, после ферментативной обработки, в зависимости от уровня целлюлазы
Варианты	Ферментативная активность, ед./г	Содержание углеводов шрота соевого, %
ЦлА	α-ГалА	эндо-ПгА	восстанавливающие сахара	пектин растворимый	крахмал	Гемицеллюло-зы	целлюлоза
Контроль-шрот соевый	-	-	-	0,79	1,66	1,96	5,76	4,06
МЭК	150	90	1000	1,20	2,60	1,90	5,40	3,80
"-"	300	90	1000	1,54	2,70	1,90	4,95	3,62
"-"	450	90	1000	1,49	2,75	1,89	4,90	3,60
"-"	600	90	1000	1,56	2,80	1,89	4,85	3,60
"-"	750	90	1000	1,56	2,75	1,91	4,85	3,64
"-"	900	90	1000	1,56	2,80	1,91	4,85	3,65

Таблица 4
Данные по содержанию фракций углеводов шрота соевого, после ферментативной обработки, в зависимости от уровня ксиланазы
Варианты	Ферментативная активность, ед./г	Содержание углеводов шрота соевого, %
КсА	α-ГалА	эндо-ПгА	восстанавливающие сахара	пектин растворимый	крахмал	Гемицеллюло-зы	целлюлоза
Контроль-шрот соевый	-	-	-	0,79	1,66	1,96	5,76	4,06
МЭК	750	90	1000	1,38	2,38	1,90	5,30	3,75
"-"	1500	90	1000	1,56	2,54	1,88	4,62	3,44
"-"	2250	90	1000	1,53	2,59	1,90	4,61	3,42
"-"	3000	90	1000	1,52	2,63	1,83	4,60	3,41
"-"	3750	90	1000	1,53	2,64	1,87	4,59	3,40
"-"	4500	90	1000	1,50	2,65	1,88	4,58	3,40

Таблица 5
Данные по содержанию фракций углеводов шрота подсолнечного, после ферментативной обработки, в зависимости от уровня целлюлазы
Варианты	Ферментативная активность, ед./г	Содержание углеводов шрота подсолнечного, %
ЦлА	α-ГалА	эндо-ПгА	восстанавливаю-щие сахара	пектин растворимый	крахмал	гемицеллю-лозы	целлюлоза
Контроль-шрот подсолн.	-	-	-	1,21	1,33	2,06	6,44	6,88
МЭК	150	90	1000	1,62	1,60	1,93	5,65	6,00
"-"	300	90	1000	1,81	2,02	1,90	5,90	5,50
"-"	450	90	1000	1,80	2,11	1,89	4,95	5,47
"-"	600	90	1000	1,82	2,13	1,90	4,90	5,45
"-"	750	90	1000	1,83	2,14	1,88	4,87	5,45
"-"	900	90	1000	1,80	2,14	1,87	4,85	5,34

Таблица 6
Данные по содержанию фракций углеводов шрота подсолнечного, после ферментативной обработки, в зависимости от уровня ксиланазы
Варианты	Ферментативная активность, ед./г	Содержание углеводов шрота подсолнечного, %
КсА	α-ГалА	эндо-ПгА	восстанавливаю-щие сахара	пектин растворимый	крахмал	гемицеллю-лозы	целлюлоза
Контроль-шрот подсолн.	-	-	-	1,21	1,33	2,06	6,44	6,88
МЭК	750	90	1000	1,63	1,70	2,00	5,31	5,90
"-"	1500	90	1000	1,91	2,20	1,98	4,58	5,29
"-"	2250	90	1000	1,97	2,20	1,94	4,51	5,24
"-"	3000	90	1000	1,99	2,18	1,95	4,50	5,28
"-"	3750	90	1000	2,10	2,20	1,94	4,52	5,26
"-"	4500	90	1000	2,10	2,00	1,93	4,52	5,18

Из анализа представленных данных следует, что, с учетом образующихся углеводов, допустимым пределом уровня целлюлазы (таблицы 3-4) в МЭК является диапазон ЦлА от 300 до 750 ед./г, а ксиланазы - от 1500 до 3750 ед./г, как для ферментолиза соевого, так и подсолнечного шротов. Снижение уровня ЦлА ниже 300 ед./г недостаточно эффективно, а повышение этой величины свыше 750 ед./г не выявило адекватного изменения содержания углеводов. Аналогичная тенденция отмечена и в тех вариантах с ксиланазой, в которых КсА ниже 1500 и выше 3750 ед./г (таблицы 5-6).

С учетом данных, представленных в таблице 2, и полученных результатов (таблицы 3-6) отобраны препараты, содержащие высокий уровень ферментов, необходимых для осуществления поставленной задачи, из которых были изготовлены опытные образцы мультиэнзимных композиций (МЭК) шести вариантов (по 50 г каждый) с разными соотношениями контролируемых ферментов в мультисистемах (таблица 7).

Таблица 7
Характеристика образцов мультиэнзимной композиции (МЭК) по соотношению активностей ферментов
№	Вариант	Ферментативная активность, ед./г	Соотношения контролируемых ферментов
ЦлА	α-ГалА	эндо-ПгА	КсА	эндо-ПгА:КсА:ЦлА	α-ГалА:КсА:ЦлА
Ближайший аналог - Оллзайм Вегпро	Комплекс ферментов целлюлазы и ксиланазы	-	-
1	МЭК-1	150	90	1000	750	1:0,75:0,15	1:8,30:1,70
2	МЭК-2	300	90	1000	1500	1:1,50:0,30	1:17,00:3,50
3	МЭК-3	450	90	1000	2250	1:2,25:0,45	1:25,00:5,00
4	МЭК-4	600	90	1000	3000	1:3,00:0,60	1:33,40:6,70
5	МЭК-5	750	90	1000	3750	1:3,75:0,75	1:42,00:8,50
6	МЭК-6	900	90	1000	4500	1:4,50:0,90	1:50,00:10,00

Для оценки эффективности мультиэнзимных композиций были проведены исследования процессов ферментолиза полисахаридов белкового растительного сырья (на двух моделях - шрот соевый и шрот подсолнечный) по сравнению с ближайшим аналогом. О действии МЭК судили по изменению в реакционной среде количества восстанавливающих сахаров, водорастворимого пектина, гемицеллюлоз, целлюлозы, а также крахмала [41]. Кроме того, исследовали эффективность МЭК по действию на олигосахариды и ингибиторы трипсина, о чем судили по изменению уровня содержащихся в белковом сырье основных α-галактозидов и ингибиторов трипсина, а также по проявлению активности трипсина с использованием синтетического субстрата α-бензоил - аргинин-пара-нитроанилида [42-43].

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1. Воздействие МЭК на содержание фракций углеводов соевого шрота в зависимости от соотношения ферментов (таблица 8).

Из анализа данных таблицы 8 следует, что ферментативная обработка сырья комплексом ферментов во всех опытных вариантах способствует интенсификации процессов разрушения углеводов соевого шрота по сравнению с контролем. Наилучшие результаты по образованию восстанавливающих сахаров, растворимого пектина, уменьшению содержания гемицеллюлоз и целлюлозы получены в вариантах МЭК 2-5. Так, сахара увеличиваются с 0,79% в контроле до 1,86-1,92% в опытных вариантах, растворимый пектин - с 1,66% до 3,83-4,0%, снижается уровень гемицеллюлоз и целлюлозы с 5,76-4,06% в контроле до 4,40-4,44 и 2,31-2,44% соответственно. Как видно из таблицы 8, эффективность действия ближайшего аналога на углеводы шрота значительно уступает опытным варианта